葛慧雯， 李佳佳， 王高華， 閆鑫甜， 安文靜， 杜京堯， 石 佳， 彭靜靜， 王美娜， 梁衛(wèi)紅

(河南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，河南新鄉(xiāng) 453007)

近年來，隨著農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)的發(fā)展，T-DNA插入技術(shù)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于水稻等模式植物轉(zhuǎn)基因研究[1]。但是，在轉(zhuǎn)基因植物的研究過程中發(fā)現(xiàn)外源基因在轉(zhuǎn)基因植物中并不都能實現(xiàn)預(yù)期表達，其表達的穩(wěn)定性問題有待解決[2]。已有研究報道，轉(zhuǎn)基因植物中外源基因能否在植物基因組中穩(wěn)定表達受到多種因素的影響，如外源基因自身的結(jié)構(gòu)、啟動子等[3-4]。此外，也與其插入位點的側(cè)翼序列和染色體定位有關(guān)，外源基因插入到染色體的不同位置，其表達穩(wěn)定性和表達效率可能也不同[5]。因此，鑒定外源基因的插入位點，了解其側(cè)翼序列及染色體定位對于后續(xù)的基因功能研究有重要意義。目前T-DNA插入位點側(cè)翼序列的鑒定多采用PCR擴增的方法，主要包括熱不對稱交錯PCR法(thermal asymmetric interlaced-PCR，TAIL-PCR)[6]、反向PCR(inverse PCR，I-PCR)[7]和PCR-walking法[8]3種。

前期研究發(fā)現(xiàn)水稻ROP(Rho of plant)基因OsRacD與水稻育性相關(guān)[9]，為研究其功能和作用機制，利用酵母雙雜交技術(shù)，以O(shè)sRacD為誘餌篩選水稻幼穗cDNA文庫，獲得了若干功能未知基因[10-11]，其中包括OsRhoGAP2。為了鑒定OsRhoGAP2基因的功能，本研究利用Gateway克隆技術(shù)，構(gòu)建了OsRhoGAP2的RNA干擾植物表達載體pANDA-OsRhoGAP2，對水稻進行遺傳轉(zhuǎn)化，篩選獲得陽性轉(zhuǎn)基因植株，并發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因水稻株高顯著高于對照水稻。為確定鑒定外源載體的整合位點，本研究采用改良的高效熱不對稱交錯PCR法(high-efficiency thermal asymmetric interlaced PCR，HiTAIL-PCR)對RNAi-OsRhoGAP2轉(zhuǎn)基因水稻T-DNA的側(cè)翼序列進行分析，旨在為研究RNAi-OsRhoGAP2轉(zhuǎn)基因水稻表型變化的分子基礎(chǔ)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 植物材料

本研究所用植物材料包括水稻粳稻栽培品種日本晴(OryzasativaL.)野生型(簡稱WT)和筆者所在的實驗室前期篩選獲得的T1代OsRhoGAP2干擾轉(zhuǎn)基因水稻植株(簡稱RNAi-OsRhoGAP2)，遺傳背景為日本晴。

1.2 質(zhì)粒和菌株

大腸桿菌(Escherichiacoli)DH5α、根癌農(nóng)桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)EHA105由筆者所在的實驗室保存；pAD-OsRhoGAP2來自酵母雙雜交篩選，由筆者所在的實驗室保存；pENTR/D gateway入門載體購自Invitrogen公司；RNAi干擾植物表達載體pANDA由山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院謝先芝研究員饋贈。

1.3 供試試劑

SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒購于生工生物工程(上海)股份有限公司；2×TaqMaster Mix購于北京康為世紀生物科技有限公司；2×VazymeLAmp?Master Mix購于南京諾唯贊生物科技有限公司；高保真PrimeSTAR?PrimeSTAR聚合酶、DNA Marker購于寶生物工程(大連)有限公司。

1.4 引物設(shè)計及合成

本試驗所用引物(表1)均在蘇州金唯智生物科技有限公司合成。

表1 引物序列及用途

注：V=A、C或G；N=A、C、T或G。

1.5OsRhoGAP2基因的RNA干擾載體的構(gòu)建及水稻的遺傳轉(zhuǎn)化

將OsRhoGAP2基因的cDNA序列提交NCBI(http：// www.ncbi.nlm.nih.gov/)，以Blastn進行檢索，并用DNAMAN軟件進行序列同源性比對。根據(jù)RNAi載體設(shè)計原則，選取OsRhoGAP2基因cDNA序列的3′端261 bp的特異區(qū)段作為RNA干擾片段。

根據(jù)OsRhoGAP2基因3′端的特異序列設(shè)計引物P1和P2。以pAD-OsRhoGAP2質(zhì)粒為模板，用高保真PrimeSTAR?rHS DNA聚合酶擴增OsRhoGAP2基因的RNA干擾片段。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測后，PCR產(chǎn)物參照SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒步驟回收定量后，與pENTR/D gateway入門載體連接，將載體命名為pENTR/D-OsRhoGAP2。

將pANDA空載體和pENTR/DNOsRhoGAP2按比例混勻，將pENTR-OsRhoGAP2和pANDA載體進行LR反應(yīng)后，轉(zhuǎn)到DH5α感受態(tài)細胞中，將質(zhì)粒命名為pANDA-OsRhoGAP2。

采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法[12]將pANDA-OsRhoGAP2轉(zhuǎn)化水稻愈傷，篩選陽性愈傷，誘導(dǎo)分化，獲得再生植株，2016年5月10日移植到河南師范大學(xué)生物實驗園地，鑒定后于同年10月收獲T0代種子。

1.6 水稻基因組DNA的提取

將T0代轉(zhuǎn)基因水稻種子，消毒后置于27 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d，獲得T1代轉(zhuǎn)基因水稻幼苗。取其葉片，液氮冷凍后，迅速研磨至粉末，然后以CTAB法[13]提取基因組DNA，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測質(zhì)量。

1.7 轉(zhuǎn)基因植株的PCR鑒定

按照2×TaqMaster Mix說明書配制PCR反應(yīng)體系(20 μL)：2×TaqMaster Mix(10 μL)、P3(0.8 μL)、P4(0.8 μL)、基因組DNA(0.4 μL)和無菌水(8 μL)。PCR反應(yīng)程序為：94 ℃，2 min；94 ℃、30 s，55 ℃、30 s，72 ℃、30 s，共35個循環(huán)；72 ℃延伸5 min。擴增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.8 T-DNA在水稻基因組中插入位點的鑒定

采用HiTAIL-PCR技術(shù)擴增T-DNA側(cè)翼序列，反應(yīng)體系和反應(yīng)程序見表2、表3。將第3輪反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，送至蘇州金唯智生物科技有限公司測序。

表2 HiTAIL-PCR反應(yīng)體系

1.9 序列比對和分析

采用DNAMAN軟件對測序結(jié)果進行序列分析，T-DNA在水稻基因組DNA上插入位點的分析采用Blast結(jié)合DNAMAN軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1OsRhoGAP2基因RNA干擾載體的構(gòu)建

以pAD-OsRhoGAP2質(zhì)粒為模板，用引物P1和P2進行PCR擴增OsRhoGAP2基因特異片段。電泳檢測顯示，擴增產(chǎn)物與預(yù)期的261 bp長度相符(圖1-A)，回收該擴增條帶，連入pENTR/D gateway入門載體，篩選陽性克隆，并測序確認后，將其與pANDA載體進行LR反應(yīng)，然后將反應(yīng)產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細胞，篩選轉(zhuǎn)化子，并從中提取重組載體。

采用KpnⅠ和SacⅠ雙酶切鑒定重組載體，電泳結(jié)果顯示，重組載體釋放出1條1 800 bp左右的目的條帶(圖1-B)，條帶大小與預(yù)期一致，說明OsRhoGAP2基因RNA干擾載體構(gòu)建成功(圖1-C)，進一步測序確認。

表3 HiTAIL-PCR反應(yīng)程序

2.2 RNAi-OsRhoGAP2水稻的篩選及表型分析

通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法，將pANDA-OsRhoGAP2載體轉(zhuǎn)入到水稻愈傷組織中，篩選潮霉素抗性愈傷，并進一步誘導(dǎo)分化為再生植株。提取再生水稻植株的基因組DNA，利用載體上序列設(shè)計的特異性引物P3和P4進行PCR擴增。電泳檢測顯示，所檢測的4個不同株系的轉(zhuǎn)基因植株均可以擴增出特異性片段，且片段長度與預(yù)期的638 bp大小相符(圖2)，而以水為模板的陰性對照，以及對照WT水稻中均未擴增出該條帶，表明載體已經(jīng)整合到水稻基因組中。比較轉(zhuǎn)基因水稻和對照的表型，結(jié)果顯示RNAi-OsRhoGAP2轉(zhuǎn)基因植株的株高顯著高于對照水稻(圖3)。

2.3 RNAi-OsRhoGAP2水稻T-DNA側(cè)翼序列的擴增

根據(jù)pANDA載體上的潮霉素基因設(shè)計3條特異性嵌套引物HYGR1、HYGR2和HYGR3，參考文獻[14]的方法設(shè)計3條隨機簡并引物LAD、AC1和AC2， 采用HiTAIL-PCR方法擴增左側(cè)翼序列。以提取的水稻基因組DNA為模板，用以上引物分別進行3輪擴增，取第3輪擴增產(chǎn)物，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。結(jié)果顯示，4個檢測的株系均擴增出約1 200 bp的條帶(圖4)，與預(yù)期的擴增產(chǎn)物大小相符，將這些PCR產(chǎn)物測序作進一步分析。

2.4 T-DNA在RNAi-OsRhoGAP2水稻插入位點的分析

使用DNAMAN軟件，對4個轉(zhuǎn)基因水稻株系PCR產(chǎn)物的測序結(jié)果進行比對，結(jié)果顯示序列完全相同，表明T-DNA

插入到水稻基因組的同一位置。將測序序列與水稻OsRhoGAP2基因的基因組DNA序列、pANDA載體的左邊界序列進行對比，結(jié)果顯示，測序序列與水稻OsRhoGAP2基因的基因組序列、pANDA載體的左邊界序列均有重合部分(圖5)，說明載體序列已整合到水稻基因組DNA序列中。

將測序結(jié)果經(jīng)NCBI網(wǎng)站Blast確定RNAi-OsRhoGAP2水稻T-DNA左邊界插入位點，發(fā)現(xiàn)T-DNA插入位于日本晴水稻第2號染色體克隆NC029257.1中，其左邊界插入位點位于OsRhoGAP2基因編碼區(qū)的第2 669位， 處于該基因的第5個外顯子內(nèi)(圖6)。

3 討論與結(jié)論

水稻OsRhoGAP2是通過酵母雙雜交篩選到的與水稻ROP蛋白OsRacD相互作用蛋白的編碼基因。有研究顯示，OsRacD參與水稻育性調(diào)控[9]。之前的試驗表明，OsRhoGAP2只與GTP結(jié)合的、處于激活形式的OsRacD發(fā)生結(jié)合，并可能是負調(diào)控OsRacD活性的蛋白，在OsRacD的信號調(diào)節(jié)通路中扮演重要角色，但其功能未知。前期試驗結(jié)果顯示，OsRhoGAP2在細胞分裂旺盛的幼葉、幼根、幼穗或成熟根中高表達(未發(fā)表)，說明該基因可能參與了相關(guān)組織的生長分化過程。

為了研究水稻OsRhoGAP2基因的功能，本研究構(gòu)建了OsRhoGAP2的RNA干擾轉(zhuǎn)基因水稻，并發(fā)現(xiàn)RNAi-OsRhoGAP2轉(zhuǎn)基因水稻的株高與對照水稻相比，株高差異顯著。為鑒定外源載體在轉(zhuǎn)基因水稻中的插入位點，本研究采用HiTAIL-PCR方法對RNAi-OsRhoGAP2轉(zhuǎn)基因水稻的 T-DNA 的側(cè)翼序列進行擴增和分析，以期了解株高發(fā)生顯著變化相關(guān)的分子信息，為后續(xù)利用轉(zhuǎn)基因水稻開展對OsRhoGAP2基因的功能研究奠定基礎(chǔ)。

熱不對稱交錯PCR法(TAIL-PCR)最早由Liu等報道[15]。該技術(shù)可以有效地分離T-DNA側(cè)翼序列，只須經(jīng)3次PCR特異擴增過程，大大提高了目的片段的擴增效率和特異性，成為分析植物T-DNA側(cè)翼序列的有效方法。使用TAIL-PCR方法高效地分離T-DNA的側(cè)翼序列已有報道，例如，邵彥春等采用TAIL-PCR法成功分離了紅曲霉突變株T-DNA插入位點的側(cè)翼序列，不僅豐富了絲狀真菌的生物信息學(xué)資源，也為深入研究這些序列包含的功能信息奠定了基礎(chǔ)[16]。王海燕等利用TAIL-PCR成功擴增了小麥抗葉銹病基因同源序列RGA1側(cè)翼序列，為克隆目的基因Lr35奠定了基礎(chǔ)[17]。TAIL-PCR有許多優(yōu)點：簡單快速，不需要特殊的酶切連接甚至是轉(zhuǎn)化等操作，PCR產(chǎn)物可以直接用于測序；具有高特異性和高靈敏性，設(shè)計的3條嵌套特異性引物，很好地利用了巢式PCR的原理來選擇特異性的產(chǎn)物，此外通過巧妙的控制高溫和低溫的退火次數(shù)，讓特異性產(chǎn)物占優(yōu)勢[18]。因此該技術(shù)廣泛應(yīng)用于許多生物的分子生物學(xué)研究之中[19]，包括在擬南芥和水稻中大規(guī)模檢測T-DNA和轉(zhuǎn)座子插入位點，以及分離已知序列的上游(啟動子)和下游序列[20-24]。不過，TAIL-PCR技術(shù)也有自身的缺陷：一是隨機簡并引物太多，能擴增出特異產(chǎn)物的數(shù)量有限，因此須要通過大量試驗篩選和確定；二是結(jié)果不穩(wěn)定，第3輪PCR有彌散的情況，很難得到特異性的條帶，或者得到了清楚的條帶，卻因為太短沒有測序的價值。

本試驗采用的HiTAIL-PCR是Liu等針對上述問題改進后的方法[25]，該方法結(jié)合了TAIL循環(huán)和抑制PCR的優(yōu)點，且第2輪和第3輪PCR不再使用隨機簡并引物，而是利用AC引物代替了隨機簡并引物，這樣就抑制了短的特異產(chǎn)物的擴增，有效擴增長片段靶序列。反應(yīng)的成功率高于90%，在大多數(shù)情況下獲得的主要產(chǎn)物的大小為1～3 kb。筆者利用HiTAIL-PCR技術(shù)擴增RNAi-OsRhoGAP2轉(zhuǎn)基因水稻T-DNA的側(cè)翼序列，結(jié)果顯示T-DNA插入到水稻OsRhoGAP2基因的第5個外顯子內(nèi)，推測OsRhoGAP2水稻的表型改變可能是OsRhoGAP2基因的結(jié)構(gòu)發(fā)生改變引起的。同時，也說明OsRhoGAP2基因可能與水稻的株高性狀控制相關(guān)，值得后續(xù)深入的研究。

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