高 昇 ，楊宇澤 ，馬 倩 ，樊 杰

（1.甘肅農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院，蘭州 730070；2.北京市畜牧總站，北京 100101）

奶牛乳房炎是奶牛養(yǎng)殖業(yè)中最常見而且危害最為嚴重的三大疾病之一，也是對乳品加工業(yè)危害最大的疾病。奶牛乳房炎多發(fā)生于產(chǎn)后期，其中最主要的因素是病原微生物感染［1］。臨床實驗研究已發(fā)現(xiàn)，糞腸球菌（Enterococcus faecalis）、屎腸球菌（Enterococcus faecium）等環(huán)境致病菌在奶牛乳房炎發(fā)生中作用明顯［2］。

esp（Enterococcus surface protein，esp）是編碼糞腸球菌表面蛋白的基因，GenBank序列號為AF034779，全長5 791 bp。esp結構獨特，核心區(qū)域由多個堿基序列重復組合而成，其所編碼的表面蛋白是腸球菌眾多致病因素之一，其在腸球菌對宿主細胞的黏附定植和逃避宿主免疫清除方面起到一定作用［3］。腸球菌表面蛋白是腸球菌表面分子量最大的一種蛋白質，屬于黏附素的一種，與腸球菌在內(nèi)置導管表面形成生物膜有關，在腸球菌感染時有利于延長致病菌在感染動物體內(nèi)的停留時間，但本身并不損傷宿主細胞［4］，腸球菌表面蛋白因核心氨基酸重復次數(shù)不同而大小不一，在感染初期大分子腸球菌表面蛋白有利于腸球菌對宿主細胞的黏附，定植完成后，小分子腸球菌表面蛋白有利于腸球菌逃避宿主免疫系統(tǒng)的清除作用［5］。

傳統(tǒng)的抗生素治療常常因為耐藥性而療效不佳，同時造成嚴重的乳中抗生素殘留而危害人類健康。因此，近些年來人們開始研究和開發(fā)有效的免疫制劑來防制乳房炎。研究表明，牛源糞腸球菌（Bovine Enterococcus faecalis）溶血素基因（cylA）、表面蛋白基因（esp）、膠原蛋白黏附素基因（ace）、心內(nèi)膜炎有關抗原基因（efaA）等在奶牛乳房炎的發(fā)展過程中具有重要作用，被認為是疫苗發(fā)展的良好靶位點［6-7］。由于esp較大，很難在體外完全表達，筆者等通過基因克隆得到esp的部分CDS，并將esp與載體相連接構建原核表達載體，并分析esp及其編碼蛋白的信息，為奶牛乳房炎的防治提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與質粒 牛源糞腸球菌、質粒pBluescriptⅡKS（+）、克隆菌株E.coli DH5α和表達菌株E.coli BL21為甘肅農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院保藏。

1.1.2 培養(yǎng)基 培養(yǎng)大腸埃希氏菌DH5α、BL21的培養(yǎng)基為LB培養(yǎng)基，2×YT培養(yǎng)基用于重組菌的誘導。

1.1.3 主要試劑 限制性內(nèi)切酶BamHⅠ、XhoⅠ購自TaKaRa公司；pfu酶和T4 DNA Ligase購于Thermo fisher公司；鎳柱購自GE公司；異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（Isopropyl-β-D-1-thiogalactopyranoside，IPTG）、卡那霉素購自北京全式金生物技術有限公司；質粒DNA小提試劑盒、膠回收試劑盒購自于天根生化科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 引物設計 參照GenBank中糞腸球菌esp序列（序列號AF034779）設計引物，并送金唯智科技有限公司合成。引物序列如下：

F：5'-CCGCTCGAG AAATCGTTTCTCCAGGTTTTGA-3'（下劃線為XhoⅠ酶切位點）；R：5'-CGGGATCCTTGAGGTTTATTCGGTGCTTTT-3'（下劃線為BamHⅠ酶切位點）。

1.2.2 細菌培養(yǎng) 糞腸球菌在LB培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)，收集菌體后采用CTAB法提取基因組DNA。

1.2.3 esp基因擴增 以糞腸球菌基因組為模板應用pfu酶進行擴增。反應條件：94℃預變性8 min，94℃30 s，48℃ 30 s，72 ℃ 3 min，共 35 個循環(huán)；72℃再延伸 10 min；PCR產(chǎn)物進行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測并用瓊脂糖凝膠純化回收試劑盒純化，將回收后PCR產(chǎn)物和用BamHⅠ、XhoⅠ雙酶切過的pBluescriptⅡKS（+）質粒通過T4 DNA Ligase進行連接，轉化至DH5α感受態(tài)細胞，提取質粒，經(jīng)PCR和質粒雙酶切鑒定，篩選陽性克隆命名為pBluescriptⅡKS::esp。

1.2.4 原核表達載體的構建 將測序正確的pBluescriptⅡKS::esp和pET-28a同時經(jīng)BamHⅠ和XhoⅠ酶切，酶切后的目的片段與pET-28a通過T4 DNA Ligase進行連接，并將連接產(chǎn)物轉化至DH5α接感受態(tài)細胞，陽性重組質粒命名為pET-28a::esp，并送金唯智生物科技有限公司測序。

1.2.5 重組蛋白的表達及純化 將測序正確的重組質粒pET-28::esp轉化至大腸桿菌BL21（DE3）感受態(tài)細胞中，挑取單菌落過夜培養(yǎng)后按1∶100比例轉接入100 mL 2×YT（Kan+）培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)2.5h至菌液OD值（600nm）達到0.4～0.6，加入終濃度為1 mmol/L的IPTG，在26℃誘導表達12 h，7 000 r/min離心10 min，收集菌體，PBS洗滌2次后超聲波破碎30 min（40%，工作5 s，間歇5 s），7 000 r/min離心10 min。收集上清，用GE公司的Ni-NTA柱進行蛋白純化，以誘導前的重組菌株為對照進行SDS-PAGE電泳，分析重組蛋白表達情況。

1.2.6 esp序列及其編碼蛋白序列的生物信息學分析選取esp序列，利用在線軟件Prot-Param（http：//www.expasy.org/tools）分析該基因序列編碼氨基酸序列組成與理化性質；應用軟件ProtScale（http：//www.espasy.org/cgi-bin/protscale.pl）分析其氨基酸殘基疏水性；應用軟件 TMHMM Server v.2.0（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM）預測跨膜區(qū)；應用軟件NetPhos 2.0 Serve（http：//www.cbs，dtu.dk/services/NetPhos/）預測磷酸化位點；利用軟件 NetNGlyc 1.0（http：//www.cbs.dtu.dk/Services/NetNGlyc/）和 NetOGlyc 3.1 Serve（http：//www.cbs.dtu.dk/services/NetOGlyc/）預測糖基化位點；利用軟件SignalP3.0（http：//www.Cbs.dtu.dk/services/SignalP-3.0/）預測蛋白信號肽；利用軟件PORTER（http：//distill.ucd.ie/porter）預測蛋白質二級結構；利用EMBOSS中的antigenic（http：//emboss.bioinfo-rmatics.nl/cgi-bin/emboss/anigenic）及在線軟件SYFPEITHI和ProPred預測抗原表位。

2 結果與分析

2.1 esp基因的克隆和表達載體的構建

通過PCR方法克隆得到了糞腸球菌的部分esp，將得到的部分esp連接到pET-28a，轉化大腸桿菌DH5α，構建的重組質粒pET-28a::esp經(jīng)BamHⅠ和XhoⅠ酶切驗證無誤后轉化到大腸桿菌BL21，PCR結果和質粒雙酶切驗證圖譜表明成功構建了表達載體（圖1）。最后對重組質粒pET-28a::esp進行測序，測序結果表明，選取的部分esp大小為3 795 bp，所得esp序列與GenBank登錄號（AF034779）序列比對同源性為68%。

圖1 目的基因的PCR擴增產(chǎn)物及重組質粒雙酶切

2.2 esp誘導表達及SDS-PAGE電泳

pET-28a::esp重組菌株經(jīng)IPTG誘導，超聲破碎后進行純化，得到esp，進行SDS-PAGE電泳檢測。SDSPAGE分析表明，誘導前無特異條帶，誘導后出現(xiàn)特異條帶，純化后在110 ku附近出現(xiàn)單一條帶。詳見圖2。

圖2 表達產(chǎn)物的SDS-PAGE分析

2.3 esp序列及其編碼蛋白序列的生物信息學分析

2.3.1 esp序列及編碼蛋白序列的分子特征 通過DNAMAN和在線軟件EXPASY分析得到選取的部分esp，長度為 3 795 bp，其中 A 堿基 1 475個（38.87%）、T堿基 816個（21.50%）、G 堿基 844個（22.24%）、C堿基660個（17.39%），G+C占39.63%，A+T占60.37%。esp編碼1 207個氨基酸，蛋白分子質量約110 ku，等電點為9.67，總共包括19 799個原子，分子式為C6132H10027N1741O1848S51。在組成esp蛋白的20種氨基酸中，谷氨酸（Glu）所占比例最高，達到11.4%，而胱氨酸（Cys）所占的比例最低，為0.7%。

2.3.2 esp編碼蛋白質的疏水性分析 蛋白質的疏水性在其三級結構的形成和穩(wěn)定中起重要作用。利用軟件ProtScale對esp編碼氨基酸殘基進行疏水性分析，結果表明，其疏水性最大值為3.500，最小值為-3.267，脂肪系數(shù)為82.34，總平均親水性為-0.713，不穩(wěn)定指數(shù)為43.99，表明為親水蛋白。潛在的親水區(qū)為8～54、71～79、92～114、186～350、361～502、515～536、581～611、623～813、819～836、843～977、983～1 113、1 119～1 192、1 200～1 203位氨基酸，其中623～813位氨基酸親水性強。疏水區(qū)分別位于 1～7、55～70、80～91、115～185、351～360、503～514、537～580、612～622、814～818、837～842、978～982、1 114～1 118、1 193～1 199 位氨基酸，其中 55～70位氨基酸疏水性最強。

2.3.3 esp基因編碼蛋白跨膜區(qū)、信號肽、糖基化位點、磷酸化位點的預測 經(jīng)預測，esp蛋白的跨膜結構可能存在區(qū)域為1～200位氨基酸，不存在信號肽，有6個肽糖基化位點分別位于 504、749、759、823、905、987。細胞內(nèi)參與磷酸化的氨基酸殘基主要有Thr、Tyr、Ser。預測結果發(fā)現(xiàn)，當潛在磷酸位點閾值取0.5時，esp蛋白潛在的磷酸位點有108個（52個Thr位點，分別位于45、117、347、646、849、950、999、1 109 等位氨基酸；44 個Ser位 點 ，分 別 位 于 57、158、200、440、540、654、756、1 196等位氨基酸；12個Tyr位點，分別位于803、861、942、1 049等位氨基酸）。

2.3.4 esp基因編碼蛋白二級結構預測 應用Predict Protein工具分析及PORTER軟件預測esp的二級結構，發(fā)現(xiàn)esp二級結構以α－螺旋、無規(guī)則卷曲和β－折疊為主，屬于混合型蛋白（圖3）。同時對esp在表皮葡萄球菌、屎腸球菌中編碼蛋白二級結構氨基酸殘基進行比較發(fā)現(xiàn)，esp在糞腸球菌中的無規(guī)則卷曲和β-折疊比在表皮葡萄球菌略多一些（表1）。應用SWISS-M ODEL/SWISS-PdbView等工具，按照同源建模法構建出esp基因在表皮葡萄球菌、屎腸球菌中所編碼蛋白的三級結構具有較大的不同（圖4）。

圖3 esp基因編碼二級結構的預測

表1 esp在屎腸球菌、表皮葡萄球菌所編碼蛋白的二級結構比較

2.3.5 esp的抗原表位分析 經(jīng)過EMBOSS中的antigenic網(wǎng)站在線預測esp的B淋巴細胞抗原表位。預測結果如圖5所示，esp的B淋巴細胞抗原表位分別位于1～32、62～72、78～114、144～154、162～196、226～236、242～316、324～332、336～398、402～410、418～424 位氨基酸。

分別用SYFPEITHI和ProPred對esp編碼的T淋巴細胞抗原表位進行預測分析。其中應用SYFPEITHI分析時，一般認為，得分在前2%的多肽成為抗原肽的可能性超過80%，esp有1 207個氨基酸，所以得分取靠前的24個抗原多肽作為優(yōu)勢抗原（表2）。ProPred預測結果見表3。結果顯示，VLMQTLVLL、LILLTLLIV和LTLLIVRKV在兩種軟件中預測結果均在前24位氨基酸，所以確定 VLMQTLVLL、LILLTLLIV和 LTLLIVRKV為esp的最佳MCHⅠ類分子抗原表位。

圖4 esp編碼蛋白三級結構預測

圖5 esp編碼蛋白B淋巴細胞的抗原表位預測

表2 esp編碼蛋白T淋巴細胞的抗原表位預測（SYFPEITHI軟件）

表3 esp編碼蛋白T淋巴細胞的抗原表位預測（ProPred軟件）

3 討論

腸球菌表面蛋白是分子量最大的一種腸球菌表面蛋白質，屬于黏附素。研究表明，esp位于腸球菌致病島的基因簇里，是腸球菌主要的毒力因子之一，主要與腸球菌對宿主細胞的定值、黏附、產(chǎn)生生物被膜及宿主免疫清除逃逸有關。esp基因結構獨特，核心區(qū)域由多個堿基序列重復組合而成，也被稱為A重復，A重復的3＇端是相鄰的2個B重復序列，B重復序列緊接著是8個C重復序列，第8個C重復序列位與其他的C重復序列的前30個核苷酸相同。C末端的156-殘基編碼序列可編碼一個跨膜形疏水區(qū)及一個有較小變異的LPXTGX基因序列［8］。研究表明，成熟的esp存在特殊的重復結構，串聯(lián)重復片段構成核心區(qū)，并且擁有大量高度保守的重復片段［9］。本研究通過生物信息學對部分esp編碼蛋白的基本理化性質進行了分析，結果顯示選取的部分esp長度為3 795 bp，編碼1 207個氨基酸，其中谷氨酸（Glu）所占比例最高，達到11.4%，而胱氨酸（Cys）所占的比例最低，為0.7%。esp為酸性親水性蛋白，有利于后續(xù)的異源性表達，其跨膜結構可能存在區(qū)域為1～200位氨基酸，說明該蛋白可能是表面結構蛋白，不存在信號肽，說明esp為非分泌蛋白。

蛋白質二級結構不僅是一級結構和三級結構之間的樞紐，也是預測三級結構的關鍵點，經(jīng)過預測esp蛋白二級結構以α－螺旋、無規(guī)則卷曲和β－折疊為主，屬于混合型蛋白［10］，通常，轉角和無規(guī)則卷曲區(qū)域決定蛋白的功能，可能與抗原表位有關［11］。較多的α-螺旋的氨基酸殘基的存在有利于蛋白質結構的穩(wěn)定，β-折疊中存在脯氨酸，增加了蛋白質的剛性，無規(guī)則卷曲氨基酸殘基的存在位點則與形成抗原表位有關［12］。轉角及無規(guī)則卷曲等二級結構比較松散，易于扭曲、盤旋并展示在蛋白表面，因此，該區(qū)域常含B細胞優(yōu)勢抗原表位［13］。本研究結果表明，esp抗原指數(shù)較高，具有親水性，esp抗原表位應該是優(yōu)勢抗原表位所在。

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