壓瘡(pressure ulcers)是指局部組織長時間受壓,血液循環(huán)障礙,局部持續(xù)缺血、缺氧、營養(yǎng)不良而致的軟組織潰爛和壞死,多見于大型外科術(shù)后[1]、腦脊髓損傷等導(dǎo)致的活動能力受限的病人[2]、ICU[3]以及臥床不起的老年病人。目前,世界人口老齡化程度加劇且護理人力資源短缺,改善與更新壓瘡、潰瘍等慢性傷口的護理管理迫在眉睫[4-5]。隨著干細胞研究的深入及再生生物醫(yī)學(xué)的發(fā)展,人臍帶間充質(zhì)干細胞 (human umbilical cord mesenchymal stem cells, huMSCs)以其高分化潛能、高增殖力、低免疫原性、取材方便、無倫理學(xué)爭議等優(yōu)點,為傷口愈合的細胞生物治療提供了廣闊前景[6-8]。本研究采用體外培養(yǎng)擴增huMSCs,觀察評價皮下注射huMSCs對老齡嚙齒類動物背部壓瘡的干預(yù)效果,為臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 huMSC的培養(yǎng)及鑒定 取材:采用足月妊娠剖宮產(chǎn)健康新生兒新鮮臍帶標本(由廣州軍區(qū)總醫(yī)院產(chǎn)科提供),經(jīng)產(chǎn)婦授權(quán)同意。標本采集后4 ℃保存,2 h內(nèi)處理。實驗方案經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準。 胎牛血清(FBS) 購自Hyclone;小鼠抗人核單抗購自Chemicon (MAB1281),小鼠抗人線粒體單抗購自Chemicon (MAB1273)。葡萄糖、NaCl、KCl、KH2PO4、Na2HPO4·12H2O、NaH2PO4·2H2O、多聚甲醛等均為國產(chǎn)分析純常規(guī)試劑。

制備流程:將長度約10 cm的臍帶在75%乙醇中漂洗后剪碎至1 mm3大小的組織塊,用 0.2%膠原酶Ⅱ消化后過濾,離心,用DMEM/F12 (+)和10%重懸細胞,按1×105cells/cm2接種細胞于T-25 cm2塑料透氣培養(yǎng)瓶中。3～5 d后更換培養(yǎng)基,去掉未貼壁細胞。以后每3 d 換液1次,至細胞融合至約80%,用2.5 g/L胰酶消化、傳代,以5×104/cm2細胞濃度傳代擴增。

活性檢驗:倒置顯微鏡觀察細胞形態(tài);臺盼藍染色觀察計數(shù)死/活細胞數(shù)目,計算細胞活性(生存率)。

成品鑒定:流式細胞儀檢測第3 代細胞表面 CD29、CD44、CD40、CD106及CD34的表達,行細胞免疫表型鑒定;第3代細胞用多聚甲醛固定后做細胞免疫組化,確定huMSC內(nèi)人核及人線粒體的表達。

1.2 壓瘡動物模型的復(fù)制及創(chuàng)面管理 12只22 月齡健康雌性C57BL/6J小鼠(體質(zhì)量25～35 g)購自廣州軍區(qū)總醫(yī)院大學(xué)動物中心,采用磁鐵對夾皮膚壓瘡造模法,即以一對磁鐵片對夾小鼠背部皮膚12 h,連續(xù)3 d,以建立Ⅲ度壓瘡動物模型。模型成型后,壓瘡局域行皮膚外科手術(shù)十字切口并加清創(chuàng)膠及潰瘍貼。huMSCs組在壓瘡近圍健康組織行huMSCs皮下注射 (n=6);每個壓瘡注射6個位點。對照組同法皮下注射生理鹽水 (n=6)。

1.3 壓瘡愈合終點指標檢測

1.3.1 壓瘡面積:壓瘡初始面積 (original wound area, AO) 約等于模具面積,為5 mm2。壓瘡愈合面積(final wound area, AF)的計算采用橢圓的面積公式,即長×寬×π[9]。

1.3.2 創(chuàng)面愈合率 (healing rate, HR):HR的計算公式為: (AO-AF)/AO×100%[10]。

1.3.3 組織病理學(xué)的量化分析：4周后皮膚組織取材,組織石蠟包埋、切片,做常規(guī)HE染色及血管內(nèi)皮生長因子 (vascular endothelial growth factor,VEGF) 免疫組化,顯微鏡下觀察,采用Dashti-Rahmatabadi 等[11]的方法并加以改良,行病理學(xué)量化分析。比對皮膚創(chuàng)面愈合程度(部分愈合為1分,完全愈合為2分)、炎性反應(yīng)程度(炎細胞浸潤>50%為1分,炎細胞浸潤30%～50%為2分,炎細胞浸潤<30%為3分)、纖維(無纖維再生為1分,有纖維再生為2分)及肉芽組織再生情況(無肉芽組織再生為1分,有肉芽組織再生為2分)。VEGF染色程度依次分為:強陽性 (3分),陽性 (2分),弱陽性 (1分),陰性 (0分)。

2 結(jié)果

HuMSCs組治療后壓瘡創(chuàng)面面積顯著小于對照組 (P<0.05),HR顯著高于對照組 (P<0.05),創(chuàng)面病理學(xué)綜合評分顯著優(yōu)于對照組 (P<0.01)。VEGF在huMSCs組均為陽性或強陽性表達,而對照組VEGF表達較弱,2組差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。病理學(xué)綜合評分與VEGF表達密切相關(guān) (P=0.002)。

表1 2組壓瘡創(chuàng)面綜合評價比較

3 討論

3.1 壓瘡高發(fā)但可控 壓瘡病人住院治療時間延長、生活質(zhì)量嚴重降低、被社會孤立、情緒低沉，治療費用高，使壓瘡的預(yù)防與治療顯得尤為重要。大多數(shù)的壓瘡是可以預(yù)防的,壓瘡的發(fā)生率是臨床護理質(zhì)量的評價指標之一。也正因如此,針對壓瘡的病理生理、預(yù)防及治療的研究一直都是臨床與基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究監(jiān)護的熱點。壓瘡的形成是一個長期、復(fù)雜的過程, 關(guān)于人壓瘡的活體研究還處于起步期[12], 通過以病人為主要研究對象的臨床試驗所獲得的信息仍然相當(dāng)匱乏。而使用動物模型,能有效模擬臨床壓瘡的發(fā)生發(fā)展過程,可控性強,可以用于壓瘡病理生理機制及防治措施的實驗研究。

3.2 HuMSCs的優(yōu)點 骨髓間充質(zhì)干細胞(bone marrow mesenchymal stem cells, bmMSCs) 是再生醫(yī)學(xué)的研究重點。bmMSCs主要來源于骨髓,但骨髓組織取材困難,需行骨髓穿刺術(shù),來源受限,且隨病人年齡增長,骨髓老化可致細胞數(shù)量、質(zhì)量和增殖分化能力顯著降低,并存在病毒感染的潛在危險。bmMSCs體外培養(yǎng)還存在老化、純化成本高、技術(shù)要求高等問題,因此限制了其臨床應(yīng)用。近年研究表明,huMSCs有望成為bmMSCs的理想替代物,用于皮膚病學(xué)及再生醫(yī)學(xué)的研究[6-8, 10-15]。HuMSCs增殖分化潛能高而免疫原性低,擴增時培養(yǎng)體系能統(tǒng)一,便于質(zhì)控,同時采集時對產(chǎn)婦及新生兒無任何危害及損傷,采集方便,易于保存和運輸。因此,huMSCs在老年病人群體具有廣闊的臨床應(yīng)用前景。

3.3 HuMSCs可能通過VEGF加速皮膚壓瘡局灶愈合 本實驗中,治療組huMSCs局部注射后壓瘡瘡面干燥緊縮,病理學(xué)研究表明組織結(jié)構(gòu)修復(fù)重建顯著優(yōu)于對照組,可能與huMSCs移植后顯著高調(diào)組織VEGF的表達有關(guān)。VEGF又稱血管通透性因子 (vascular permeability factor, VPF) 或血管調(diào)理素 (vasculotropin),是一組功能強大且能產(chǎn)生多種效應(yīng)的細胞因子,其生物學(xué)特性主要表現(xiàn)在兩方面:增加微血管通透性和特異性地與血管內(nèi)皮細胞受體結(jié)合,促進血管內(nèi)皮細胞的分裂和增殖,進而導(dǎo)致新生血管的生成。本研究中,huMSCs組壓瘡創(chuàng)面愈合程度高、炎性反應(yīng)程度弱、肉芽組織新生活躍;創(chuàng)面愈合綜合評價顯著優(yōu)于對照組,VEGF多為強陽性或陽性,且表達強度與創(chuàng)面愈合程度密切相關(guān),提示huMSCs移植后通過促進局部缺血組織內(nèi)微小側(cè)支血管重塑從而促進壓瘡修復(fù)[16-17]。

結(jié)合本文部分實驗結(jié)果,復(fù)習(xí)目前有關(guān)huMSCs移植與皮膚損傷修復(fù)重建相關(guān)研究可知,雖然huMSCs移植可促進老齡嚙齒類動物壓瘡的修復(fù),但其臨床轉(zhuǎn)化還需要大量的動物實驗數(shù)據(jù)的支持及臨床前標準化操作規(guī)范的指導(dǎo)。而且,面對不同的病人和不同的壓瘡分期,如何綜合評價治療效果及甄選效果評價參數(shù)仍需進一步研究。

致謝:感謝北京軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所劉少君研究員對本課題的指導(dǎo)。

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