趙彥華， 劉洪巖， 孫夢(mèng)玲， 史楊白， 薛 暉

(江蘇省淡水水產(chǎn)研究所，江蘇南京 210017)

沙塘鱧屬(Odontobutis)別稱沙烏鱧、蒲魚、土布魚、沙鱧、虎頭魚等，隸屬于鱸形目(Perciformes)虎魚亞目(Gobioidei)塘鱧科(Eleotridae)，主要分布于長江中下游、錢塘江、閩江等水系[1]；沙塘鱧多生活于湖泊、河溝的靜水區(qū)或近岸淺水區(qū)，是一類小型底棲肉食性魚類[2]。該魚因味道鮮美、營養(yǎng)豐富、肉質(zhì)細(xì)膩又少刺而廣受人們喜愛。近年來，隨著市場(chǎng)需求的不斷增長，沙塘鱧的人工養(yǎng)殖規(guī)模不斷擴(kuò)大，并且已經(jīng)在多個(gè)省市的養(yǎng)殖區(qū)開展了混養(yǎng)和套養(yǎng)；然而養(yǎng)殖規(guī)模的增大遠(yuǎn)不及市場(chǎng)需求的增長，在生產(chǎn)該魚苗種過程中，生產(chǎn)單位不注重該魚種質(zhì)資源管理，導(dǎo)致養(yǎng)殖成魚發(fā)生生長速度變慢、病害增加等種質(zhì)退化現(xiàn)象[3]。沙塘鱧種質(zhì)的退化以及養(yǎng)殖水質(zhì)的惡化導(dǎo)致了沙塘鱧抗病力的下降，尤其是細(xì)菌性疾病的大量暴發(fā)，2016年7月在江蘇南京和揚(yáng)中沙塘鱧養(yǎng)殖基地沙塘鱧暴發(fā)爛鰓癥，死亡率高達(dá)80%，給養(yǎng)殖戶造成了極大的損失。

筆者所在課題組多次趕赴發(fā)生病害的南京和揚(yáng)中養(yǎng)殖基地采集病料，從采集回的病魚的鰓部和腸道等多處組織中分離細(xì)菌經(jīng)培養(yǎng)獲得2株形態(tài)高度一致的病原菌，并對(duì)其進(jìn)行了傳統(tǒng)生理生化指標(biāo)檢測(cè)以及16S rDNA同源性分析，結(jié)果表明2株病原菌均為嗜水氣單胞菌。

1 材料與方法

1.1 材料采集

患病沙塘鱧采集于南京及揚(yáng)中等地的養(yǎng)殖基地，采集時(shí)間為2016年7—8月，體長為6～9 cm，體質(zhì)量為6～12 g；健康的沙塘鱧采集自江蘇省淡水水產(chǎn)研究所沙塘鱧繁育基地，平均體長為7 cm，平均體質(zhì)量為8 g。

1.2 病魚癥狀及解剖觀察

選取癥狀明顯的患病沙塘鱧，觀察并記錄病魚可見的體表特征，用消毒乙醇進(jìn)行體表消毒，嚴(yán)格按照實(shí)驗(yàn)室無菌操作方法，剪開其腹部，觀察其腹腔內(nèi)肝臟和腸道情況。

1.3 病原菌分離及顯微鏡鏡檢

選取典型癥狀病魚的鰓部及腸道進(jìn)行劃線接種，接種于普通瓊脂平板培養(yǎng)基，28 ℃恒溫培養(yǎng)48 h，挑取形態(tài)特征一致的病原菌進(jìn)行劃線分離純培養(yǎng)3次，隨后將分離到的病原菌接種于肉湯培養(yǎng)基4 ℃保存。將上述純培養(yǎng)后的細(xì)菌挑取單個(gè)菌落，進(jìn)行細(xì)菌涂片，干燥固定后用革蘭氏染色法進(jìn)行鏡檢，觀察細(xì)菌形態(tài)及染色特性。

1.4 溶血性試驗(yàn)

將分離到的細(xì)菌培養(yǎng)的上清液加入到微量血凝板上，然后分別加入等量不同動(dòng)物的1%紅細(xì)胞，于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱放置1 h，觀察結(jié)果。

1.5 生理生化指標(biāo)檢測(cè)

將分離純化后得到的病原菌接種于各種生化試劑，具體操作參照文獻(xiàn)[4]進(jìn)行，以微量發(fā)酵管法進(jìn)行葡萄糖產(chǎn)氣、V-P、甘露醇、水楊苷、七葉苷、硫化氫、阿拉伯糖、肌醇、蔗糖的生化試驗(yàn)；常規(guī)法分別進(jìn)行運(yùn)動(dòng)性、鳥氨酸脫羧酶試驗(yàn)。氧化酶測(cè)定用試紙法，變紅者判為陽性。

1.6 序列同源性分析

1.6.1 DNA模板的制備 挑取典型的單個(gè)菌落，稀釋至 50 μL 的去離子水中，沸水浴5 min，然后4 ℃ 12 000 r/min離心15 min，上清即為模板DNA。

1.6.2 PCR擴(kuò)增 按照廣譜細(xì)菌16S rDNA擴(kuò)增引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增引物為正向27F：5′-AGTTTGATCMT GGCTCAG-3′，反向1 492R：5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′進(jìn)行擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系(25 μL)含：2.5 μL 10×PCR緩沖液(含Mg2+)，1 μL 10 mmol/L 4×dNTP，10 μmol/L正向和反向引物各0.5 μL，0.2 μLTaqDNA聚合酶(5 U)，0.5 μL模板，加入去離子水至25.0 μL。PCR反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性 4 min；94 ℃變性15 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物由上海生工生物工程技術(shù)有限公司進(jìn)行純化和測(cè)序。

1.6.3 序列分析 測(cè)序后在GenBank數(shù)據(jù)庫中分別輸入2株病原菌測(cè)得的16S rDNA序列并進(jìn)行Blast比對(duì)。

1.7 人工感染試驗(yàn)

將健康的沙塘鱧置于水族箱暫養(yǎng)7 d，水族箱規(guī)格為 1 100 cm×500 cm×700 cm，水溫控制在28 ℃，日換水量為40%，按時(shí)投喂鮮活蝦苗并及時(shí)清理水族箱，設(shè)置4個(gè)試驗(yàn)組和1個(gè)對(duì)照組，每組6尾魚，通過試驗(yàn)“1.3”節(jié)至“1.5”節(jié)發(fā)現(xiàn)所得菌株各項(xiàng)指標(biāo)均一致，因而挑選其中1株Y-S01(從鰓部分離獲得)為代表菌株進(jìn)行試驗(yàn)，將肉湯培養(yǎng)細(xì)菌原液倒入水族箱中，用滅菌槍頭將沙塘鱧體表皮膚劃傷后，放入水族箱中，保證劃傷部位接觸到病原菌，每次換水后補(bǔ)加細(xì)菌1次；對(duì)照組沙塘鱧則采用同樣的方法將皮膚劃傷后，放入等量體積的無菌肉湯培養(yǎng)基，正常飼養(yǎng)。通過連續(xù)14 d觀察試驗(yàn)組和對(duì)照組，記錄沙塘鱧癥狀及發(fā)病時(shí)間，取發(fā)病沙塘鱧鰓部和腸道等部位進(jìn)行病原菌的分離及鑒定。

1.8 藥敏試驗(yàn)及最適藥物篩選

選取水產(chǎn)上常用抗生素，按照常規(guī)紙片進(jìn)行試驗(yàn)，培養(yǎng)溫度為28 ℃，參照文獻(xiàn)[5]的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行結(jié)果判定。依據(jù)藥敏試驗(yàn)結(jié)果，挑選出藥敏性較高的藥物對(duì)試驗(yàn)組發(fā)病魚進(jìn)行分組治療。

2 結(jié)果與分析

2.1 病魚癥狀及解剖情況

病魚表現(xiàn)出攝食量減少、游動(dòng)遲緩、常靜止不動(dòng)漂浮于水面上，體表和腸道都出現(xiàn)不同程度的出血，鰓部和頭部潰爛，肝臟呈現(xiàn)土黃色，發(fā)病后死亡率極高。

2.2 病原菌分離及顯微鏡鏡檢

從病魚鰓部及腸道采集分離得到2株細(xì)菌，分別編號(hào)為：Y-S01和Y-C01，2株細(xì)菌經(jīng)普通瓊脂培養(yǎng)后得到形態(tài)、大小及顏色高度一致的菌落，在普通瓊脂培養(yǎng)基上菌落呈現(xiàn)肉色或灰白色，形態(tài)為圓形，邊緣光滑，中央凸起。2株病原菌經(jīng)革蘭氏染色后，均呈現(xiàn)紅色，形態(tài)一致，病原菌均呈現(xiàn)兩端鈍圓的短桿狀，單個(gè)或呈對(duì)排列，顯微鏡下拍照(圖1)。

2.3 溶血性試驗(yàn)

分別選取等量的人O型、綿羊、小鼠、雞、鴨以及鯽魚紅細(xì)胞，2株細(xì)菌均能造成血細(xì)胞溶血，溶血程度見表1。

表1 溶血試驗(yàn)結(jié)果

注：“+”表示溶血程度。

2.4 生化指標(biāo)檢測(cè)

分別將2株病原菌進(jìn)行生化試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果見表2。根據(jù)生理生化反應(yīng)結(jié)果，可以初步判定分離得到的2株細(xì)菌為嗜水氣單胞菌。

表2 生化試驗(yàn)結(jié)果

注：“+”表示產(chǎn)酸，“-”表示不發(fā)酵，“(+)”表示產(chǎn)酸產(chǎn)氣。

2.5 16S rDNA序列同源性分析

從患病沙塘鱧的腸道和鰓部分離的菌株P(guān)CR結(jié)果見圖2。GenBank中同源序列檢索結(jié)果顯示，2株細(xì)菌與嗜水氣單胞菌屬的16S rDNA序列自然聚類，與2株分離菌相似度最高的8個(gè)結(jié)果均同屬于嗜水氣單胞菌屬；另根據(jù)病原菌的顯微鏡鏡檢以及生化試驗(yàn)結(jié)果，最終確定分離到的2株菌均為嗜水氣單胞菌。

2.6 人工感染

人工感染后，沙塘鱧于試驗(yàn)6 d首次出現(xiàn)死亡，死亡高峰期為感染的9 d和10 d，至14 d試驗(yàn)結(jié)束時(shí)，試驗(yàn)組死亡率分別為70%、80%、75%、75%，癥狀與采集病魚相似，對(duì)照組沙塘鱧生長正常(表3)，在病魚鰓部和腸道等處再次分離病原菌，通過柯赫氏法則驗(yàn)證。

2.7 藥敏試驗(yàn)及最適藥物篩選

選取青霉素、卡那霉素、鏈霉素、諾氟沙星、慶大霉素、氯霉素等一共6種藥敏試驗(yàn)片，分別采購自上海醫(yī)學(xué)化驗(yàn)所及北京天壇藥物生物技術(shù)開發(fā)中心，藥敏結(jié)果見表4。結(jié)果表明，抑菌效果最好的為諾氟沙星，選取諾氟沙星對(duì)人工感染發(fā)病且未死亡的病魚進(jìn)行治療，治療方法按照藥物使用說明書進(jìn)行，4個(gè)試驗(yàn)組發(fā)病的沙塘鱧投藥3 d后病魚精神轉(zhuǎn)好，7 d體表癥狀消失，進(jìn)食較活躍，可以判定諾氟沙星對(duì)此次沙塘鱧的發(fā)病有較好的治療效果。

表3 沙塘鱧人工感染結(jié)果

表4 藥敏試驗(yàn)判定標(biāo)準(zhǔn)與結(jié)果 mm

3 討論

嗜水氣單胞菌(Aeromonashydrophila)廣泛分布于池水、淤泥等自然環(huán)境中[6]，可以感染魚、鱉、鰻、牛蛙及蚌等水生動(dòng)物，也可以感染人造成敗血癥，感染水生動(dòng)物主要引起暴發(fā)性出血，局部感染導(dǎo)致爛鰓、赤皮等癥狀；嗜水氣單胞菌感染能夠引起水產(chǎn)動(dòng)物大量死亡，給水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)造成經(jīng)濟(jì)損失。目前，盡管已有針對(duì)嗜水氣單胞菌的疫苗[7]，但由于該菌存在不同血清型[8]，致使免疫保護(hù)效果差或不穩(wěn)定，因此，目前防治嗜水氣單胞菌主要采用抗菌藥物治療的方法為主。

傳統(tǒng)的細(xì)菌鑒定方法是根據(jù)細(xì)菌的生理生化特性，按照細(xì)菌鑒定手冊(cè)進(jìn)行判斷；但是傳統(tǒng)的生理生化試驗(yàn)操作繁瑣、耗時(shí)長且受主觀因素影響較大[9]。目前，最常用的鑒定方法是通過分子生物學(xué)的手段進(jìn)行鑒定[10-11]，但是目前尚有多種細(xì)菌的完整16S rDNA序列未被測(cè)定，給鑒定結(jié)果的準(zhǔn)確性帶來一定的影響，需要生化鑒定結(jié)果作為佐證[12]，同時(shí)同屬不同種間的16S rRNA基因通常具有很高的同源性，因此適用于屬及屬以上分類單位的親緣關(guān)系鑒定，對(duì)于親緣關(guān)系較近的細(xì)菌常因分辨率不夠而較難區(qū)分[13]。

本次試驗(yàn)結(jié)合傳統(tǒng)的生理生化以及現(xiàn)代的分子生物學(xué)手段的方法來鑒定細(xì)菌，獲得了較為準(zhǔn)確的試驗(yàn)結(jié)果。對(duì)分離的細(xì)菌進(jìn)行了藥敏試驗(yàn)，選擇出具有較好抗菌效果的抗菌藥-諾氟沙星，并在實(shí)驗(yàn)室條件下給藥，有著良好的治療效果，對(duì)實(shí)際生產(chǎn)有著很高的參考價(jià)值。提高養(yǎng)殖沙塘鱧的產(chǎn)量，不僅僅要注重細(xì)菌病的防治，還要注重養(yǎng)殖模式的改變，蝦、蟹池中混養(yǎng)沙塘鱧的生態(tài)養(yǎng)殖模式是當(dāng)前水產(chǎn)養(yǎng)殖中發(fā)展養(yǎng)殖生產(chǎn)、規(guī)避養(yǎng)殖風(fēng)險(xiǎn)、提高養(yǎng)殖效益的一條必由之路[14]，通過蝦、蟹和沙塘鱧混養(yǎng)，達(dá)到抗病、高產(chǎn)的目的。同時(shí)在沙塘鱧的養(yǎng)殖過程中，應(yīng)及時(shí)做好嗜水氣單胞菌病的防治工作，一旦發(fā)現(xiàn)應(yīng)及時(shí)隔離并對(duì)養(yǎng)殖塘口進(jìn)行消毒，從源頭上阻止該菌的傳播。

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