謝 昆， 蔣成硯， 劉 杰， 李橋善， 周文樹， 唐秀華， 汪 鏡

(1.紅河學院生命科學與技術學院，云南蒙自 661199； 2.云南省高校農作物優(yōu)質高效栽培與安全控制重點實驗室，云南蒙自 661199)

奶牛乳房炎是困擾牛奶業(yè)經(jīng)濟效益及迅速發(fā)展的重要原因之一，不僅嚴重影響患病牛的產乳量、乳的品質、延長產后發(fā)情和妊娠的時間，易在牛群中傳播流行，對奶牛業(yè)的危害極大，而且危及人類健康[1]。奶牛乳房炎根據(jù)臨床表現(xiàn)可分為臨床型和隱性型2種，其中隱性乳房炎(subclinic mastitis)乳汁無肉眼可見變化，臨床癥狀不明顯，診斷困難，療效較差，造成奶品質量下降，最終危及人類健康[2]。

奶牛乳房炎是奶牛乳腺受到物理、化學、微生物等因素刺激所引起的奶牛乳房的炎癥，表現(xiàn)為乳汁發(fā)生理化性質及細胞學性質的變化、乳腺組織發(fā)生病理學變化[3]。志賀氏菌大多存在腸道中，由于飼養(yǎng)員的不衛(wèi)生操作或飼養(yǎng)管理水平較低，擠奶員的素質不高出現(xiàn)不能正確使用擠奶器或對擠奶系統(tǒng)沒有進行很好的保養(yǎng)等問題導致志賀氏菌的感染。志賀氏菌從損傷的生殖道進入血液或淋巴而引起感染，多感染舍飼牛，嚴重的可引起乳房壞疽，志賀氏菌性乳房炎多見于高產奶牛及產后泌乳高峰時期，臨床癥狀明顯，乳房腫脹、高熱，食欲廢絕，并伴有胃腸道癥狀，乳汁水樣黃色，泌乳量急劇下降，表現(xiàn)出急性發(fā)病，少數(shù)動物可死于內毒素血癥[4]。

本研究從牛奶中分離出引起乳房炎的1種病原菌，通過細菌培養(yǎng)和生理生化試驗[5]初步鑒定病原菌為志賀氏菌，利用PCR技術擴增其16S rRNA序列，并與GenBank上發(fā)布的志賀氏菌16S rRNA核苷酸序列進行同源性比較，以期為志賀氏菌導致的奶牛隱性乳房炎的分子生物學診斷提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

新鮮奶樣，采自云南省紅河州個舊市乍甸奶牛場，由紅河學院生命科學與技術學院動物免疫實驗室4 ℃保存。

1.2 培養(yǎng)基

普通肉湯培養(yǎng)基：取瓶內干粉39.6 g，加入蒸餾水或去離子水1 L，攪拌加熱煮沸至完全溶解，分裝三角瓶，121 ℃高壓滅菌15 min；冷卻至50 ℃，搖勻倒平板。在室溫可保存1 d或在冰箱里貯存數(shù)天。

1.3 細菌分離培養(yǎng)及生理生化鑒定

取新鮮奶樣200 μL接種在普通肉湯培養(yǎng)基，在37 ℃條件下無氧培養(yǎng)24 h，待菌落長出后，挑出單菌落，劃線分離，直至菌落較純化，待菌株生長良好后，仔細觀察菌落形態(tài)。挑選形態(tài)典型的單個菌落，進行革蘭氏染色，鏡檢。將分離得到的革蘭氏染色陰性的細菌做過氧化氫酶試驗。凡是革蘭氏染色為陰性、過氧化氫酶產生氣泡的細菌均暫定為葡萄球菌屬。再進一步做甲基紅試驗、各種發(fā)酵糖試驗、硝酸還原試驗、血凝固酶試驗。根據(jù)《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》來確定所屬的種。

1.4 16S rRNA的PCR擴增及測序

采用CTAB法提取經(jīng)過生理生化鑒定的細菌DNA，根據(jù)GenBank上發(fā)表的志賀細菌16S rRNA序列(GU444081.1)，設計1對特異性引物如下：P1：5′-AATGGGACGCTGGCGGC AGGCCTC-3′，P2：5′-GCGCATATGCATACGGCTACCT-3′。

以細菌DNA為模板進行PCR擴增，反應條件如下：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，49 ℃退火30 s，72 ℃延伸 2 min，35個循環(huán)；72 ℃ 延伸10 min。反應結束后取5 μL擴增產物電泳檢測。將檢測正確的PCR產物送交上海生工生物工程有限公司測序。將測序結果與GenBank上發(fā)表的志賀氏菌16S rRNA序列進行同源性比較。

2 結果與分析

2.1 分離菌的形態(tài)特征

在普通肉湯培養(yǎng)基上，菌落為圓形半透明，平板形成濕潤，表面光滑，邊緣有些不整齊，呈白色，中央有凸起的菌落(圖1)。分離菌的菌體都是圓形的，在顯微鏡下一般觀察到的是呈短小桿菌狀，革蘭氏染色陰性(圖2)。

分離菌的形態(tài)特征：菌落直徑在0.5～1.5 mm之間，凸起、圓形、光滑、半透明、白色，細菌為圓形，通常是以串狀存在，偶爾有單個，缺乏鞭毛。

2.2 分離菌特性的分析與鑒定

本試驗對牛奶中分離得到的細菌進行生理生化鑒定，由表1可知，革蘭氏染色試驗，過氧化氫試驗和甘露醇、賴氨酸脫羧酶、β-半乳糖苷酶、尿素試驗等均為陰性；甲基紅試驗、葡萄糖為陽性，根據(jù)形態(tài)特征和常規(guī)的生理生化鑒定結果，試驗分離出的細菌初步確定為志賀氏菌屬。

2.3 分離菌DNA提取結果

由圖3可知，分離菌的DNA提取結果可見分離菌DNA提取了12個樣，而3、4、5、6、7、8泳道幾個樣效果較好，可以用來做16S rRNA的擴增。

表1 分離細菌的生理生化試驗結果

注：+為陽性反應，-為陰性反應。

2.4 分離菌16S rRNA的擴增結果

由圖4可知，經(jīng)PCR擴增后得到16S rRNA片段，一共擴增了10個樣，每個條帶都很清晰，說明PCR反應體系和擴增程序都正確，其大小約為1 500 bp。

2.5 同源性比較

PCR產物送交上海生工生物工程有限公司測序后，結果表明序列大小與預期結果一致，將測序結果與GenBank上發(fā)表的志賀氏菌16S rRNA序列進行同源性比較。結果表明，PCR擴增的核苷酸序列與GenBank上發(fā)表的Shigella16S rRNA序列同源性達到99.9%(圖5)。

3 討論

志賀氏菌屬(Shigella)是人類細菌性痢疾最為常見的病原菌，通稱痢疾桿菌[6-8]。志賀氏菌是一類兼性厭氧、不產生芽孢的革蘭氏陰性桿菌[9]。志賀氏菌屬細菌桿狀或短桿狀，沒有成莢膜，無鞭毛，一般有菌毛的形態(tài)與一般腸道桿菌無明顯區(qū)別，長 2～3 μm、寬 0.5～0.7μm，對營養(yǎng)要求不高，能在普通培養(yǎng)基上生長[10]；最適生長溫度為 37 ℃，最適 pH 值為 6.4～7.8。志賀氏菌可分解葡萄糖，產酸不產氣，不分解尿素，不形成硫化氫，不能利用檸檬酸鹽或丙二酸鹽作為唯一碳源[11-12]。

志賀氏菌的分離也受到人們的關注，現(xiàn)在關于志賀氏菌的分離多數(shù)是在臨床上進行的，而在動物方面的分離應用還較少，對該細菌的分離手段越來越多[13]，由于現(xiàn)在技術的發(fā)達，在很多試驗室已經(jīng)使用全自動的微生物檢定儀、分子鑒定方法等對細菌進行分離及鑒定[14]。

隱性乳房炎是危害奶牛產業(yè)發(fā)展的重要疾病之一。造成隱性乳房炎的主要病原微生物包括來源于環(huán)境污染的大腸埃希氏菌、乳房鏈球菌、化膿性棒狀桿菌等，以及通過接觸性傳染的無乳鏈球菌、停乳鏈球菌、金黃色葡萄球菌和志賀氏菌等，但以大腸桿菌、鏈球菌和金黃色葡萄球菌為主，引起我國奶牛乳房炎的病原菌中金黃色葡萄球菌分離率達到了約40%，大腸埃希氏菌分離率約為30%，停乳鏈球菌、無乳鏈球菌及其他細菌所占比例較低[15]。對這些病原菌的鑒定主要以生理生化鑒定為主，借助于分子生物學鑒定奶樣中志賀氏菌的相關文獻還未見報道[16-17]。本研究根據(jù)GenBank中登錄的志賀氏菌16S rRNA序列，設計特異性引物，通過PCR技術從經(jīng)過生理生化鑒定的細菌DNA中擴增16S rRNA，并對PCR產物進行測序與同源性對比，結果表明分離的病原菌經(jīng)PCR鑒定為志賀氏菌， 為隱性乳房炎中志賀氏菌的分子生物學檢測奠定基礎，為隱性乳房炎中志賀氏菌的檢測提供了新的方法和參考依據(jù)，該研究具有重要的意義。

細菌的分離鑒定方法很多，可以是常規(guī)的生化鑒定，也可以是分子生化鑒定，包括DNA測定、PCR技術、血清鑒定等[18-20]。隨著分子生物學的快速發(fā)展，越來越多的人采用分子生物學鑒定方法，利用分子生物學鑒定能更快速便捷地檢測出隱性乳房炎中的病原微生物[21-23]。本試驗應用常規(guī)生化鑒定方法和分子生物學鑒定相結合，雖然該方法所需的時間較長，耗費的人力物力較多，但是最終鑒定的結果準確性和靈敏度高，是其他檢測方法無法比擬的。

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