吳麗芳， 魏曉梅， 尹 輝， 顏岳輝， 李 通

(1.曲靖師范學(xué)院生物資源與食品工程學(xué)院，云南曲靖 655011；2.云南省高校云貴高原動(dòng)植物多樣性及生態(tài)適應(yīng)性進(jìn)化重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南曲靖 655011)

種子是有性繁殖植物的重要繁殖器官，種子能否順利萌發(fā)及萌發(fā)初期長(zhǎng)勢(shì)直接影響到幼苗的建成、存活、競(jìng)爭(zhēng)和個(gè)體未來(lái)的適合度。而植物種子萌發(fā)、生長(zhǎng)發(fā)育有賴(lài)于細(xì)胞數(shù)目的增加和細(xì)胞體積的擴(kuò)大，細(xì)胞數(shù)目的增加主要通過(guò)細(xì)胞分裂來(lái)實(shí)現(xiàn)，如果細(xì)胞分裂周期過(guò)程中遇到不利的逆境，將直接影響到植物整個(gè)生命周期活動(dòng)，這一過(guò)程中，又以早期萌發(fā)生長(zhǎng)期最具典型和敏感性。

白刺花(Sophoradavidii)屬豆科槐屬落葉灌木，在我國(guó)主要分布在云南、四川、陜西、甘肅、山西、河北、河南、湖北、湖南、江蘇、浙江等地，具深根性、抗旱強(qiáng)等特點(diǎn)，是集藥用、食用、飼料、蜜源、水土保持、改良土壤、生態(tài)修復(fù)為一體的喀斯特山地優(yōu)良野生植物。云貴高原屬于典型的喀斯特地區(qū)，該區(qū)域石漠化現(xiàn)象日趨嚴(yán)重，且連年干旱的氣候促使生態(tài)系統(tǒng)岌岌可危。云南自2009—2012年出現(xiàn)了史無(wú)前例的旱情，且今后干旱環(huán)境將一直存在，給生態(tài)治理提出了嚴(yán)峻地考驗(yàn)，從自然界中篩選抗旱植物，用于土壤、生態(tài)退化修復(fù)已收到了事半功倍的成效。干旱脅迫將導(dǎo)致植物一系列的連鎖反應(yīng)，從對(duì)逆境的感知、傳導(dǎo)、轉(zhuǎn)錄因子控制到生理反應(yīng)和形態(tài)結(jié)構(gòu)的改變，最終影響到植物的生長(zhǎng)發(fā)育。目前已對(duì)白刺花抗旱性進(jìn)行了多方面的研究，王慧慧等研究了干旱脅迫下白刺花種子大小與種子萌發(fā)的關(guān)系[1]；邵莉研究了白刺花干旱脅迫下生理相應(yīng)機(jī)制及克隆了P5CS、DREB、DHN3個(gè)與抗旱相關(guān)的基因[2]；王海珍等研究了白刺花適應(yīng)干旱的生理機(jī)理[3]；王紅梅等研究了干旱脅迫下白刺花幼苗的生理生化變化[4]；吳福忠等通過(guò)施用外源氮研究了干旱河谷白刺花幼苗生長(zhǎng)、生物量及碳、氮、磷積累與分配的關(guān)系[5]；李芳蘭等研究了干旱脅迫下白刺花的形態(tài)和生理變化[6]。從現(xiàn)有資料來(lái)看，多數(shù)研究主要圍繞干旱環(huán)境下白刺花種子萌發(fā)、幼苗生長(zhǎng)過(guò)程的形態(tài)及生理生化變化以及在分子水平上相關(guān)抗旱基因的克隆，而對(duì)于從細(xì)胞分裂基礎(chǔ)研究干旱脅迫下的遺傳損傷少見(jiàn)報(bào)道。基于此，本試驗(yàn)在模擬干旱環(huán)境下，研究幼苗萌發(fā)過(guò)程中短期的干旱脅迫對(duì)白刺花根尖細(xì)胞染色體的分裂、結(jié)構(gòu)變化，為進(jìn)一步開(kāi)展抗逆生境的基礎(chǔ)研究提供更多的數(shù)據(jù)資料。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)材料于2014年10月在曲靖師范學(xué)院校園里采集，脫去外殼剔除有蟲(chóng)害的種子后，實(shí)驗(yàn)室自然風(fēng)干保存于4 ℃冰箱中備用。

1.2 萌發(fā)試驗(yàn)

將健康飽滿的種子用刀片劃破種皮后，用10%次氯酸鈉消毒20 min，無(wú)菌水沖洗4～6次后放入培養(yǎng)皿中發(fā)芽，發(fā)芽溫度27 ℃，黑暗培養(yǎng)。

1.3 干旱脅迫處理

待白刺花種子萌發(fā)至根尖長(zhǎng)1～2 cm時(shí)，于08：00分別用0%、10%、20%、30%、40%、50%聚乙二醇(PEG-6000)脅迫處理6、12、24、48 h，每處理脅迫50顆小苗，脅迫完成后，迅速用蒸餾水涮洗根尖并將根尖取下，4 ℃冰箱低溫預(yù)處理24 h，放到卡諾固定液中固定24 h，之后轉(zhuǎn)入70%乙醇于4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 有絲分裂染色體制片

染色體制片參照李懋學(xué)的方法[7]。將準(zhǔn)備好的材料置于0.1 mol/L HCl中，60 ℃水浴解離10～15 min直至根尖軟化，用蒸餾水漂洗3～5次后，吸水紙吸干，放在載玻片上，用刀片剔除根尖最頂端根冠后，截取少許根尖分生區(qū)，用解剖針將其搗碎并均勻地涂開(kāi)，滴1～2滴卡寶品紅染液，染色2～3 min，蓋上蓋玻片，用鉛筆輕敲并用吸水紙吸干水分，酒精燈火焰上輕輕烘烤，以利于細(xì)胞分散。

1.5 鏡檢及觀察統(tǒng)計(jì)

將制備好的裝片置于顯微鏡的載物臺(tái)上，先在低倍鏡(10×10)下找到分生組織區(qū)細(xì)胞分散均勻、分裂相較多的區(qū)域，再到高倍鏡(10×40)下觀察。每處理的根尖至少觀察10個(gè)裝片，每個(gè)裝片在高倍鏡下觀察和統(tǒng)計(jì)10個(gè)視野，記錄每個(gè)視野中觀察的總細(xì)胞數(shù)、分裂細(xì)胞數(shù)及各分裂相的比率。

1.6 干旱脅迫后觀察根尖細(xì)胞有絲分裂、微核、染色體畸變指標(biāo)

測(cè)定計(jì)算的指標(biāo)參照周錦雯的方法[8]。有絲分裂指數(shù)=處于分裂期的細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100%；有絲分裂指數(shù)下降速度=-(有絲分裂指數(shù)T-有絲分裂指數(shù)t)/有絲分裂指數(shù)t×100%；染色體畸變率=染色體畸變細(xì)胞數(shù)/分裂細(xì)胞數(shù)×100%。其中，有絲分裂指數(shù)T表示處理時(shí)的有絲分裂指數(shù)；有絲分裂指數(shù)t表示同一時(shí)間處理下對(duì)照組的有絲分裂指數(shù)。微核率(micronucleus frequency，簡(jiǎn)稱(chēng)MNF)是指1 000個(gè)細(xì)胞中微核細(xì)胞數(shù)所占的比例。

1.7 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)用Excel和DYES軟件進(jìn)行處理，單因素隨機(jī)區(qū)組試驗(yàn)進(jìn)行方差分析，LSR法檢驗(yàn)各處理間的差異顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 干旱脅迫對(duì)白刺花根尖細(xì)胞有絲分裂的影響

由表1可知，隨著PEG-6000濃度的增加和處理時(shí)間的延長(zhǎng)，白刺花根尖細(xì)胞有絲分裂表現(xiàn)出不同的差異。低濃度PEG-6000≤10%時(shí)，在處理6～12 h內(nèi)，同一時(shí)間處理下與對(duì)照差異不顯著；0～6 h短期處理下，對(duì)白刺花根尖細(xì)胞有絲分裂有一定的促進(jìn)作用，有絲分裂指數(shù)從8.78%上升至 9.09%。隨著脅迫濃度的增加，其濃度>10%后，有絲分裂細(xì)胞減少，表現(xiàn)出了一定的抑制效應(yīng)。尤其當(dāng)濃度達(dá)到50%時(shí)，脅迫6 h時(shí)的細(xì)胞分裂指數(shù)為3.14%，而當(dāng)脅迫48 h后，有絲分裂指數(shù)僅1.96%，可以非常明顯地觀察到幾乎所有細(xì)胞都已停止了分裂。結(jié)果表明，PEG-6000干旱脅迫對(duì)白刺花根尖細(xì)胞有絲分裂的影響不僅與處理時(shí)間有關(guān)，而且與處理濃度也有密切關(guān)系，是二者共同作用的結(jié)果。

注：同列數(shù)據(jù)后不同小寫(xiě)字母、大寫(xiě)字母分別表示在0.05、0.01水平上差異顯著、極顯著。表3、表4同。

植物根尖細(xì)胞分裂指數(shù)的大小反映了植物生長(zhǎng)發(fā)育的狀況，同時(shí)也反映出細(xì)胞分裂活性的高低。從表2中可以看出，隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)和處理濃度的增加，有絲分裂指數(shù)下降速率明顯在上升。當(dāng)處理時(shí)間為6 h、處理濃度10%時(shí)，有絲分裂指數(shù)下降速率為-3.53%；當(dāng)濃度增加至50%，有絲分裂指數(shù)下降速率為64.24%；當(dāng)處理時(shí)間為48 h、濃度為50%時(shí)，有絲分裂指數(shù)下降速率最大，為78.32%。從整個(gè)變化趨勢(shì)來(lái)看，細(xì)胞有絲分裂能力隨處理時(shí)間的延長(zhǎng)和濃度的升高不斷降低。

2.2 干旱脅迫對(duì)白刺花染色體畸變的影響

由表3可知，染色體畸變率高低與處理濃度和處理時(shí)間呈正相關(guān)。當(dāng)處理時(shí)間為12 h、PEG-6000濃度≤10%時(shí)，與對(duì)照處理差異顯著；當(dāng)處理時(shí)間超過(guò)12 h，各濃度處理與對(duì)照差異極顯著。當(dāng)處理濃度>30%時(shí)，白刺花根尖細(xì)胞染色體畸變率均超過(guò)10%，尤其當(dāng)濃度為50%、處理48 h時(shí)染色體畸變率高達(dá)16.05%。結(jié)果表明，染色體畸變率與處理時(shí)間、處理濃度均有關(guān)系。

表2 干旱脅迫對(duì)白刺花根尖細(xì)胞有絲分裂指數(shù)下降速率的影響

染色體畸變率往往通過(guò)多種類(lèi)型而表現(xiàn)，在本試驗(yàn)中，可以觀察到染色體斷片、落后染色體、染色體橋、多極分裂、染色體濃縮等(圖1至圖7)。通過(guò)研究觀察，染色體斷片是最常見(jiàn)的畸變類(lèi)型，染色體斷片通常是由于在理化因素的作用下1個(gè)染色體發(fā)生1處或多處斷裂而不重接且無(wú)著絲粒的節(jié)段，如果染色體丟失片段比較大，或丟失片段上載有控制性狀的主基因，將會(huì)不可逆地導(dǎo)致細(xì)胞或生物體死亡。染色體橋是染色體發(fā)生斷裂，帶有著絲粒的2條染色體再經(jīng)重接，當(dāng)2個(gè)染色單體后期向兩極分開(kāi)，二者兩臂仍粘連在一起所形成的。落后染色體的產(chǎn)生有2種，一種是細(xì)胞有絲分裂前中期，染色體不規(guī)則排列在赤道板上時(shí)，有個(gè)別染色體或染色體片斷未能按時(shí)到達(dá)赤道板的位置；另一種是細(xì)胞有絲分裂后期，正常細(xì)胞的染色體都移向兩極，而個(gè)別染色體或染色體片斷滯留于兩極之間，與染色體的主體部分移向兩極的速度和進(jìn)程不同而形成的。落后染色體經(jīng)細(xì)胞分裂，可能隨機(jī)趨向于細(xì)胞分裂的一極，也可能隨細(xì)胞的分裂而丟失。

表3 干旱脅迫對(duì)白刺花根尖細(xì)胞染色體畸變率的影響

2.3 干旱脅迫對(duì)白刺花根尖細(xì)胞微核的影響

微核也是染色體畸變的一種形式，早期微核技術(shù)主要用于水質(zhì)的檢測(cè)方面。微核位于細(xì)胞質(zhì)中，直徑是主核的1/20至1/3，是完全與主核分開(kāi)的圓形或橢圓形的小核。從表4可以看出，當(dāng)PEG-6000濃度小于20%時(shí)，微核率在10‰以下；當(dāng)PEG-6000濃度高于20%后，微核率均大于10‰，尤其當(dāng)濃度達(dá)到50%時(shí)，處理48 h的微核率最高，達(dá)15.76‰。早期研究認(rèn)為，微核僅出現(xiàn)在細(xì)胞分裂的間期，后來(lái)經(jīng)過(guò)多年研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞分裂的任何時(shí)期都能產(chǎn)生微核，且微核的大小與處理時(shí)間、處理濃度有關(guān)。本試驗(yàn)中也觀察到不同分裂時(shí)期的微核(圖8至圖11)。

表4 干旱脅迫對(duì)白刺花根尖細(xì)胞微核的影響

3 討論

PEG-6000作為一種滲透調(diào)節(jié)劑，它能模擬干旱逆境的原因是其可阻塞植物的輸導(dǎo)組織。Kaufmann等研究得出，PEG-6000誘導(dǎo)水分逆境所取得的效果與土壤干旱是一樣的，PEG-6000誘導(dǎo)下引起植物內(nèi)源激素如ABA積累，而植物根部對(duì)ABA的反應(yīng)最為敏感，從而導(dǎo)致植物生長(zhǎng)受到抑制[9]。再者干旱脅迫下植物由于脫水使膜的構(gòu)成或結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，導(dǎo)致質(zhì)膜透性增加，細(xì)胞膜系統(tǒng)遭受破壞。在對(duì)小麥[10-11]、柑橘[12]、番茄[13]等研究中發(fā)現(xiàn)干旱脅迫下植物細(xì)胞破裂、內(nèi)溶物溢出，多數(shù)葉綠體溶解散亂在基質(zhì)中，細(xì)胞保護(hù)酶系統(tǒng)發(fā)生顯著變化。在抑制植物生長(zhǎng)方面，干旱脅迫可能降低與DNA合成有關(guān)的酶活性，致使DNA的合成速率減慢，細(xì)胞分裂的間期延長(zhǎng)[14]。本研究也觀察到，白刺花根尖細(xì)胞有絲分裂指數(shù)隨著PEG-6000處理濃度升高和處理時(shí)間延長(zhǎng)明顯下降。短期(6 h)低濃度(PEG-6000濃度10%)有一個(gè)上升趨勢(shì)，這可能是植物短期內(nèi)適應(yīng)環(huán)境變化的應(yīng)激反應(yīng)，使相當(dāng)一定時(shí)期內(nèi)代謝增強(qiáng)，細(xì)胞周期加快導(dǎo)致，而當(dāng)植物自身應(yīng)激反應(yīng)超過(guò)防御保護(hù)屏障后，植物的生長(zhǎng)發(fā)育就會(huì)受到影響，甚至死亡，從而導(dǎo)致細(xì)胞分裂能力降低。

染色體畸變是植物細(xì)胞有絲分裂過(guò)程中受到理化因素的影響，DNA或蛋白質(zhì)的合成受到干擾，諸如紡錘體蛋白等與染色體運(yùn)動(dòng)有關(guān)的生物分子不能合成或合成量不足，或染色體損傷后不能及時(shí)正常修復(fù)而導(dǎo)致[15]，有染色體橋、染色體斷片、細(xì)胞多極化等畸變類(lèi)型。本研究中，PEG-6000濃度 0～20%、處理24 h內(nèi)時(shí)，白刺花根尖細(xì)胞染色體畸變率在10%以下，當(dāng)濃度大于30%時(shí)，染色體畸變率均在10%以上。本試驗(yàn)中，觀察到了染色體斷片、染色體橋、染色體多極化、染色體濃縮等多種類(lèi)型的畸變，其中染色體斷片是主要的畸變類(lèi)型。染色體濃縮可能是長(zhǎng)時(shí)干旱脅迫致使細(xì)胞合成代謝受阻，抑制微管蛋白的組裝，抑制調(diào)控細(xì)胞分裂的各種酶類(lèi)的活性，使染色體被原位抑制而縮短變粗導(dǎo)致的。如在某些熱擊研究中，細(xì)胞在熱激處理下合成熱激蛋白，而熱激也可能導(dǎo)致染色體的快速濃縮。

微核是染色體畸變的一種形式之一，可能是染色體發(fā)生斷裂或部分落后染色體在細(xì)胞分裂的后期行動(dòng)滯后，不能進(jìn)入子細(xì)胞的主核而成[16-17]。微核多出現(xiàn)于細(xì)胞分裂的間期，但在細(xì)胞分裂的前期、中期、后期均能看到，而末期微核數(shù)微乎其微。

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