郎洪彥，劉曉輝，張鵬舉，王偉霞，劉海燕，譚成成，李信濤

（吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧科學(xué)分院，公主嶺 136100）

隨著牛、羊體外受精和胚胎移植技術(shù)在生產(chǎn)應(yīng)用中的快速發(fā)展，以及體細(xì)胞核移植和轉(zhuǎn)基因等胚胎工程技術(shù)的深入開展，如何穩(wěn)定獲得高質(zhì)量的成熟卵母細(xì)胞已經(jīng)成為該領(lǐng)域中的一個(gè)極其重要的問題。卵母細(xì)胞雖然可以通過超數(shù)排卵、活體采卵等方式獲得，但其成本高昂，無法廣泛開展。因此，目前廣泛被采用的方法主要是通過收集屠宰場廢棄的卵巢來獲得體外成熟的卵母細(xì)胞［1］。在某些特定的條件下，卵巢的收集和運(yùn)輸往往需要較長的時(shí)間，同時(shí)屠宰時(shí)間大多數(shù)都在夜間進(jìn)行，給后續(xù)的工作帶來許多不便。如果能夠建立良好的卵巢保存體系，使其在一定時(shí)間內(nèi)的儲(chǔ)存不對(duì)卵母細(xì)胞的體外成熟和成熟后的發(fā)育能力造成不利影響，就會(huì)為相應(yīng)的研究工作和生產(chǎn)應(yīng)用帶來極大的便利。

目前，屠體卵巢都是保存在含少量抗生素的生理鹽水中，但保存溫度、保存時(shí)間尚不統(tǒng)一，保存溫度從20～39℃都有報(bào)道［2-4］。有研究表明，牛卵巢在 37～39℃和 4℃保存5～8 h，卵母細(xì)胞的成熟及發(fā)育能力就會(huì)降低，而將卵巢在20～25℃保存8 h，并沒有影響卵母細(xì)胞的成熟及發(fā)育能力。本試驗(yàn)探討了在相同保存溫度（15～20℃）下，延長屠體羊卵巢保存時(shí)間對(duì)卵母細(xì)胞體外成熟和體外受精的影響，為體外受精等胚胎工程技術(shù)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

本試驗(yàn)TCM-199購自Gibco公司，F(xiàn)SH、LH購自寧波激素制品廠；其他試劑若無特殊說明，均購自Sigma公司。

1.1 羊屠體卵巢的采集

羊卵巢從當(dāng)?shù)赝涝讏霾杉?，保存在含青、鏈霉素的生理鹽水中，2～3 h內(nèi)送至實(shí)驗(yàn)室，用含青、鏈霉素的生理鹽水沖洗卵巢3～5次，保存在15～20℃的生理鹽水中，保存時(shí)間從運(yùn)至實(shí)驗(yàn)室放入生理鹽水中開始計(jì)時(shí)。

1.2 卵母細(xì)胞的采集

用連有12G針頭的10 mL注射器抽取卵巢表面上直徑2～5 mm卵泡中的卵母細(xì)胞，吸卵前在注射器中預(yù)先抽入1 mL吸卵液，置于50 mL離心管中，37℃水浴靜止10 min，待卵母細(xì)胞沉降后，棄上清，用PVA-TLHEPES溶液清洗3次，體視顯微鏡下挑選胞質(zhì)均勻、顆粒細(xì)胞2層以上的卵丘-卵母細(xì)胞復(fù)合體（COCs），計(jì)數(shù)后用于體外成熟培養(yǎng)（IVM）。

1.3 卵母細(xì)胞的體外成熟（IVM）

將COCs用體外成熟培養(yǎng)液（IVM液）洗3～5次，然后將15～20枚COCs移入50 μL成熟培養(yǎng)滴中，成熟培養(yǎng)24～27 h，用于體外受精（IVF），成熟液滴使用前需在CO2培養(yǎng)箱中平衡2 h以上。培養(yǎng)條件為5%CO2、95%空氣、38.5℃、飽和濕度。

IVM 液：TCM199-HCO3+10%FBS+10 μg/mL FSH+10 μg/mL LH+1 μg/mL estradiol+100 IU/mL Antibiotic。

1.4 體外受精（IVF）

將成熟的卵母細(xì)胞（COCs）置于0.05%透明質(zhì)酸酶液中反復(fù)吹打沖洗，除去部分卵丘細(xì)胞，保留2～3層卵丘細(xì)胞，用受精液（IVF液）清洗3次，將15～20枚成熟卵母細(xì)胞放入預(yù)先平衡好的50 μL受精滴中。將液氮中保存的羊細(xì)管凍精于39℃水溫迅速解凍，緩緩注入含1 mL受精液的離心管底部，斜45°放置于38.5℃培養(yǎng)箱中孵育30 min，吸取上部精液移入1.5 mL離心管中，1 350 r/min離心4 min，棄上清，調(diào)整精子密度為2×106個(gè)/mL用于體外受精（IVF）。

IVF液：SOF+20%（或2%）FBS+5 IU Heparin。

1.5 胚胎體外培養(yǎng)（IVC）

精卵共孵育24 h，去除顆粒細(xì)胞和附著的精子，受精卵用胚胎培養(yǎng)液清洗3次，mSOF培養(yǎng)體系［5］。將受精卵移入500 μL培養(yǎng)液的四孔板中，每48 h換1/3培養(yǎng)液，培養(yǎng)條件為 5%CO2、5%O2、90%N2、38.5℃、飽和濕度。48 h統(tǒng)計(jì)卵裂率，6～8 d統(tǒng)計(jì)囊胚率。

1.6 數(shù)據(jù)分析

每組試驗(yàn)重復(fù)3次，試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用student t檢驗(yàn)進(jìn)行分析處理。

2 結(jié)果與分析

由表1可見，在相同保存溫度15～20℃下，延長卵巢保存時(shí)間至6 h和12 h，卵母細(xì)胞的成熟率、卵裂率及囊胚率沒有受到影響，保存18 h卵母細(xì)胞的成熟率、卵裂率及囊胚率雖有所降低，但差異不顯著（P＞0.05），仍可繼續(xù)發(fā)育。由此得知，過夜保存6～18 h的羊屠體卵巢其卵母細(xì)胞的成熟率、體外受精后卵裂率及囊胚率與對(duì)照組相比均無顯著差異（P＞0.05）。

表1 卵巢保存時(shí)間對(duì)卵母細(xì)胞發(fā)育能力的影響

3 討論

理論上，屠宰場收集的卵巢應(yīng)立即采集并回收卵母細(xì)胞效果最佳。實(shí)際上，由于屠宰場規(guī)模參差不齊并與實(shí)驗(yàn)室均有一定的距離，所以對(duì)卵巢運(yùn)輸過程中的保存、溫度及時(shí)間就有一定的要求。其中，生理鹽水的溫度是相對(duì)可以控制的因素，但保存的溫度及時(shí)間還存在很大差異。Gordon［6］認(rèn)為，動(dòng)物屠宰后，卵巢應(yīng)置于 30～37℃無菌生理鹽水中盡快送至實(shí)驗(yàn)室即可。Moor等［7］也認(rèn)為，溫度低于30℃，卵母細(xì)胞發(fā)育就會(huì)降低。而王建辰等［8］認(rèn)為，溫度過高會(huì)使卵母細(xì)胞成熟加快，產(chǎn)生大量無法排出的有害物質(zhì)，影響卵母細(xì)胞的成熟及進(jìn)一步發(fā)育。李青春等［9］也研究發(fā)現(xiàn)，卵巢溫度升高會(huì)導(dǎo)致卵母細(xì)胞新陳代謝加快。Lee等［10］認(rèn)為，低溫保存會(huì)導(dǎo)致卵母細(xì)胞內(nèi)部微結(jié)構(gòu)的輕度損傷，但可以明顯降低卵母細(xì)胞的代謝反應(yīng)，適當(dāng)?shù)亟档蜏囟瓤梢詼p少有害物質(zhì)代謝，防止發(fā)育基因和蛋白質(zhì)降解。Yang等［11］對(duì)牛卵巢保存溫度、時(shí)間對(duì)卵母細(xì)胞及體外受精效果的影響進(jìn)行了研究，結(jié)果表明，卵巢在37℃和4℃保存4 h后，卵母細(xì)胞卵裂率和囊胚率均顯著降低（P＜0.05），而在20～25℃保存8～11 h，則不會(huì)影響卵母細(xì)胞的成熟率、受精后卵裂率及囊胚率。譚世儉［12］的研究也表明，牛卵巢保存溫度≥27℃或≤14℃，也會(huì)導(dǎo)致卵母細(xì)胞成熟率及卵裂率降低，在適當(dāng)?shù)臏囟缺４?4 h后，則不會(huì)影響其發(fā)育能力。

本試驗(yàn)研究了在相同保存溫度（15～20℃）下，延長屠體羊卵巢保存時(shí)間對(duì)卵母細(xì)胞體外成熟及體外受精的影響。結(jié)果表明，在15～20℃下，延長卵巢保存時(shí)間，不影響羊卵母細(xì)胞繼續(xù)發(fā)育。

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