李光輝,郭衛(wèi)蕓,高雪麗,王永輝,孫思勝,夏效東

(1.許昌學院食品與生物工程學院,河南許昌 461000;2.西北農(nóng)林科技大學食品科學與工程學院,陜西楊凌 712100)

金黃色葡萄球菌(Staphyloccocusaureus)為革蘭氏陽性菌,呈球狀,是造成人類食物中毒的重要致病菌之一[1]。Staphyloccocusaureus易污染食品,在食品基質(zhì)中產(chǎn)生腸毒素(如SEA、SEB、SEC、SED、SEE)、溶血毒素、殺白細胞素、血漿凝固酶等外毒素,從而引起食物中毒[2]。近年來抗生素的濫用已導致了Staphyloccocusaureus“超耐藥”菌株(MRSA)的出現(xiàn),同時研究發(fā)現(xiàn)速凍餃子、雞肉、豬肉、即食食品和原料牛奶等均攜帶有 MRSA 菌株[3],這就增加了多重耐藥的危險,使得疾病的預防和治療更加困難,并且易引發(fā)公共衛(wèi)生問題,因而控制食品中Staphyloccocusaureus的污染對保障食品安全和消費者身體健康至關重要。

目前主要采用化學防腐劑來控制食品中的致病菌。隨著對化學合成防腐劑安全性的質(zhì)疑以及人們對食品添加劑有天然、營養(yǎng)和多功能的要求,天然食品防腐劑越來越受到人們的關注。安石榴苷是一種多羥基的酚類化合物,屬于水解性單寧,為石榴皮的主要活性成分,具有抗氧化、抗病毒、抗菌、護肝及減肥等作用[4-7]。綠原酸是由咖啡酸與奎尼酸生成的縮酚酸,是植物體在有氧呼吸過程中經(jīng)莽草酸途徑產(chǎn)生的一種苯丙素類化合物,在蘋果、金銀花等植物中廣泛存在,具有抗菌、抗病毒、保肝利膽、抗腫瘤、降血壓、降血脂、清除自由基和興奮中樞神經(jīng)系統(tǒng)等作用[8-10]。

前期研究證實安石榴苷、綠原酸分別對多種Staphyloccocusaureus具有抑制作用,其對StaphyloccocusaureusATCC25923的最小抑菌濃度(MIC)分別為250 μg/mL和2.5 mg/mL[11-12],但二者對Staphyloccocusaureus的協(xié)同抑制作用及機理未見報道。因此,本研究通過“棋盤法”確定安石榴苷和綠原酸聯(lián)合使用對Staphyloccocusaureus的抑制作用;同時通過生長曲線、細胞膜電勢、胞內(nèi)外pH差、細胞形態(tài)等方面闡明可能的協(xié)同抑菌機理。本研究為開發(fā)新型的食品防腐劑或者用于預防食源性致病菌(如Staphyloccocusaureus)的物質(zhì)提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

StaphyloccocusaureusATCC25923 購于中國科學院微生物研究所菌種保藏中心;Luria-Bertan(LB)瓊脂培養(yǎng)基、Luria-Bertani(LB)肉湯培養(yǎng)基 北京陸橋技術有限責任公司;安石榴苷(純度≥98%) 成都曼思特生物科技有限公司;Bis-(1,3-dibutylbarbituric acid)trimethineoxonol(簡稱為DIBAC4(3)) 純度≥98%,美國Sigma公司;Carboxyfluoresceindiacetate,succinimidyl ester(簡稱為CFDASE) 純度≥98%,美國Invitrogen Molecular Probes公司;尼日利亞菌素 純度≥98%,南京生利德生物科技有限公司;纈氨霉素 美國Sigma公司;HEPES 美國MP Biomedicals公司;其它試劑 均為分析純。

酶標儀 美國BIO-RAD公司;多功能酶標儀 瑞士TECAN公司;掃描電鏡 日本日立公司;離心機 德國Eppendorf公司等。

1.2 實驗方法

1.2.1 菌液的制備 將-80 ℃保存的Staphyloccocusaureus接種于LB瓊脂培養(yǎng)基上,在37 ℃培養(yǎng)12 h;然后,從平板上挑取1～3個菌落接種于LB肉湯中,37 ℃培養(yǎng)10 h。

1.2.2 MIC的測定 采用瓊脂稀釋法。LB固體培養(yǎng)基滅菌后冷卻至50 ℃左右,然后分別向培養(yǎng)基中加入不同質(zhì)量濃度的安石榴苷或綠原酸;待凝固后,用移液槍在瓊脂表面滴加2 μL菌懸液(OD600 nm=0.5),待干燥后將平板置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h,觀察細菌生長情況。以不加提取物的平板為對照。確定無菌生長的最低稀釋濃度為MIC。

1.2.3 安石榴苷與綠原酸對Staphyloccocusaureus協(xié)同抑菌效應的測定 采用棋盤法[13]。用LB肉湯分別將安石榴苷與綠原酸配制不同的濃度(0、1/16 MIC、1/8 MIC、1/4 MIC、1/2 MIC、1MIC和2 MIC)。從低濃度到高濃度分別按行加入安石榴苷溶液50 μL,同行安石榴苷的濃度相等,每行加7孔,第1行作為不加安石榴苷的綠原酸對照組。從低濃度到高濃度分別按列加入綠原酸溶液50 μL,每列加7孔,同列綠原酸濃度相同,第1列作為不加綠原酸的安石榴苷對照組。各孔中分別加入菌懸液(OD600 nm=0.5)50 μL。將96孔板在37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中孵育12 h,采用比濁法進行觀測,記錄2種物質(zhì)聯(lián)用時的MIC。以抗菌藥物部分抑菌濃度指數(shù)(FICI)作為藥物聯(lián)用效果的判斷依據(jù),計算公式為:FICI=甲藥聯(lián)合使用MIC/甲藥單獨使用MIC+乙藥聯(lián)合使用MIC/乙藥單獨使用MIC

結果判定:FICI<0.5為協(xié)同作用;0.5≤FICI≤1為相加作用;l2拮抗作用。

1.2.4 安石榴苷協(xié)同綠原酸對Staphyloccocusaureus生長曲線的影響 用LB肉湯將菌液稀釋成OD600 nm=0.2,取100 μL菌懸液加入96孔板中;將安石榴苷溶液和綠原酸溶液分別取100 μL添加至含有菌懸液的96孔板中;各孔終濃度分別為1/16 MIC綠原酸、1/4 MIC安石榴苷、1/16 MIC綠原酸+1/4 MIC安石榴苷。每個濃度3個重復?；靹蚝笥?7 ℃培養(yǎng)。分別于0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12 h用酶標儀測定各孔在600 nm的吸光度值。

1.2.5 安石榴苷協(xié)同綠原酸對Staphyloccocusaureus膜電勢的影響 取菌液20 mL離心5 min(13200 r/min、5 ℃),棄上清,然后用生理鹽水洗滌3次,最后用生理鹽水調(diào)至OD600 nm=0.5。取3 mL菌液,分別加入1 μL細胞膜電勢熒光探針DiBAC4(5 μmol/L)和不同濃度的安石榴苷和綠原酸溶液(終濃度分別為1/16 MIC綠原酸、1/4 MIC安石榴苷、1/16 MIC綠原酸+1/4 MIC安石榴苷),以加有熒光探針的生理鹽水溶液為對照,室溫孵育5 min;用多功能酶標儀測定各處理組的熒光強度,其激發(fā)和散發(fā)波長分別為492、515 nm[14]。

1.2.6 安石榴苷協(xié)同綠原酸對StaphyloccocusaureuspHin的影響 加載熒光探針[14]:取菌液20 mL,離心(13200 r/min、5 ℃)5 min;用HEPES緩沖液(50 mmol/L,pH8,含5 mmol/L EDTA)洗滌2次,用10 mL HEPES懸浮。向懸浮液中加入1.0 mmol/L cFDASE(終濃度為1 μmol/L),并在37 ℃孵育10 min。用磷酸鉀緩沖液(pH7,含10 mmol/L MgCl2)洗滌2次并懸浮。為了除去沒有聚合的cFSE,向懸浮液中加入葡聚糖(終濃度為10 mmol/L),并在37 ℃孵育30 min,離心(13200 r/min、5 ℃)5 min,并用50 mmol/L磷酸鹽緩沖液(pH7)洗滌2次并懸浮,放在冰塊上待用。

cFSE的流出[14]:分別取上述的懸浮液1 mL,分別加入安石榴苷和綠原酸溶液(4 mL),終濃度分別為1/16 MIC綠原酸、1/4 MIC安石榴苷、1/16 MIC綠原酸+1/4 MIC安石榴苷。37 ℃培養(yǎng)5 min。取液體200 μL放入黑色酶標板,并用多功能酶標儀測定熒光強度(激發(fā)和散發(fā)波長分別為490和520 nm)。

校正曲線[14]:分別用NaOH或者HCl將緩沖母液調(diào)至pH分別為4、5、6、7、8、9、10;然后,取載入熒光探針的菌液1 mL并加入3.8 mL的緩沖液體;同時,加入100 μL的纈氨霉素(終濃度為1 μmol/liter)和100 μL尼日利亞菌素(終濃度為1 μmol/liter)平衡胞內(nèi)外pH;然后用多功能酶標儀測定熒光強度,其激發(fā)和散發(fā)波長分別為490、520 nm。

1.2.7 安石榴苷協(xié)同綠原酸對Staphyloccocusaureus細胞形態(tài)的影響 采用掃描電鏡法觀察菌體形態(tài)。取菌液20 mL,13200 r/min、5 ℃離心5 min;用生理鹽水洗滌3次,并用生理鹽水調(diào)節(jié)菌體至吸光度OD600 nm=0.5(約為108CFU/mL)。分別取5 mL菌懸液,加入不同濃度的安石榴苷和綠原酸混合溶液,各處理組終濃度分別為1/16 MIC綠原酸、1/4 MIC安石榴苷、1/16 MIC綠原酸+1/4 MIC安石榴苷;37 ℃孵育1 h。將不同處理組的菌液離心(13200 r/min、5 ℃、5 min),棄上清,收集菌體;用2.5% 戊二醛固定菌體;12 h后涂片,并將標本置于通風櫥內(nèi)自然風干;噴金鍍膜,用掃描電鏡觀察不同處理組細胞的形態(tài),并拍照。

1.3 數(shù)據(jù)處理與分析

實驗重復3次。用DPS 7.05統(tǒng)計軟件處理數(shù)據(jù),結果以平均值士標準差表示;用Duncan新復極差法進行差異性分析,p<0.05表示差異顯著,p<0.01表示差異極顯著。

2 結果與分析

2.1 安石榴苷和綠原酸對Staphyloccocus aureus的MIC

通過抑菌實驗,發(fā)現(xiàn)安石榴苷與綠原酸對StaphyloccocusaureusATCC25923均有抑制作用,且二者對Staphyloccocusaureus的MIC分別為250 μg/mL與2.5 mg/mL,與文獻一致[11-12]。

2.2 安石榴苷和綠原酸對Staphyloccocus aureus的協(xié)同抑制作用

由表1可知,安石榴苷在亞抑制濃度下,隨著安石榴苷濃度的增加,綠原酸對Staphyloccocusaureus的MIC快速降低;當安石榴苷濃度為62.5 μg/mL(1/4 MIC)時,綠原酸的MIC協(xié)減小到其單獨作用時的1/16。綠原酸在亞抑濃度下,隨著綠原酸濃度的增加,安石榴苷對Staphyloccocusaureus的MIC快速降低,當綠原酸濃度為0.625 mg/mL(1/4MIC)時,安石榴苷的MIC協(xié)減小到其單獨作用時的1/8。可見,安石榴苷和綠原酸聯(lián)合作用時的抗菌活性要強于它們單獨作用時的抗菌活性。FICI的最小值為0.3125,進一步表明安石榴苷和綠原酸對Staphyloccocusaureus存在強烈的協(xié)同抑菌作用。安石榴苷協(xié)同綠原酸對Staphyloccocusaureus的MIC協(xié)為:安石榴苷62.5 μg/mL、綠原酸0.1563 mg/mL。

表1 安石榴苷和綠原酸對Staphyloccocus aureus的協(xié)同抑制作用

2.3 安石榴苷協(xié)同綠原酸對Staphyloccocus aureus生長曲線的影響

由圖1可知,與對照組相比,安石榴苷和綠原酸在MIC協(xié)濃度下能夠完全抑制Staphyloccocusaureus的生長;1/4 MIC安石榴苷或1/16 MIC綠原酸單獨作用時,Staphyloccocusaureus的生長曲線受到抑制。

圖1 安石榴苷協(xié)同綠原酸對Staphyloccocus aureus生長曲線的影響

2.4 安石榴苷協(xié)同綠原酸對Staphyloccocus aureus細胞膜完整性的影響

2.4.1 膜電勢 由圖2可知,對照組的相對熒光強度為-5237;安石榴苷和綠原酸分別作用后,相對熒光強度分別為-3895和-1776.3,分別與對照組有極顯著差異(p<0.01);安石榴苷和綠原酸聯(lián)合作用后,相對熒光強度分別為-2783,與對照有極顯著差異(p<0.01);與對照相比,安石榴苷和綠原酸聯(lián)合作用組的熒光強度是增加的。說明,安石榴苷和綠原酸聯(lián)合作用后,Staphyloccocusaureus細胞膜發(fā)生去極化現(xiàn)象。

圖2 安石榴苷協(xié)同綠原酸對Staphyloccocus aureus膜電勢的影響

2.4.2 pHin-pHout由圖3可知,對照組胞內(nèi)外pH差(pHin-pHout)為0.914,安石榴苷和綠原酸分別處理及聯(lián)合作用后,Staphyloccocusaureus胞內(nèi)外pH差分別為0.717、-0.012和-0.199;安石榴苷和綠原酸聯(lián)合作用后Staphyloccocusaureus胞內(nèi)外pH差變化最大,與對照組有極顯著差異(p<0.01)。說明安石榴苷和綠原酸聯(lián)合作用能夠改變Staphyloccocusaureus正常生長的內(nèi)環(huán)境。

圖3 安石榴苷協(xié)同綠原酸對Staphyloccocus aureus胞內(nèi)外pH差的影響

2.4.3 安石榴苷和綠原酸對Staphyloccocusaureus形態(tài)的影響 由圖4可知,對照組Staphyloccocusaureus的菌體呈球狀,形態(tài)完整,胞體飽滿;安石榴苷作用后,Staphyloccocusaureus菌體出現(xiàn)縊縮,表面出現(xiàn)褶痕,菌體細胞變形;綠原酸作用后,Staphyloccocusaureus菌體出現(xiàn)皺縮、凹陷,菌體表面變化明顯;安石榴苷和綠原酸聯(lián)合作用后,菌體破碎,膜破裂,菌體形態(tài)變化最為嚴重。說明安石榴苷和綠原酸聯(lián)合作用后,菌體細胞膜的通透性的改變最大,對Staphyloccocusaureus的生長具有明顯的抑制作用。

圖4 安石榴苷協(xié)同綠原酸對Staphyloccocus aureus形態(tài)結構的影響

3 討論

目前,食品中常用化學防腐劑來抑制微生物的生長,從而延長食品的貨架期。隨著對化學合成防腐劑安全性的質(zhì)疑以及人們對食品添加劑有天然、營養(yǎng)和多功能的要求,天然食品防腐劑越來越受到人們的關注。因此,從植物中提取抑菌活性物質(zhì)并制成食品防腐劑成為當前的研究熱點。安石榴苷和綠原酸是植物的次生代謝產(chǎn)物,具有多種生理活性。本文研究了安石榴苷和綠原酸對Staphyloccocusaureus的協(xié)同抑制作用及其對菌體細胞膜的影響,結果為安石榴苷和綠原酸對Staphyloccocusaureus的抑制具有協(xié)同作用;聯(lián)合作用后,菌體細胞膜發(fā)生去極化現(xiàn)象,胞內(nèi)外pH差發(fā)生變化,細胞正常生長的內(nèi)環(huán)境發(fā)生變化;另外,聯(lián)合作用后,Staphyloccocusaureus菌體表面破損、內(nèi)容物溶出,導致菌體死亡。

不同的植物提取物能通過多種途徑發(fā)揮其抑菌的功效。許多植物源性的天然抑菌物質(zhì)對細菌的細胞膜有破壞作用,細胞膜的通透性改變能導致細胞內(nèi)容物外流,從而胞外離子如鉀離子及一些酶類等含量升高;同時膜完整性的改變可能引起膜電勢及胞內(nèi)外pH差改變及DNA、RNA等紫外吸收物質(zhì)的滲出;膜改變也能引起能量代謝的變化,導致細胞內(nèi)外 ATP 的含量發(fā)生變化;抗菌物質(zhì)還可以通過影響某些重要蛋白質(zhì)的合成從而導致細胞死亡[15-18]。除抑制細菌自身細胞的生長外,植物源的天然抗菌物質(zhì)還被發(fā)現(xiàn)能抑制細菌毒素的分泌從而降低細菌的致病性。本文研究了安石榴苷協(xié)同綠原酸對Staphyloccocusaureus細胞膜的影響。聯(lián)合作用下,Staphyloccocusaureus細胞膜電勢發(fā)生去極化現(xiàn)象,與綠原酸使Staphyloccocusaureus細胞膜電勢發(fā)生超極化現(xiàn)象[12]結論不一致,這可能與綠原酸/安石榴苷的作用濃度及協(xié)同抑制時作用靶點有關;但是,去極化和超極化都反映出細菌細胞膜遭到了破壞。pHin對于細菌胞內(nèi)DNA的轉(zhuǎn)錄與合成、酶活及蛋白合成等非常重要。不同的細菌,其胞內(nèi)pHin值不同,其范圍為5.6～9.0[20];一旦胞內(nèi)pHin值改變,就暗示出細菌胞內(nèi)某個器官發(fā)生了改變[21]。另外,pHin還控制著細胞膜,pHin發(fā)生變化意味著細胞膜的通透性發(fā)生了改變[21]。本研究證實安石榴苷協(xié)同綠原酸引起StaphyloccocusaureuspHin降低。表明安石榴苷和綠原酸聯(lián)合作用于Staphyloccocusaureus細胞膜,使胞內(nèi)外正常的pH發(fā)生變化。

4 結論

安石榴苷和綠原酸對Staphyloccocusaureus具有協(xié)同抑制作用,其MIC協(xié)為安石榴苷62.5 μg/mL、綠原酸0.1563 mg/mL。

安石榴苷和綠原酸聯(lián)合作用后,Staphyloccocusaureus細胞膜發(fā)生去極化現(xiàn)象,胞內(nèi)外pH差發(fā)生改變;Staphyloccocusaureus菌體表面破損、內(nèi)容物溶出,導致菌體細胞死亡。

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