朱佳慧， 徐秋芳， 袁平平， 倪海平， 周益軍， 蔣選利， 杜何為

(1.長(zhǎng)江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，湖北荊州 434025； 2.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所，江蘇南京 210014；3.貴州大學(xué)農(nóng)學(xué)院，貴州貴陽(yáng) 550025)

水稻黑條矮縮病是一種重要的水稻病毒病害，病原為水稻黑條矮縮病毒(rice black streaked dwarf virus，RBSDV)，主要通過(guò)介體灰飛虱以持久增殖型方式傳播。水稻感染RBSDV后的典型癥狀為病株矮縮、葉色濃綠、葉片僵直，莖稈、葉背和葉鞘處出現(xiàn)瘤狀突起。該病害自20世紀(jì)60年代和90年代在我國(guó)流行危害后，曾一度銷聲匿跡，2006年以來(lái)由于灰飛虱蟲(chóng)量上升和帶毒率提高，水稻黑條矮縮病在江蘇、浙江、安徽等地麥輪作區(qū)的水稻上普遍發(fā)生，2009年僅江蘇省的發(fā)病面積達(dá)3.33×105hm2，造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失[1-2]。當(dāng)前生產(chǎn)上栽培的水稻品種對(duì)黑條矮縮病的抗性較差，大部分為感病品種，尚未鑒定到高抗品種[3-4]。

水稻不同生育期對(duì)RBSDV的敏感性存在差異，3～4葉期幼苗最易感病[5]。苗期感病后，植株矮小、心葉短小而僵直，不能抽穗，嚴(yán)重的則出現(xiàn)枯死現(xiàn)象。分蘗期和抽穗期發(fā)病，出現(xiàn)包穗，部分分蘗能抽穗，但穗小或包穗，結(jié)實(shí)差[6]。水稻感染黑條矮縮病毒后細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)發(fā)生改變[7]，病毒感染后引起的矮縮癥狀可能與纖維素合成酶及類纖維素合成酶基因及木質(zhì)素相關(guān)基因表達(dá)有關(guān)[8-9]，病毒影響水稻育性可能是由于病毒的P7-1蛋白的表達(dá)抑制了花藥中木質(zhì)素合成，導(dǎo)致植株花藥開(kāi)裂異常，不能結(jié)實(shí)[9]。然而，病毒如何影響寄主植物因子進(jìn)而表現(xiàn)癥狀的機(jī)制還不是非常清楚。

酵母雙雜交系統(tǒng)是由Fields等于1989年首次提出并建立的[10]，是篩選已知蛋白互作因子的有效系統(tǒng)。為解析RBSDV與寄主水稻的互作機(jī)制，篩選水稻中與病毒互作的寄主蛋白，本研究以易感RBSDV的水稻品種日本晴為材料，取水稻敏感生育期3～4葉時(shí)的組織樣本構(gòu)建酵母雙雜交cDNA文庫(kù)，為病毒致病相關(guān)寄主因子的篩選提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

水稻品種日本晴(OryzasativaL.japonica. cv. Nipponbare)于實(shí)驗(yàn)室光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至3～4葉期，取除根外的組織樣品作為試驗(yàn)材料。試驗(yàn)取樣時(shí)間為2014年8月，地點(diǎn)為江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所。

Trizol、CloneMiner Ⅱ cDNA Library Construction Kit、LR ClonaseTMⅡ Enzyme Mix、載體pDONRTM222、pDEST22、FastTrack?MAG mRNA isolation Kit均購(gòu)自Invitrogen(USA)；載體pGADT7-DEST購(gòu)自Clontech(USA)。

1.2 方法

1.2.1 總RNA提取 用液氮研磨水稻幼苗樣品，按照0.1 g樣品加入1 mL Trizol的比例提取總RNA，具體操作方法參照Trizol試劑說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。采用Nanodrop 2000核酸分析儀檢測(cè)總RNA的質(zhì)量及濃度，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)總RNA的完整性。

1.2.2 mRNA分離純化 利用FastTrack?MAG mRNA isolation Kit分離并純化總RNA中的mRNA，具體步驟參照其說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。分離純化后的mRNA采用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)其質(zhì)量。

1.2.3 cDNA初級(jí)文庫(kù)構(gòu)建 cDNA初級(jí)文庫(kù)的構(gòu)建試驗(yàn)方法參照CloneMiner Ⅱ cDNA Library Construction Kit文庫(kù)構(gòu)建說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。取分離純化后的mRNA，加入Biotin-attB2-Oligo(dT) Primer 和SuperScript Ⅲ RT酶進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，合成cDNA第1條鏈，再以cDNA第1條鏈為模板，在大腸桿菌(Escherichiacoli) DNA Ligase、大腸桿菌DNA Polymerase Ⅰ、大腸桿菌RNase H以及T4DNA Polymerase的作用下合成cDNA第二鏈。將雙鏈cDNA與三框attB1重組接頭連接后，進(jìn)行cDNA分級(jí)分離并且收集。純化后的cDNA通過(guò)重組反應(yīng)連入pDONR222載體，反應(yīng)產(chǎn)物電轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH10B后，加入SOC培養(yǎng)基，置于37 ℃，225～250 r/min搖床培養(yǎng) 1 h。培養(yǎng)結(jié)束后，取10 μL菌液用于庫(kù)容量鑒定，剩余培養(yǎng)物加入甘油至終濃度為20%存于 -80 ℃，此即為初級(jí)文庫(kù)菌液。

1.2.4 酵母雙雜交cDNA文庫(kù)構(gòu)建 將初級(jí)文庫(kù)菌液接種至100 mL含有卡那霉素(Kan)的LB(LB/Kan)培養(yǎng)基中，采用PureLink?HiPure Plasmid Filter Midiprep Kit(Invitrogen)提取初級(jí)文庫(kù)質(zhì)粒，稀釋至300 ng/μL，在LR ClonaseTMⅡ Enzyme Mix的作用下與pGADT7-DEST(Invitrogen)載體進(jìn)行重組反應(yīng)。重組反應(yīng)體系為：1 μL文庫(kù)質(zhì)粒(300 ng/μL)、1 μL p GADT7-DEST(300 ng/μL)、4 μL LR Clonase II Mix、14 μL ddH2O，混勻后置于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中反應(yīng)16～20 h。反應(yīng)結(jié)束后電轉(zhuǎn)化DH10B感受態(tài)細(xì)胞，加入3 mL SOC培養(yǎng)基培養(yǎng)，獲得酵母雙雜交cDNA文庫(kù)菌液。取10 μL菌液鑒定庫(kù)容量，其余菌液加甘油至終濃度為20%，-80 ℃保存。

1.2.5 文庫(kù)重組率、文庫(kù)滴度和插入片段大小分析

1.2.5.1 文庫(kù)滴度分析方法 將10 μL文庫(kù)菌液稀釋1 000倍后，從中取出50 μL涂布含有相應(yīng)抗性的LB平板，過(guò)夜培養(yǎng)后計(jì)算1 mL文庫(kù)菌液中的庫(kù)容量，即文庫(kù)滴度=平板上的克隆數(shù)/平板上涂布菌液的體積(μL)×稀釋倍數(shù)×1 000 μL。

1.2.5.2 重組率和插入片段長(zhǎng)度分析 在鑒定庫(kù)容量的平板上隨機(jī)挑取24個(gè)克隆進(jìn)行菌落PCR，初級(jí)文庫(kù)的PCR引物為pDNOR222載體2端的通用引物M13正向引物(5′-GTAAAACGACGGCCAG-3′)及M13反向引物(5′-CAGGAAACAGCTATGAC-3′)。酵母cDNA文庫(kù)的PCR所用引物為pGADT7載體的通用引物T7(5′-TAATACGACTC ACTATAGGGCGAGCGCCGCCATG-3′)和3′AD(5′-GTGA ACTTGCGGGGTTTTTCAGTATCTACGATT-3′)。PCR擴(kuò)增條件為：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，58 ℃ 退火30 s，72 ℃ 延伸90 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物，分析擴(kuò)增片段大小和擴(kuò)增得到的基因片段數(shù)，計(jì)算重組率。

1.2.6 候選基因篩選水稻幼苗cDNA酵母文庫(kù) 利用RBSDV編碼的非結(jié)構(gòu)蛋白P7-1作為候選基因篩選本研究所構(gòu)建的水稻幼苗cDNA酵母文庫(kù)，以檢測(cè)cDNA文庫(kù)質(zhì)量。pGADT7-RBSDV P7-1誘餌載體由實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建保存，文庫(kù)篩選方法和步驟參照Clontech文庫(kù)篩選說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

2 結(jié)果與分析

2.1 總RNA的提取及mRNA的分離純化

采用Trizol提取水稻幼苗總RNA后測(cè)定濃度并進(jìn)行質(zhì)量分析，結(jié)果顯示，總RNA濃度為1 921.7 ng/μL，D260 nm/D280 nm=2.08(圖1)?？俁NA經(jīng)1%凝膠電泳分離可以看到3條清晰的條帶，分別為28S、18S和5S。28S亮度高于18S，且5S條帶清晰，沒(méi)有彌散，表明提取的RNA質(zhì)量完好，沒(méi)有降解(圖2-A)。

利用試劑盒FastTrack?MAG mRNA isolation Kit分離純化并獲得mRNA。電泳結(jié)果顯示純化所得的mRNA是一條彌散的條帶，條帶最亮部分的范圍在較大的分子量范圍內(nèi)(1～3 kb)(圖2-B)，表明分離純化的mRNA未發(fā)生降解，可用于cDNA文庫(kù)構(gòu)建。

2.2 cDNA初級(jí)文庫(kù)的構(gòu)建及分析

取10 μL初級(jí)文庫(kù)菌液稀釋1 000倍后，從中取出50 μL涂布LB/Kan平板，37 ℃培養(yǎng)過(guò)夜并計(jì)數(shù)平板上克隆數(shù)(圖 3-A)。根據(jù)“初級(jí)文庫(kù)滴度(CFU/mL)=平板上的克隆數(shù)/平板上涂布菌液的體積(μL)×稀釋倍數(shù)×1 000 μL，文庫(kù)容量(庫(kù)容)=CFU/mL×文庫(kù)菌液總體積(mL)”的計(jì)算公示，得初級(jí)文庫(kù)滴度為6.6×106CFU/mL，庫(kù)容為1.9×107CFU。隨機(jī)挑取24個(gè)克隆進(jìn)行菌落PCR鑒定，檢測(cè)文庫(kù)重組率和cDNA插入片段大小，根據(jù)重組率=(有插入片段的反應(yīng)個(gè)數(shù)/反應(yīng)總數(shù))×100%，計(jì)算得初級(jí)文庫(kù)重組率>95%，插入片段大小除有2個(gè)克隆大小在650～850 bp外，其余克隆插入片段大小都在1 kb以上(圖3-B)，符合初級(jí)文庫(kù)的高質(zhì)量需求。

2.3 酵母雙雜交cDNA文庫(kù)的構(gòu)建與分析

提取初級(jí)文庫(kù)質(zhì)粒后，將初級(jí)文庫(kù)質(zhì)粒與載體pGADT7-DEST進(jìn)行LR重組反應(yīng)，重組后轉(zhuǎn)化DH10B，獲得酵母雙雜交cDNA文庫(kù)。取10 μL文庫(kù)菌液稀釋1 000倍后，分別取出50 μL涂布LB/Amp(氯芐西林)平板，37 ℃培養(yǎng)過(guò)夜并計(jì)數(shù)平板上克隆數(shù)(圖4-A)。結(jié)果顯示，文庫(kù)滴度為4.5×106CFU/mL，庫(kù)容為1.3×107CFU。從文庫(kù)中隨機(jī)挑選24個(gè)克隆，用pGADT7載體的通用引物T7和3′AD進(jìn)行PCR擴(kuò)增，分析插入不同大小片段。凝膠電泳結(jié)果顯示，24個(gè)單克隆均可擴(kuò)增到1個(gè)單一的條帶，重組率>95%，其中23個(gè)克隆插入片段大小>1 kb(圖4-B)。以上結(jié)果表明，構(gòu)建的cDNA酵母文庫(kù)的庫(kù)容、重組率和插入片段大小達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)cDNA文庫(kù)要求，可用于病毒互作基因的篩選。

2.4 篩選文庫(kù)鑒定

為進(jìn)一步分析所構(gòu)建的水稻幼苗cDNA文庫(kù)是否可用于篩選互作蛋白，以RBSDV編碼的非結(jié)構(gòu)蛋白P7-1為誘餌，篩選本試驗(yàn)所構(gòu)建的cDNA文庫(kù)。將誘餌載體pGADT-P7-1轉(zhuǎn)化酵母菌AH109后，制備感受態(tài)，提取cDNA文庫(kù)質(zhì)粒后進(jìn)行轉(zhuǎn)化，涂布SD/-His/-Leu/-Trp平板，挑選生長(zhǎng)良好的酵母菌落至SD/-His/-Leu/-Trp-Ade/X-α-Gal培養(yǎng)基培養(yǎng)，可篩選獲得變藍(lán)的酵母菌落(圖5)，表明本研究所構(gòu)建的水稻日本晴幼苗cDNA文庫(kù)能用來(lái)篩選RBSDV與水稻互作的蛋白。

3 討論與結(jié)論

酵母雙雜交技術(shù)能在真核細(xì)胞狀態(tài)下檢測(cè)蛋白質(zhì)之間的互作，具有操作簡(jiǎn)便、靈敏度高等特點(diǎn)，已成為研究蛋白質(zhì)之間相互作用的有效手段。該技術(shù)可用于檢測(cè)已知蛋白質(zhì)之間的互作、建立基因組編碼蛋白間的相互作用圖譜、篩選藥物作用位點(diǎn)，還可以從cDNA文庫(kù)中以某個(gè)已知蛋白為誘餌進(jìn)行大規(guī)模篩選，尋找與已知蛋白相互作用的未知蛋白，在多個(gè)研究領(lǐng)域中均有廣泛應(yīng)用[11]。

在植物與病毒互作機(jī)制研究方面，以病毒蛋白為誘餌篩選寄主植物cDNA文庫(kù)，對(duì)于快速獲取寄主植物體內(nèi)的互作蛋白，進(jìn)而研究互作蛋白在病毒致病過(guò)程中的功能具有重要意義。以水稻矮縮病毒與水稻的互作研究為例，Zhu等以水稻矮縮病毒外殼蛋白P2為誘餌篩選cDNA文庫(kù)時(shí)發(fā)現(xiàn)，P2蛋白能夠與水稻體內(nèi)赤霉素合成途徑關(guān)鍵酶貝殼杉烯氧化酶發(fā)生互作，導(dǎo)致赤霉素合成量下降，植物出現(xiàn)矮縮癥狀[12]。P2蛋白還能與水稻中生長(zhǎng)素通路Aux/IAA家族蛋白OsIAA10相互作用，通過(guò)與OsIAA10的互作阻斷OsIAA10與OsTIR的互作，抑制26S蛋白酶體介導(dǎo)的OsIAA10降解，使OsIAA10蛋白的穩(wěn)定和積累量增多，導(dǎo)致生長(zhǎng)素通路響應(yīng)受阻，進(jìn)而有利于RDV的復(fù)制侵染[13]。此外，RDV非結(jié)構(gòu)蛋白Pns11篩選水稻cDNA文庫(kù)發(fā)現(xiàn)， Pns11能與OsSAMS1互作，增強(qiáng)OsSAMS1的活性，導(dǎo)致乙烯含量增加，進(jìn)而有利于病毒侵染[14]。此外，酵母雙雜交系統(tǒng)還用于研究植物蛋白與病毒的運(yùn)動(dòng)蛋白、病毒復(fù)制酶類蛋白等之間的互作研究。本研究以高感RBSDV的水稻品種日本晴為材料，取RBSDV最為敏感的3～4葉期組織構(gòu)建了高質(zhì)量酵母雙雜交cDNA文庫(kù)，并用RBSDV P7-1進(jìn)行篩選可獲得陽(yáng)性克隆，為研究水稻黑條矮縮病毒與水稻的互作奠定了基礎(chǔ)。

高質(zhì)量cDNA文庫(kù)是進(jìn)行有效篩選互作蛋白的基礎(chǔ)。評(píng)價(jià)cDNA文庫(kù)質(zhì)量有2個(gè)重要指標(biāo)，即cDNA文庫(kù)的代表性和重組序列的完整性[15-16]。文庫(kù)的代表性即文庫(kù)中含有的cDNA種類的完整性，可反映來(lái)源組織中表達(dá)信息(即mRNA)的完整性程度，是體現(xiàn)文庫(kù)質(zhì)量的重要指標(biāo)，可用庫(kù)容來(lái)衡量。庫(kù)容是指cDNA文庫(kù)中所包含的獨(dú)立重組子克隆數(shù)量。當(dāng)文庫(kù)滴定濃度達(dá)到1.7×105CFU/mL時(shí)，即可認(rèn)定為有效文庫(kù)，當(dāng)文庫(kù)滴定濃度達(dá)到1×106CFU/mL時(shí)，可以滿足低豐度mRNA篩選要求[17]。本研究對(duì)提取的總RNA以及分離純化的mRNA進(jìn)行了質(zhì)量評(píng)價(jià)，所提總RNA和mRNA完整性好，未發(fā)生降解，構(gòu)建的酵母cDNA文庫(kù)庫(kù)容為1.3×107CFU，滴度為4.5×106CFU/mL，表明所構(gòu)建的cDNA文庫(kù)中所含基因信息豐富，可滿足常規(guī)文庫(kù)篩選要求，可用于進(jìn)一步篩選與病毒互作相關(guān)重要基因。

重組cDNA片段序列的完整性可從重組率及插入片段長(zhǎng)度2個(gè)方面來(lái)評(píng)價(jià)。重組率反映的是文庫(kù)中所有克隆的陽(yáng)性率，即文庫(kù)中含有重組cDNA片斷克隆的比率。平均插入片斷長(zhǎng)度即將隨機(jī)的菌落PCR得到的產(chǎn)物片斷長(zhǎng)度取平均值，其體現(xiàn)了文庫(kù)中重組的cDNA片斷的序列完整性。只有重組cDNA片段足夠長(zhǎng)，才更有可能從文庫(kù)中分離獲得目的基因的完整序列。本研究構(gòu)建的文庫(kù)重組率>95%，插入片段大小各異，平均插入片段在1 000 bp以上，表明所建文庫(kù)符合高質(zhì)量文庫(kù)要求。用RBSDV的候選基因P7-1篩選所構(gòu)建的酵母cDNA文庫(kù)可以篩選到陽(yáng)性克隆，也說(shuō)明所構(gòu)建文庫(kù)可以用作病毒互作蛋白篩選。

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