李 亮,趙 新,劉 娜,尚宏麗,*,王 永,蘭青闊,柏 韻,王 寧

(1.錦州醫(yī)科大學(xué),遼寧錦州 121000;2.天津市農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測技術(shù)研究所,天津300381)

牛肉可以為人體補(bǔ)充多種元素及維生素,且葉酸含量高于普通肉類[1]。近年來,在牛肉中摻假的情況屢見不鮮。一般都是以豬肉、雞肉、鴨肉為原料,經(jīng)牛油浸泡和添加香精等方法處理后混進(jìn)牛肉再進(jìn)行售賣[2]。在牛肉中摻假降低了食品行業(yè)信譽(yù)度并干擾了肉制品的良性競爭關(guān)系[3]。

目前,已經(jīng)有許多技術(shù)被應(yīng)用于肉制品摻假檢測。冼鈺茵等[4]以具有高度保守性的線粒體細(xì)胞色素B基因?yàn)榘谢?建立了牛源性成分快速檢測的LAMP檢測方法。郭燕華等[5]應(yīng)用重組酶聚合酶等溫?cái)U(kuò)增技術(shù),建立基于重組酶介導(dǎo)的等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)檢測方法。苗麗等[6]基于數(shù)字PCR技術(shù),建立了定量檢測肉及肉制品中牛肉和豬肉含量的方法。與此同時(shí)實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)也是被廣泛應(yīng)用于動物源性成分的檢測[7],其時(shí)效性與準(zhǔn)確性方面的優(yōu)勢使得該技術(shù)已經(jīng)逐步取代了普通PCR技術(shù)和其他鑒定技術(shù)。但是熒光定量PCR技術(shù)要達(dá)到動物源性成分定量檢測的目的,必須減少樣品與標(biāo)準(zhǔn)品間的偏差。引入合適的內(nèi)參基因可以減少偏差并減少實(shí)驗(yàn)誤差,由此可達(dá)到定量檢測的目的并有效提高了方法的準(zhǔn)確性及可信性[8-9]。

本實(shí)驗(yàn)采用Taqman實(shí)時(shí)熒光PCR相對定量法,鑒別肉制品中牛源性成分,鑒于熟肉及加工制品的DNA穩(wěn)定性可能受到一定程度的破壞,根據(jù)牛肉中高度保守性的線粒體細(xì)胞色素b基因組編碼序列的差異設(shè)計(jì)熒光定量特異性PCR引物和探針,并基于線粒體DNA,篩選肉源成分共同具備的一段高度保守序列區(qū)間確定內(nèi)參基因,以期達(dá)到對肉制品中牛源性成分的定量檢測,為量化肉制品摻假研究提供借鑒并為保護(hù)消費(fèi)者權(quán)益提供有效參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

牛肉、雞肉、鴨肉、豬肉、羊肉、驢肉、鯽魚、大豆粉等 均購于天津市農(nóng)貿(mào)市場;含牛肉成分的肉制品,如手撕風(fēng)干牛肉、麻辣牛肉絲、牛肉絲、牛肉紅腸、午餐肉等 均購于天津各大型超市及農(nóng)貿(mào)市場;DNA提取主要試劑:NaOH、NaCl 天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司;Tris、EDTA、十二烷基磺酸鈉 美國sigma公司;異丙醇、乙醇 天津虔誠偉業(yè)科技發(fā)展有限公司;TE緩沖液、蛋白酶K、RNA酶 上海生工生物技術(shù)有限公司。SuperMix-UDG預(yù)混液 Invitrogen公司;引物、探針 由上海生工生物技術(shù)有限公司合成。

CFX96Touch型熒光定量PCR儀、ND-1000型核酸蛋白測定儀 美國伯樂Bio-Rad;Allegra 21R Centrifuge高速冷凍離心機(jī) 美國BECKMAN公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 引物與探針的設(shè)計(jì) 根據(jù)GenBank上牛、羊、豬、雞、鴨、馬、驢、鼠、狗等的16SrDNA基因的序列,合成通用引物。同時(shí)參考文獻(xiàn)[7]并根據(jù)GenBank中公布的牛線粒體DNA細(xì)胞色素b基因序列,運(yùn)用Primer Express 3.0軟件,設(shè)計(jì)引物和探針序列,見表1。

表1 PCR和測序引物序列

1.2.2 樣品的制備 先剔除待測的牛肉和雞肉中的結(jié)締組織和脂肪,然后將不同比例的牛肉與雞肉混合,其中牛肉的質(zhì)量百分?jǐn)?shù)為20%、40%、60%、80%、100%,以100%的牛肉所提取出的DNA作為標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。將牛肉與雞肉分別置于絞肉機(jī)中充分絞碎,在60 ℃烘干箱中烘干呈肉粉狀。

1.2.3 DNA模板的提取 參考文獻(xiàn)[10]并稍作調(diào)整。稱取100 mg樣品于2 mL無菌離心管中,加入600 μL SDS裂解液[11](10 mol/L NaOH、500 mmol/L EDTA、1 mol/L Tris·Cl、5 mol/L NaCl、10%十二烷基磺酸鈉)和20 μL蛋白酶K。65 ℃水浴消化1 h,每隔10 min混勻振蕩一次,直至澄清透明(如1 h無法使溶液透明可適當(dāng)延長水浴時(shí)間)。加入10 μL RNA酶,65 ℃消化10 min。13200 r/min離心5 min,取上清液并與0.8倍異丙醇混勻后加到吸附柱中。13200 r/min離心2 min,倒掉廢液后向吸附柱中加入500 μL乙醇[12]。13200 r/min離心2 min,倒掉廢液,重復(fù)上述步驟三次。于室溫放置,使乙醇完全揮發(fā)后將吸附柱轉(zhuǎn)移到一個(gè)新的離心管中。加入100 μL TE緩沖液,13200 r/min離心2 min,既得DNA溶液。

1.2.4 牛源性成分實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)條件的建立 PCR反應(yīng)體系為20 μL,各成分含量為:2×SuperMix-UDG預(yù)混液10 μL,探針引物0.4 μL,上下游引物各1 μL,模板2 μL(50 ng/μL)無菌超純水補(bǔ)足20 μL。循環(huán)程序?yàn)?95 ℃ 30 s,60 ℃ 45 s,72 ℃ 45 s[13],45個(gè)循環(huán)。

1.2.5 核酸溶液純度及濃度測定 將0.1 g不同肉源品種及樣品進(jìn)行DNA提取,并用100 μL的TE緩沖液溶解,在核酸蛋白測定儀中進(jìn)行核酸含量及核酸溶液純度的測定[14]。

1.2.6 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 兩條標(biāo)準(zhǔn)曲線分別以表1所示的Rd1和16S rDNA為引物,配制5個(gè)梯度濃度牛肉標(biāo)準(zhǔn)品(100、50、10、5、1)作為模版,每個(gè)梯度三個(gè)平行,根據(jù)1.2.4所述反應(yīng)條件進(jìn)行反應(yīng)。

1.2.7 方法特異性研究 利用本方法對羊肉、豬肉、鴨肉、雞肉、驢肉、鯽魚、大豆粉的DNA進(jìn)行檢測,以已知牛肉DNA作為陽性對照,去離子水作為陰性對照[15]。

1.2.8 方法靈敏度研究 利用超純無菌水將100%牛源性成分的DNA樣本進(jìn)行系列梯度稀釋,獲得50 ng/μL、10 ng/μL、5 ng/μL、1 ng/μL、500 pg/μL、100 pg/μL、50 pg/μL、10 pg/μL、5 pg/μL、1 pg/μL濃度的DNA,進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR檢測以觀察本方法的靈敏度。

1.2.9 樣品檢測 按照上述的方法對將不同比例的牛肉與雞肉混合肉粉(其中牛肉的質(zhì)量百分?jǐn)?shù)為20%、40%、60%、80%、100%)進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)及肉制品中提取的DNA進(jìn)行檢測。每個(gè)樣品設(shè)置兩個(gè)平行。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Bio-Rad CFX Manger 3.1進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 DNA模版純度及濃度測定

核酸提取過程中容易混入蛋白質(zhì)及碳水化合物等雜質(zhì)。其中A260/A280>1.8可以說明溶液中無蛋白質(zhì)污染,A260/A230比值可以幫助判斷核酸溶液中是否混有糖類等雜質(zhì),當(dāng)A260/A230<2.0時(shí),則說明DNA溶液被碳水化合物污染[16]。由表2可知,本實(shí)驗(yàn)用于特異性研究的不同肉源品種DNA溶液、用于加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)的混合肉粉提取的DNA溶液及檢測樣品中提取出的DNA溶液均較好的去除了蛋白質(zhì)及碳水化合物等雜質(zhì)。

表2 不同肉源品種DNA濃度

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

應(yīng)用熒光定量PCR儀自帶軟件,標(biāo)準(zhǔn)品的Cq值(是指每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號到達(dá)設(shè)定域值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù))與初始濃度的對數(shù)值呈線性關(guān)系,可得圖1。既得牛特異性基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線y=-3.4046x+29.708,R2=0.994,擴(kuò)增效率E=96.6%。內(nèi)參16S rDNA的標(biāo)準(zhǔn)曲線y=-3.4074x+21.250,R2=0.998,擴(kuò)增效率E=96.6%。并通過公式(1)～公式(3)來計(jì)算樣品中牛肉的含量[17]。

圖1 定量標(biāo)準(zhǔn)曲線

cDNA(meatbeef)=10[(Cqbeef-dbeef)/slopebeef]

式(1)

cDNA(meattotal)=10[(Cq16s-d16s)/slope16s]

式(2)

式(3)

其中:cDNA(meatbeef)是樣品中牛肉DNA的濃度(ng/μL),cDNA(meattotal)是樣品中總?cè)忸惖腄NA濃度(ng/μL)。Cqbeef是樣品以牛特異性引物Rd1為引物時(shí)的Cq值,Cq16s是樣品以16S為引物時(shí)的Cq值。dbeef和d16s分別為兩種引物標(biāo)曲的截距,slopebeef和slope16s分別為兩種引物標(biāo)曲的斜率。

2.3 引物和探針的特異性實(shí)驗(yàn)及通用性實(shí)驗(yàn)

通過對牛肉、羊肉、豬肉、鴨肉、雞肉、熟驢肉、鯽魚、大豆粉檢測,其結(jié)果如圖2所示。結(jié)果表明,此引物和探針只針對牛肉可以進(jìn)行特異性擴(kuò)增,對羊肉、豬肉、鴨肉、雞肉、熟驢肉、鯽魚、大豆粉的DNA均不能擴(kuò)增。

圖2 方法特異性研究熒光擴(kuò)增曲線

2.4 靈敏度

如圖3所示,以50 ng/μL～1 pg/μL的牛源性成分DNA樣本作為模板時(shí),均能收集到明顯的熒光擴(kuò)增曲線,而以5、1 pg/μL的牛源性成分DNA樣本和去離子水作為模板時(shí),熒光擴(kuò)增為陰性,因此本方法的最低檢出限為10 pg/μL DNA濃度。

圖3 方法靈敏度研究熒光擴(kuò)增曲線

2.5 回收實(shí)驗(yàn)

按方法1.2.4,采用本實(shí)驗(yàn)所建立的實(shí)時(shí)定量PCR方法對不同質(zhì)量比例牛肉與雞肉混合肉粉的DNA樣品進(jìn)行回收率實(shí)驗(yàn),以驗(yàn)證方法準(zhǔn)確性。檢測結(jié)果如表3所示,并根據(jù)公式(1)(2)(3)計(jì)算得出混合肉粉中牛肉的含量。對比理論混合百分比可知平均回收率為98.62%,說明該方法與真實(shí)值較為接近,具有較好的準(zhǔn)確性。

表3 混合肉樣中牛肉含量的定量檢測

2.6 市售樣品檢測結(jié)果

本實(shí)驗(yàn)選用采購自各大型超市及農(nóng)貿(mào)市場含牛肉成分的肉制品如:手撕風(fēng)干牛肉、麻辣牛肉絲、牛肉絲、牛肉紅腸、火腿腸等,進(jìn)行方法適用性驗(yàn)證。利用本方法對肉制品進(jìn)行檢測,每種樣品設(shè)置兩個(gè)平行。并通過對市售樣品檢測可知,從樣品處理到熒光定量PCR完成大約需要4～5 h。說明本方法所需時(shí)間較少,檢測效率較高。結(jié)果如表4所示。

表4 市售樣品檢測結(jié)果

3 討論

隨著消費(fèi)者消費(fèi)水平的日益提高,誠信度也成為消費(fèi)者選擇肉制品的一個(gè)重要因素。目前研究肉制品中異源基因的技術(shù)有很多。Calvo 等[18]開發(fā)并評估了一種用于檢測豬肉、雞肉、鴨肉、火雞肉和鵝肉的 PCR-RAPD 技術(shù),檢測靈敏度達(dá)到 250 pg。雖然PCR-RAPD技術(shù)是一種很好的檢測肉類摻假手段,但是該技術(shù)重復(fù)性較差且結(jié)果分析復(fù)雜[19]。微滴式數(shù)字PCR可以對樣品進(jìn)行絕對定量,但是檢測通量較低,對實(shí)驗(yàn)操作人員的專業(yè)要求較高,這大大增加了其在檢測方面應(yīng)用的困難。實(shí)時(shí)熒光定量PCR由于添加了Taqman探針和熒光信號,使得其特異性及敏感性高于常規(guī)PCR,并且Real-time PCR在實(shí)時(shí)檢測過程中是處于封閉的體系中進(jìn)行擴(kuò)增,降低了電泳過程中PCR產(chǎn)物的污染的可能,有效的減少了檢測時(shí)間,特別是在檢測大批量樣品時(shí)其優(yōu)勢尤為突出[20]。較數(shù)字PCR相比檢測成本也大大降低。

目前,有研究表明在動物體內(nèi)的不同組織內(nèi)線粒體DNA的數(shù)量也不盡相同[21],因此本方法目前只能應(yīng)用于肉制品而不能應(yīng)用與參雜動物組織器官的樣品。由于在肉制品加工過程中會破壞待測樣本DNA,造成DNA片段長度的銳減[22],因此待測基因片段過長會導(dǎo)致在擴(kuò)增過程中無法檢測到目的片段。而本實(shí)驗(yàn)采用的牛線粒體DNA細(xì)胞色素b基因作為靶基因,根據(jù)其差異性設(shè)計(jì)引物及探針,使得檢測片段長度僅為95 bp。

4 結(jié)論

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,此方法對牛肉特異性較好,對羊肉、豬肉、鴨肉、雞肉、熟驢肉、鯽魚、大豆粉均無特異性擴(kuò)增。此外,對于樣品檢測也具有較高的效率,按每個(gè)樣品兩個(gè)平行計(jì)算,一次最多可進(jìn)行48個(gè)樣品的檢測。靈敏度方面也達(dá)到了10pg/μL。因此,本實(shí)驗(yàn)所建立的Taqman實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測肉制品中牛源性成分的方法具有較高的準(zhǔn)確性及可行性,對于肉制品中牛源性成分的檢測及對肉制品成分的監(jiān)督具有一定的實(shí)際意義。

[1]孟晨,肖迪. 復(fù)合磷酸鹽對牛肉保水性影響的研究[J]. 科技傳播,2010(22):122-123.

[2]李宗夢,趙良娟,趙宏,等. 肉及肉制品動物源性成分鑒別技術(shù)研究進(jìn)展[J]. 食品研究與開發(fā),2014(18):122-127.

[3]鐘文濤,王芳妹,李白玉,等. 四重PCR反應(yīng)體系的建立及在牛肉摻假檢測中的應(yīng)用[J]. 現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展,2016,16(18):3574-3577.

[4]冼鈺茵,易敏英,張璜,等. 環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)快速檢測肉及肉制品中的牛源性成分[J]. 食品工業(yè)科技,2016,37(7):278-282.

[5]郭燕華,王德蓮,王強(qiáng),等. 重組酶介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)快速檢測牛肉及牛肉制品中的牛源性成分[J]. 食品安全質(zhì)量檢測學(xué)報(bào),2017,8(5):1745-1749.

[6]苗麗,張秀平,陳靜,等. 微滴數(shù)字PCR法對肉制品中牛源和豬源成分的定量分析[J]. 食品科學(xué),2016,37(8):187-191.

[7]汪永信,安虹,程堅(jiān),等. 雙重實(shí)時(shí)熒光PCR法檢測食品和飼料中的雞源性成分[J]. 生物技術(shù)通報(bào),2012(1):134-138.

[8]趙新,劉娜,陳銳,等. 應(yīng)用通用引物量化檢測鮮肉及其制品中羊源性成分[J]. 食品研究與開發(fā),2016,37(16):179-184.

[9]K?ppel R,Ruf J,Zimmerli F,et al. Multiplex real-time PCR for the detection and quantification of DNA from beef,pork,chicken and turkey[J]. European Food Research and Technology,2008,227(4):1199-1203.

[10]劉娜,趙新,陳銳,等. 動物肌肉組織DNA的提取方法及實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測[J]. 食品工業(yè)科技,2016,37(18):74-80.

[11]楊彤暉,孟鎮(zhèn),鐘其頂,等. 豬肉類罐頭食品中總DNA提取方法的比較[J]. 食品與發(fā)酵工業(yè),2015,41(4):62-67.

[12]王阿娜,裴瑾,劉薇,等. 桑葉片總RNA提取方法的比較研究[J]. 中成藥,2012,34(7):1377-1380.

[13]吳迪,郭青. TaqMan實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測紫河車摻偽的研究[J]. 中藥材,2017,40(1):38-41.

[14]陳默穎. 超微量核酸蛋白測定儀在核酸和蛋白質(zhì)濃度測定方面的應(yīng)用[C]//全國光譜儀器與分析監(jiān)測學(xué)術(shù)研討會， 2013.

[15]趙新,王永,蘭青闊,等. 熒光定量PCR方法鑒別肉制品中羊源性成分[J]. 食品工業(yè)科技,2015,36(1):299-302.

[16]董志雪,唐蜻,程超華,等. 懸鈴葉苧麻基因組DNA的六種提取方法比較[J]. 中國麻業(yè)科學(xué),2015(5):233-238.

[17]Druml B,Kaltenbrunner M,Hochegger R,et al. A novel reference real-time PCR assay for the relative quantification of(game)meat species in raw and heat-processed food[J]. Food Control,2016,70:392-400.

[18]Calvo J H,Zaragoza P,Osta R. Random Amplified Polymorphic DNA Fingerprints for Identification of Species in Poultry Paté[J]. Poultry Science,2001,80(4):522.

[19]胡謙,陳穎,倪凱,等. 肉制品異源基因檢測技術(shù)研究進(jìn)展[J/OL]. 食品科學(xué):1-10(2017-10-13). http://kns. cnk. net/kcms/detail/11.2206. TS 20171013. 1056. 082. html.

[20]高丹丹,曹郁生,王迎華. PCR技術(shù)在食品動物源性檢測中的應(yīng)用[J]. 食品研究與開發(fā),2007,28(1):141-144.

[21]Listed N. Proceedings of the National Academy of Sciences,USA.[J]. Current Biology Cb,1996,6(6):628.

[22]Ebbehoj K F,Thomsen P D. Differentiation of closely related species by DNA hybridization.[J]. Meat Science,1991,30(4):359-66.