岳辰張雪溫陽(yáng)陽(yáng)劉又文**康鵬德

（1.河南省洛陽(yáng)正骨醫(yī)院河南省骨科醫(yī)院髖部損傷治療中心，河南洛陽(yáng)471000；

2.河南省洛陽(yáng)正骨醫(yī)院河南省骨科醫(yī)院風(fēng)濕科，河南洛陽(yáng)471000；

3.河南中醫(yī)藥大學(xué)洛陽(yáng)研究生培養(yǎng)工作部，河南洛陽(yáng)471000；4.四川大學(xué)華西醫(yī)院骨科，成都610041；）

股骨頭壞死（osteonecrosis of femoral head,ONFH）是骨科常見的難治性疾病之一。中國(guó)是ONFH的高發(fā)國(guó)家，其病因主要包括創(chuàng)傷、糖皮質(zhì)激素應(yīng)用、酗酒等[1]。其中長(zhǎng)期大劑量或短期超大劑量應(yīng)用糖皮質(zhì)激素是ONFH最常見的誘因之一[2,3]，以上述方法應(yīng)用糖皮質(zhì)激素患者的激素性股骨頭壞死（steroid-induced osteonecrosis of femoral head,SONFH）的發(fā)生率甚至可超過(guò)40%[4]。

近年來(lái)大量研究指出，SONFH的發(fā)生與骨代謝紊亂密切相關(guān)，在超生理劑量糖皮質(zhì)激素作用下，股骨頭內(nèi)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（bone marrow mesenchymal stem cells,BMSC）成脂分化增加，成骨分化減少、骨修復(fù)能力減弱，從而進(jìn)一步導(dǎo)致股骨頭內(nèi)壓力增高，骨修復(fù)停滯，最終導(dǎo)致ONFH[5-9]，而這一病理生理過(guò)程的發(fā)生、發(fā)展可能與經(jīng)典Wnt信號(hào)通路的失調(diào)有緊密聯(lián)系[7-9]。

Wnt信號(hào)通路是存在于自然界多種生物中的一條高度保守的信號(hào)傳導(dǎo)途徑，與細(xì)胞增殖、分化，胚胎發(fā)育等多種生理過(guò)程密切相關(guān)。Wnt通路可分為經(jīng)典的Wnt/β-catenin信號(hào)通路與非經(jīng)典通路，而Wnt/β-catenin信號(hào)通路與骨代謝密切相關(guān)，各種原因?qū)е碌腤nt/β-catenin信號(hào)通路失調(diào)可能是導(dǎo)致骨質(zhì)疏松、骨壞死等多種骨科疾病的重要原因之一[10-12]。

BMSC是存在于成體骨髓中的多能干細(xì)胞，正常生理?xiàng)l件下，BMSC按一定比例進(jìn)行成骨與成脂分化，在維持骨代謝的動(dòng)態(tài)平衡中起著極為重要的作用[13]。Wnt/β-catenin信號(hào)通路的激活和傳導(dǎo)是促進(jìn)BMSC向成骨細(xì)胞分化、增殖，抑制成脂分化，調(diào)節(jié)骨代謝平衡的關(guān)鍵[10-12]。正常生理情況下，Wnt/β-catenin信號(hào)通路處于激活狀態(tài)，促進(jìn)BMSC成骨分化，并抑制其成脂分化。其生理過(guò)程可簡(jiǎn)單概括為Wnt糖蛋白與其受體卷曲蛋白特異性結(jié)合形成受體復(fù)合體，進(jìn)入細(xì)胞并使胞質(zhì)內(nèi)的糖原合成激酶3β失活，抑制βcatenin的磷酸化和降解，從而進(jìn)一步激活成骨相關(guān)基因Runx-2轉(zhuǎn)錄，促進(jìn)BMSC成骨細(xì)胞分化，同時(shí)抑制成脂相關(guān)基因PPAR-γ轉(zhuǎn)錄而抑制BMSC成脂分化和成熟[14,15]。而胞外蛋白Dickkopf-1（DKK-1）對(duì)Wnt/β-catenin信號(hào)通路的正常激活起負(fù)向調(diào)節(jié)作用[16-18]，是經(jīng)典Wnt信號(hào)通路的抑制劑。DKK-1通過(guò)作用于包膜Wnt相關(guān)糖蛋白，阻抑其與卷曲蛋白相結(jié)合形成復(fù)合體，從而抑制正常Wnt信號(hào)通路的傳導(dǎo)和激活，抑制其生物調(diào)節(jié)功能。近年來(lái)的研究證實(shí)，超生理劑量激素性可能通過(guò)激活DKK-1過(guò)表達(dá)而抑制經(jīng)典Wnt信號(hào)通路的表達(dá)，導(dǎo)致BMSC異常分化，從而引起ONFH[16-18]。

因此，本實(shí)驗(yàn)選擇Wnt/β-catenin信號(hào)通路，以DKK-1基因作為靶點(diǎn)，通過(guò)RNA干擾技術(shù)，利用慢病毒作為載體，將DKK-1 siRNA導(dǎo)入激素誘導(dǎo)下的BMSC進(jìn)行長(zhǎng)效的基因沉默，研究特異性抑制DKK-1過(guò)表達(dá)對(duì)超生理劑量糖皮質(zhì)激素作用下Wnt/βcatenin通路的調(diào)控作用及對(duì)BMSC分化的影響，探索SONFH的發(fā)病機(jī)制，并為研究SONFH防治的新途徑、新方法提供有效數(shù)據(jù)。

1 資料與方法

1.1 大鼠BMSC樣本來(lái)源

本實(shí)驗(yàn)所提取的BMSC均由SD大鼠長(zhǎng)骨骨髓中獲得。SPF級(jí)SD大鼠乳鼠由達(dá)碩生物科技有限公司提供，1周齡，雌雄不限，體重20～30 g。

1.2 主要試劑

成骨誘導(dǎo)液（美國(guó)GIBCO公司提供），成脂誘導(dǎo)液（美國(guó)GIBCO公司提供），倉(cāng)鼠抗大鼠CD29單克隆抗體（美國(guó)BD公司提供），小鼠抗大鼠CD44單克隆抗體（美國(guó)BD公司提供），小鼠抗大鼠CD90單克隆抗體（美國(guó)BD公司提供），人抗大鼠CD34單克隆抗體（美國(guó)Santa Cruz公司提供），小鼠抗大鼠CD45單克隆抗體（美國(guó)BD公司提供），DKK-1基因慢病毒干擾載體及病毒感染增強(qiáng)液polybrene（上海吉?jiǎng)P公司提供），RNA引物（中國(guó)擎科生物公司提供），地塞米松（美國(guó)Sigma公司提供），兔抗大鼠RUNX2單克隆抗體（美國(guó)CST公司提供），山羊抗大鼠PPARγ-2多克隆抗體（美國(guó)Santa Cruz公司提供），兔抗大鼠GSK-3β單克隆抗體（美國(guó)CST公司提供），兔抗大鼠β-catenin單克隆抗體（美國(guó)CST公司提供），兔抗大鼠DKK-1多克隆抗體（美國(guó)CST公司提供），兔抗大鼠GAPDH單克隆抗體（美國(guó)CST公司提供）。

本實(shí)驗(yàn)DKK-1基因慢病毒干擾載體購(gòu)自上海吉?jiǎng)P基因化學(xué)技術(shù)有限公司，采用3質(zhì)粒系統(tǒng)包裝病毒。而本實(shí)驗(yàn)?zāi)康男蛄型ㄟ^(guò)Genebank查找：通過(guò)Pubmed miRNAbase檢索大鼠DKK-1全長(zhǎng)cDNA序列（NM_001106350），通過(guò)Invitrogen軟件設(shè)計(jì)目的序列GTACAAATCTGCCTGGCTT，同時(shí)設(shè)計(jì)一條無(wú)序序列TTCTCCGAACGTGTCACGT用于對(duì)照組實(shí)驗(yàn)，通過(guò)BLAST比對(duì)驗(yàn)證該序列對(duì)其他基因序列的靶向性無(wú)干擾效果。

各基因序列見表1。PCR反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5 min，94℃變性30 s，54℃退火30 s，72℃延伸40 s，最后一個(gè)循環(huán)72℃延伸8 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)15 g/L瓊脂糖凝膠電泳后，以UVP凝膠密度掃描儀對(duì)各基因特異性擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳條帶進(jìn)行密度掃描，用Labwork 3.0軟件分析電泳條帶密度值。

表 1 各基因序列

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

將大鼠處死后取其雙側(cè)股骨及脛骨，取含骨髓液離心（1300 rpm，5 min），用含10%FBS的DMEM低糖培養(yǎng)基培養(yǎng)（37℃，5%CO2），首次換液時(shí)間為48 h，之后每48 h換液1次，細(xì)胞貼壁達(dá)到80%以上后按1:3傳代。取第3代細(xì)胞倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，并成骨及成脂分化誘導(dǎo)，流式細(xì)胞學(xué)進(jìn)行CD29、CD44、CD90、CD34、CD45表型鑒定。取第3代BMSC，分為對(duì)照組（A組）、激素組（B組）、激素+無(wú)序序列慢病毒載體組（C組）及激素+DKK-1慢病毒載體組（D組）進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。C、D組進(jìn)行慢病毒載體轉(zhuǎn)染，前期預(yù)實(shí)驗(yàn)已確定慢病毒載體轉(zhuǎn)染最佳濃度為感染復(fù)數(shù)（multiplicity of infection,MOI）=25，A、B組常規(guī)更換培養(yǎng)基。轉(zhuǎn)染96 h后，吸去各組培養(yǎng)基，A組更換基礎(chǔ)培養(yǎng)基，B、C、D組加入含1×10-6mol/L地塞米松的培養(yǎng)基。以后每48 h全量換液，A組仍更換基礎(chǔ)培養(yǎng)基，B、C、D組更換含上述濃度地塞米松的培養(yǎng)基。每日觀察，待細(xì)胞達(dá)到80%融合時(shí)進(jìn)行傳代培養(yǎng)。培養(yǎng)14 d后，提取各組細(xì)胞RNA及蛋白，對(duì)DKK-1、PPAR-γ2和RUNX2進(jìn)行Real-time PCR檢測(cè)及Western-blot檢測(cè)，并對(duì)各組進(jìn)行油紅O、茜素紅染色，觀察各組BMSC分化情況。實(shí)驗(yàn)簡(jiǎn)要流程見圖1。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SSPS 20.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，兩組間數(shù)據(jù)結(jié)果比較采用t檢驗(yàn)，兩組以上組間比較采用單因素方差分析；P＜0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié)果

2.1 BMSC的鑒定結(jié)果

2.1.1 形態(tài)學(xué)鑒定：原代細(xì)胞培養(yǎng)并傳至第3代已純化，幾乎所有細(xì)胞呈長(zhǎng)梭形，并隨細(xì)胞量的增加逐漸由長(zhǎng)梭形變?yōu)槎趟笮危?xì)胞整體呈波浪形，貼滿瓶底（圖2）。

2.1.2 成骨及成脂分化誘導(dǎo)染色鑒定：對(duì)第3代BMSC進(jìn)行成骨分化誘導(dǎo)14 d，茜素紅染色陽(yáng)性，倒置相差顯微鏡下觀察可見散在分布的橘紅色團(tuán)塊沉積（圖3）。對(duì)第3代BMSC進(jìn)行成脂分化誘導(dǎo)21 d，油紅O染色陽(yáng)性，倒置相差顯微鏡下觀察可見大量紅染圓形脂滴（圖4）。

2.1.3 流式細(xì)胞學(xué)表型鑒定：流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞表型顯示所提取細(xì)胞CD29、CD44、CD90表達(dá)率分別為100%、100%、99.9%，CD34、CD45表達(dá)率分別為0.4%及0.5%。

2.2 MOI=25時(shí)DKK- 1慢病毒載體的轉(zhuǎn)染效率

MOI=25時(shí)，螢光顯微鏡下可見大量熒光轉(zhuǎn)染區(qū)（圖5），流式細(xì)胞儀檢測(cè)DKK-1慢病毒載體的轉(zhuǎn)染效率已超過(guò)90%（圖6）。

圖1 簡(jiǎn)要流程圖

圖2 第三代BMSC已純化，幾乎所有細(xì)胞呈長(zhǎng)梭形（40×）

圖3 第三代BMSC成骨誘導(dǎo)14 d，可見散在分布的橘紅色團(tuán)塊沉積，茜素紅染色（+）（100×）

圖4 第三代BMSC成脂誘導(dǎo)21 d，可見大量紅染圓形脂滴，油紅O染色（+）（100×）

2.3 不同組間DKK- 1、PPAR- γ 2及RUNX 2基因的表達(dá)

2.3.1 DKK-1：B、C組與A、D組相比，DKK-1表達(dá)顯著增高（P＜0.05，圖7）。B組DKK-1的RNA相對(duì)表達(dá)量是A組的3.8倍，而D組的RNA相對(duì)表達(dá)量也明顯低于B組（P=0.014，圖7）。

2.3.2 成脂相關(guān)基因PPAR-γ2：B、C組與A、D組相比，成脂相關(guān)基因PPAR-γ2表達(dá)明顯升高，（P＜0.05，圖8）。B組PPAR-γ2的RNA相對(duì)表達(dá)量是A組的1.98倍，而D組PPAR-γ2的RNA相對(duì)表達(dá)量明顯低于B組，但與A組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.262，圖8）。

2.3.3 成骨相關(guān)基因RUNX2：B、C組與A、D組相比，成骨相關(guān)基因RUNX2表達(dá)顯著降低（P＜0.05，圖9）。B組RUNX2的RNA相對(duì)表達(dá)量是A組的45%（P=0.000，圖9）,而D組RUNX2的相對(duì)表達(dá)量明顯高于B組，但與A組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.169，圖9）。

2.4 不同組間Wnt通路相關(guān)蛋白的表達(dá)

2.4.1 DKK-1：B、C組與A、D組相比，DKK-1蛋白表達(dá)顯著增高（P＜0.05，圖10）。B組DKK-1的相對(duì)表達(dá)量是A組的1.7倍,而D組DKK-1蛋白的表達(dá)也明顯低于B組（P＜0.05，圖10）。

2.4.2 成脂相關(guān)基因PPAR-γ2：B、C組與A、D組相比，成脂相關(guān)基因PPAR-γ2蛋白表達(dá)明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，圖11）。B組PPAR-γ2的相對(duì)表達(dá)量是A組的2.1倍，而D組PPAR-γ2的相對(duì)表達(dá)量明顯低于B組（P＜0.05，圖11）。

圖5 MOI=25，熒光顯微鏡下可見大量熒光轉(zhuǎn)染區(qū)（100×）

圖6 MOI=25，DKK-1慢病毒載體的轉(zhuǎn)染效率為90.93%

圖7 各組間DKK-1的RNA相對(duì)表達(dá)量

圖8 各組間PPAR-γ2的RNA相對(duì)表達(dá)量

圖9 各組間RUNX2的RNA相對(duì)表達(dá)量

2.4.3 成骨相關(guān)基因RUNX2：B、C組與A、D組相比，成骨相關(guān)基因RUNX2蛋白表達(dá)量顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，圖12）。B組RUNX2的相對(duì)表達(dá)量?jī)H為A組的66%，而D組RUNX2的相對(duì)表達(dá)量明顯高于B組，但與A組相比差異無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05，圖12）。

2.5 不同組間的細(xì)胞分化

各組的BMSC培養(yǎng)至14 d后進(jìn)行油紅O及茜素紅染色，倒置相差顯微鏡觀察各組BMSC分化情況。結(jié)果顯示B組及C油紅O染色陽(yáng)性、茜素紅染色陰性。A組及D組油紅O染色陰性、茜素紅染色陽(yáng)性（圖13、14）。

3 討論

SONFH的發(fā)病機(jī)制尚不完全清楚，目前主要的假說(shuō)包括骨內(nèi)高壓學(xué)說(shuō)、凝血機(jī)制改變學(xué)說(shuō)、骨質(zhì)疏松學(xué)說(shuō)、骨細(xì)胞凋亡學(xué)說(shuō)等[19-21]，雖各有一些臨床和實(shí)驗(yàn)研究依據(jù)，但均不能完全解釋SONFH的全部病理過(guò)程。其中，股骨頭內(nèi)骨代謝紊亂，骨細(xì)胞活性的改變是上述多種學(xué)說(shuō)的中間作用環(huán)節(jié)，因此越來(lái)越多的學(xué)者逐漸重視ONFH過(guò)程中骨代謝及骨細(xì)胞活性的變化，并認(rèn)為BMSC脂肪變及成骨分化障礙使髓腔的壓力增高、骨修復(fù)能力降低，這可能在ONFH的發(fā)生過(guò)程中起關(guān)鍵作用，而超生理劑量糖皮質(zhì)激素引起的BMSC異常分化是這一過(guò)程的始動(dòng)環(huán)節(jié)[20,21]。

目前研究認(rèn)為Wnt/β-catenin信號(hào)通路是調(diào)節(jié)BMSC正常分化的關(guān)鍵信號(hào)通路，超生理劑量激素能夠通過(guò)上調(diào)Wnt/β-catenin信號(hào)通路拮抗因子DKK-1的表達(dá)阻抑Wnt/β-catenin信號(hào)通路的激活，介導(dǎo)PPAR-γ2高表達(dá)和Runx2低表達(dá)，從而導(dǎo)致BMSC成脂分化增加、成骨分化減少，最終形成骨髓腔內(nèi)脂肪細(xì)胞多于成骨細(xì)胞，股骨頭髓腔壓力增加，股骨頭發(fā)生壞死[14-18]。

圖10 各組間DKK-1蛋白表達(dá)（內(nèi)參GAPDH）

圖11 各組間PPAR-γ2蛋白表達(dá)（內(nèi)參GAPDH）

圖12 各組間RUNX2蛋白表達(dá)（內(nèi)參GAPDH）

圖13 各組油紅O染色結(jié)果（陽(yáng)性為圓形紅染區(qū)，代表BMSC成脂分化）

圖14 各組茜素紅染色結(jié)果（陽(yáng)性結(jié)果為紅色局部區(qū)域，代表鈣結(jié)節(jié)形成，BMSC成骨分化）

胞外蛋白DKK-1對(duì)Wnt/β-catenin信號(hào)通路的正常激活起負(fù)向調(diào)節(jié)作用，是經(jīng)典Wnt信號(hào)通路的抑制劑，通過(guò)對(duì)DKK-1的抑制，理論上可以同時(shí)調(diào)控PPAR-γ2和Runx2的表達(dá)，從而調(diào)控BMSC的異常分化[14,15]。DKK-1蛋白屬于Dickkopf家族，作為一種分泌型胞外蛋白，DKK-1可與細(xì)胞膜表面的Wnt/βcatenin受體LRP5/6和DKK-1共受體Kremen1或Kremen2結(jié)合，形成內(nèi)吞小體，減少細(xì)胞膜表面的LRP5/6的數(shù)量，抑制Wnt/β-catenin信號(hào)通路的激活[17]。有研究表明，DKK-1的異常表達(dá)會(huì)造成骨質(zhì)疏松，而通過(guò)藥物或基因技術(shù)特異性抑制DKK-1的表達(dá)可能會(huì)起到治療目的[22]。使用DKK-1的中和抗體可以增加多發(fā)性骨髓瘤腫瘤細(xì)胞的小鼠骨組織中成骨細(xì)胞的數(shù)量，而利用基因技術(shù)敲除或沉默DKK-1基因可以促進(jìn)成骨細(xì)胞的增殖、分化，增加骨量[23]。因此，以DKK-1作為靶點(diǎn)調(diào)節(jié)Wnt信號(hào)通路，對(duì)于以骨量減少為特點(diǎn)的骨科疾病，可能是一種有效的治療方法。對(duì)于超生理劑量激素引起的BMSC分化異常，以往的研究多以PPAR-γ2或Runx2基因?yàn)榘悬c(diǎn)，雖然得到了較好的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，但若能以一種同時(shí)調(diào)控PPAR-γ2和Runx2的基因?yàn)榘悬c(diǎn)，可能對(duì)于重新調(diào)控超生理劑量激素引起的BMSC異常分化是一種新的思路。

因此，基于以往研究的基礎(chǔ)進(jìn)行了本實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示超生理劑量激素可通過(guò)致DKK-1過(guò)表達(dá)而抑制Wnt/β-catenin信號(hào)通路的正常激活，進(jìn)而上調(diào)成脂相關(guān)基因PPAR-γ2的表達(dá)、同時(shí)下調(diào)成骨基因RUNX2的表達(dá)，誘導(dǎo)BMSC向脂肪細(xì)胞方向分化，并抑制其成骨分化。DKK-1基因慢病毒干擾載體可以通過(guò)基因沉默，特異性抑制DKK-1過(guò)表達(dá)而重新激活Wnt/β-catenin信號(hào)通路，有效減少成脂相關(guān)基因PPAR-γ2的表達(dá)、增加成骨基因RUNX2的表達(dá)。染色結(jié)果顯示，通過(guò)DKK-1基因沉默，成功抑制BMSC成脂分化，促進(jìn)BMSC分化成為有生物活性的成骨細(xì)胞，為早期SONFH的治療提供了新的思路。

由于Wnt/β-catenin信號(hào)通路在生物體內(nèi)廣泛存在，而DKK-1的高表達(dá)也不完全是有害的，盲目抑制DKK-1表達(dá)可能會(huì)對(duì)機(jī)體內(nèi)其他臟器、組織產(chǎn)生影響，所以進(jìn)行相應(yīng)的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)以驗(yàn)證其有效性及安全性是利用DKK-1基因治療SONFH的下一步研究方向，也是本實(shí)驗(yàn)的最大不足。相信本實(shí)驗(yàn)結(jié)果能為下一步的研究提供可靠的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

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