趙軍蒼，王獻(xiàn)明，張瑩瑩，郭宏盛

(河北省邯鄲市中心醫(yī)院，河北 邯鄲 056001)

顱腦外傷是急診外科常見的急危重癥，其中70%～80%是交通事故造成的，另一部分是意外傷害導(dǎo)致的。顱腦外傷是目前青壯年死亡和致殘的主要原因，也是備受社會(huì)關(guān)注的公共衛(wèi)生問題。依據(jù)顱腦外傷發(fā)生的時(shí)間先后，可將其分為原發(fā)性和繼發(fā)性。原發(fā)性顱腦外傷是指創(chuàng)傷發(fā)生的瞬間，暴力直接作用于腦組織所造成的機(jī)械損傷；繼發(fā)性顱腦外傷是損傷發(fā)生數(shù)小時(shí)后，由于腦組織缺氧、缺血、水腫、大量自由基生成、炎性遞質(zhì)釋放、凋亡蛋白基因過(guò)度表達(dá)等因素導(dǎo)致的。繼發(fā)性顱腦外傷不僅在腦損傷的發(fā)病機(jī)制中占有重要地位，而且對(duì)患者預(yù)后有很大影響。細(xì)胞凋亡是由基因控制的、細(xì)胞自主有序的死亡，它涉及一系列基因的激活、表達(dá)及調(diào)控[1]。近年來(lái)研究表明，細(xì)胞凋亡是繼發(fā)性顱腦外傷主要的細(xì)胞死亡方式，腦外傷后，各種刺激信號(hào)可導(dǎo)致多種病理生理因子的表達(dá)，通過(guò)多種途徑誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞凋亡[2]。目前，顱腦外傷抗細(xì)胞凋亡治療的研究仍處于初始階段，大部分只限于基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)。醒腦靜注射液是一種復(fù)方中藥制劑，已經(jīng)開始用于顱腦外傷的臨床治療，并顯示出一定的療效。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)建立SD大鼠顱腦外傷模型，觀察了腦組織細(xì)胞凋亡情況及醒腦靜注射液對(duì)腦細(xì)胞凋亡的影響，旨在為顱腦外傷的臨床治療探索新的思路和方法。

1 實(shí)驗(yàn)資料

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)健康成年SD大鼠108只(雌雄不拘)，體質(zhì)量250～300 g,由河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK(冀)2016-0004。

1.2材料及試劑 醒腦靜注射液(無(wú)錫濟(jì)民可信山禾藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn)，國(guó)藥準(zhǔn)字Z32020563)；SABC免疫組化染色試劑盒、兔抗鼠Fas多克隆抗體、兔抗鼠Fas-L多克隆抗體、兔抗鼠Caspase-3多克隆抗體(均購(gòu)自南京建成生物工程研究所)；原位末端標(biāo)記(TUNEL)試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司生產(chǎn))。自由落體顱腦損傷器具、離心機(jī)、XSZ-4顯微手術(shù)電鉆、-85 ℃超低溫冰箱、彩色病理圖文分析系統(tǒng)、電熱恒溫水箱等。

1.3分組、造模及干預(yù) 將108只SD大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分成假手術(shù)組、損傷組、醒腦靜組，每組36只。損傷組和醒腦靜組采用Feeney’s自由落體腦損傷裝置造模，該裝置由支架、撞擊桿、下落擊錘三部分組成。大鼠乙醚麻醉后，剪去頭部皮毛，俯臥位固定于平臺(tái)上，用碘伏消毒頭頂皮膚，將頭皮沿正中線矢狀切開，用止血鉗分離皮下組織和骨膜，充分暴露顱骨前囟區(qū)域，以中線旁2.5 mm、矢狀縫后1.5 mm為中心，用手術(shù)電鉆磨一直徑約5 mm骨窗，注意止血，避免損傷硬腦膜并保持其外形完整。將撞擊桿的頭端對(duì)準(zhǔn)骨窗，用質(zhì)量為50 g的擊捶從30 cm處自由落下打擊骨窗，保持硬膜完整，造成嚴(yán)重的腦損傷，隨后用骨蠟封閉骨窗，縫合頭皮。假手術(shù)組僅做頭皮切開、顱骨開窗和清創(chuàng)縫合處理。醒腦靜組在腦打擊后5 min內(nèi)腹腔注射醒腦靜20 mL/kg，假手術(shù)組和損傷組大鼠注射等量0.9%氯化鈉溶液，均每天1次，直至取標(biāo)本。造模完成后，把大鼠放入飼養(yǎng)籠內(nèi)，隔離喂養(yǎng)，避免清醒后相互撕咬，并放置充足的水源和食物。

1.4取材及樣品制備 在實(shí)驗(yàn)第1，3，5，7，14，21天清晨，每組各隨機(jī)取出6只空腹大鼠，行乙醚麻醉后，處死并置于冰上取出全腦組織， PBS緩沖液沖洗，4%中性甲醛固定，保存于4 ℃冰箱，選取挫傷周圍區(qū)域約5.0 mm的腦組織石蠟包埋，連續(xù)切片，層厚5.0 μm，以備HE染色、免疫組化染色及TUNEL染色。

1.5腦組織病理觀察 選取HE染色切片進(jìn)行光鏡下觀察。

1.6腦組織中Fas、Fas-L、Caspase-3蛋白表達(dá)檢測(cè) 嚴(yán)格按照SABC試劑盒操作說(shuō)明進(jìn)行免疫組化染色：取出大鼠腦組織石蠟切片，平鋪于多聚賴氨酸玻片，在60 ℃的恒溫箱內(nèi)固定1 h，室溫下3%H2O2孵育10 min，滅活內(nèi)源性過(guò)氧化物酶的活性，高壓抗原熱修復(fù)，羊血清工作液封閉，滴加兔抗鼠一抗工作液，4 ℃ 孵育過(guò)夜，PBS液沖洗3次×5 min，滴加適量生物素標(biāo)記二抗工作液，37 ℃孵育30 min，PBS液再次沖洗3次×5 min，滴加辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的鏈霉素卵白素工作液，37 ℃孵育30 min,PBS沖洗3次×5 min，二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色劑反應(yīng)染色，自來(lái)水充分沖洗。從每組選取切片5張，每張切片任意選取10個(gè)完整并且不重疊的高倍視野。結(jié)果判定：以細(xì)胞核和/或細(xì)胞質(zhì)出現(xiàn)棕黃色顆?；虬咂瑸殛?yáng)性細(xì)胞，用光學(xué)顯微鏡觀察并拍照，并采用Image-Pro Plus(IPP)7.0圖像分析系統(tǒng)測(cè)定各個(gè)視野內(nèi)的平均吸光度值，然后進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。

1.7腦細(xì)胞凋亡檢測(cè) 采用TUNEL法標(biāo)記，嚴(yán)格參照說(shuō)明書操作：將含有脫氧核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶(TdT)的TUNELⅠ液和生物素標(biāo)記X-dUTP的TUNELⅡ液，按1∶9混合并搖勻，每玻片滴50 μL，常溫下孵育30 min，在TdT的作用下，生物素標(biāo)記X-dUTP被給合至凋亡細(xì)胞DNA斷裂后形成3’-OH末端，然后把辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的鏈霉親和素結(jié)合到X-dUTP上，最后加入底物，通過(guò)DAB顯色劑顯色。結(jié)果判定：細(xì)胞核出現(xiàn)棕黃色或棕紅色顆粒為陽(yáng)性細(xì)胞，每張切片隨機(jī)選取5個(gè)完整不重疊的視野，在10×40倍熒光顯微鏡下觀察，采用MoticMed6.0圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行處理，計(jì)算出陽(yáng)性細(xì)胞平均積分光密度值。

2 結(jié) 果

2.13組大鼠腦組織病理學(xué)變化 假手術(shù)組變化不明顯，光鏡下觀察可見腦組織形態(tài)結(jié)構(gòu)均正常，細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核清晰可見，細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整，排列有序，無(wú)充血、水腫、空泡變性、壞死以及膠質(zhì)細(xì)胞增生等情況發(fā)生。損傷組損傷第1天光鏡下見大腦皮質(zhì)表面不連續(xù)，細(xì)胞排列紊亂，形態(tài)結(jié)構(gòu)異常，胞質(zhì)腫脹、結(jié)構(gòu)不清，隨著時(shí)間延長(zhǎng)，細(xì)胞損傷逐漸加重，細(xì)胞結(jié)構(gòu)更加紊亂，胞質(zhì)出現(xiàn)空泡變性，線粒體受損嚴(yán)重，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)顆粒脫落，細(xì)胞核溶解、破裂，上述變化以第5天最重，見圖1；14 d以后細(xì)胞水腫逐漸減輕。醒腦靜組腦組織病理結(jié)構(gòu)損傷明顯減輕，第3天腦組織細(xì)胞輕度水腫；第5天胞核固縮，細(xì)胞內(nèi)雖有空泡變性、線粒體損傷，但較損傷組明顯減輕，見圖2。

2.23組大鼠腦組織中Fas、Fas-L和Caspase-3蛋白表達(dá)情況 假手術(shù)組中，F(xiàn)as、Fas-L和Caspase-3蛋白在腦細(xì)胞中多不表達(dá)或微弱表達(dá)；損傷組和醒腦靜組中，F(xiàn)as、Fas-L和Caspase-3蛋白主要表達(dá)于傷側(cè)大腦半球損傷區(qū)及周圍水腫區(qū)域。損傷第1天，損傷組和醒腦靜組腦組織中即有Fas、Fas-L和Caspase-3明顯表達(dá)；損傷第3天，F(xiàn)as 表達(dá)達(dá)高峰，其后逐漸下降；損傷第5天，F(xiàn)as-L和Caspase-3表達(dá)達(dá)高峰，其后逐漸下降。損傷組各時(shí)間點(diǎn)和醒腦靜組第1—14天上述指標(biāo)均明顯高于假手術(shù)組(P均<0.05)，醒腦靜組第3—21天Fas蛋白表達(dá)量和各時(shí)間點(diǎn)Fas-L、Caspase-3蛋白表達(dá)量均明顯低于損傷組(P均<0.05)。見表1～3。

圖1 損傷組損傷第5天光鏡下表現(xiàn)(HE，×400)

圖2 醒腦靜組損傷第5天光鏡下表現(xiàn)(HE，×400)

表1 3組大鼠各時(shí)間點(diǎn)腦組織中Fas表達(dá)情況

注：①與假手術(shù)組比較,P<0.05；②與損傷組比較,P<0.05。

表2 3組大鼠各時(shí)間點(diǎn)腦組織中Fas-L表達(dá)情況

注：①與假手術(shù)組比較，P<0.05；②與損傷組比較，P<0.05。

表3 3組大鼠各時(shí)間點(diǎn)腦組織中Caspase-3表達(dá)情況

注：①與假手術(shù)組比較，P<0.05；②與損傷組比較，P<0.05。

2.33組大鼠腦細(xì)胞凋亡情況 光鏡下觀察，凋亡主要發(fā)生在損傷區(qū)域及周圍水腫區(qū)域，細(xì)胞皺縮，細(xì)胞核為黃色顆粒狀或條塊狀，多數(shù)為神經(jīng)元細(xì)胞，也有少量神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞及血管內(nèi)皮細(xì)胞。假手術(shù)組無(wú)凋亡細(xì)胞或少量細(xì)胞凋亡。損傷第7天，損傷組和醒腦靜組細(xì)胞凋亡率達(dá)高峰，此后逐漸下降。損傷組各時(shí)間點(diǎn)和醒腦靜組第1—14天腦細(xì)胞凋亡率均明顯高于假手術(shù)組(P均<0.05)，醒腦靜組第3—21天腦細(xì)胞凋亡率均明顯低于損傷組(P均<0.05)。見表4。

表4 3組大鼠各時(shí)間點(diǎn)腦細(xì)胞凋亡情況%)

注：①與假手術(shù)組比較，P<0.05；②與損傷組比較，P<0.05。

3 討 論

顱腦外傷后由于損傷造成大量炎性細(xì)胞因子、乳酸、自由基等物質(zhì)堆積于傷灶局部，引起能量失調(diào)和氧化應(yīng)激，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞死亡。細(xì)胞死亡一般分為壞死和凋亡。細(xì)胞壞死是早已被認(rèn)識(shí)到的一種細(xì)胞死亡方式，而細(xì)胞凋亡則是近年來(lái)逐漸被認(rèn)識(shí)的一種細(xì)胞死亡方式，又稱程序性細(xì)胞死亡。已有研究證實(shí)，顱腦外傷早期腦組織細(xì)胞的壞死是由直接損傷導(dǎo)致的，隨后出現(xiàn)的繼發(fā)性腦損傷既有壞死也有凋亡的參與[3]。直接損傷導(dǎo)致的壞死雖然不可修復(fù)，但可以通過(guò)調(diào)控細(xì)胞凋亡而阻止繼發(fā)性腦損傷的進(jìn)展。

腦外傷后，由于暴力打擊以及應(yīng)激反應(yīng)等因素，腦血流調(diào)節(jié)出現(xiàn)異常，腦組織缺氧缺血，造成細(xì)胞膜、線粒體膜等生物膜功能障礙，導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞能量代謝異常、大量自由基產(chǎn)生、細(xì)胞內(nèi)鈣超載、脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)，這些因素均可啟動(dòng)凋亡調(diào)控基因的表達(dá)，使細(xì)胞進(jìn)入凋亡過(guò)程[4]。凋亡調(diào)控基因所表達(dá)的蛋白中就包括Caspase-3、Fas、Fas-L等調(diào)控因子。研究發(fā)現(xiàn)，脊椎動(dòng)物細(xì)胞的凋亡主要有2種方式，一種是依賴Caspase家族的調(diào)控，另一種不依賴Caspase家族的參與[5]。根據(jù)啟動(dòng)因子的不同，Caspase通路又分為2種：①Fas/Fas-L啟動(dòng)的死亡受體通路，該通路通過(guò)活化Caspase-8，進(jìn)一步激活其下游的效應(yīng)因子Caspase-3，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。②線粒體凋亡通路，該通路在受到凋亡信號(hào)的刺激下，線粒體內(nèi)膜上細(xì)胞色素C脫落，與凋亡活化因子-1結(jié)合形成凋亡復(fù)合體活化Caspase-9, 進(jìn)而激活其下游因子Caspase-3、Caspase-6、Caspase-7，啟動(dòng)級(jí)聯(lián)反應(yīng)的凋亡程序。由此可見，Caspase-3在細(xì)胞凋亡中起關(guān)鍵作用，在整個(gè)凋亡過(guò)程中處于核心地位，是細(xì)胞凋亡的最終執(zhí)行者。細(xì)胞凋亡的過(guò)程是Caspase家族參與的蛋白酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)，當(dāng)Caspase-3被激活后，對(duì)不同的底物蛋白進(jìn)行切割，這些蛋白降解產(chǎn)物不僅會(huì)引起線粒體通透性發(fā)生改變，還可導(dǎo)致細(xì)胞骨架蛋白斷裂、DNA修復(fù)蛋白裂解，干擾細(xì)胞DNA復(fù)制和修復(fù)，損傷細(xì)胞核的結(jié)構(gòu)，從而使細(xì)胞最終出現(xiàn)符合凋亡改變的生化和形態(tài)學(xué)特征。

研究表明，在傳遞凋亡信號(hào)的通路中，死亡受體通路被認(rèn)為是經(jīng)典的傳遞通道。凋亡信號(hào)傳到細(xì)胞內(nèi)部是通過(guò)死亡配體(如Fas-L、TRAIL、TNF-α、sPD-1等)與細(xì)胞膜上相應(yīng)的受體(如Fas、TNF-R1、DR3、DR4、DR5和RANK等)結(jié)合，啟動(dòng)凋亡程序，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[6]。死亡受體/配體家族的共同點(diǎn)是在細(xì)胞內(nèi)存在特異性結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域可特異性的激活Caspase[7]。已有的實(shí)驗(yàn)顯示，F(xiàn)as/Fas-L是重要的啟動(dòng)死亡受體通路的復(fù)合物[8]。Fas蛋白為I型跨膜蛋白，分子量為45 kDa，屬于腫瘤壞死因子受體(TNFR)/神經(jīng)生長(zhǎng)因子受體(NGFR)家族成員，包括3個(gè)半胱氨酸基團(tuán)，半胱氨酸基團(tuán)是細(xì)胞外配體的識(shí)別位點(diǎn)。受體Fas廣泛分布于許多正常細(xì)胞以及激活的T、B淋巴細(xì)胞上，在好多系統(tǒng)都可以檢測(cè)到Fas的表達(dá)。Fas-L是Fas的天然配體，分子量為40 kDa，屬于Ⅱ型膜蛋白，也是TNFR/ NGFR家族成員，F(xiàn)as-L有可溶性和膜結(jié)合性2種形式，均可與Fas受體結(jié)合。Fas在細(xì)胞內(nèi)有氨基酸伸展鏈稱之為死亡域(Dead Domain，簡(jiǎn)稱DD)。當(dāng)Fas-L與Fas分子結(jié)合后，導(dǎo)致Fas相互聚集形成三聚體復(fù)合物，進(jìn)一步使細(xì)胞內(nèi)的DD募集，從而形成活化的Fas相關(guān)蛋白(FADD)，F(xiàn)ADD作為調(diào)試蛋白，在Fas及其下游分子前半胱天冬氨酸蛋白酶8 (Pro-caspase-8)之間起橋梁作用，負(fù)責(zé)激活Pro-caspase-8,活化的Caspase-8釋放到細(xì)胞質(zhì)中，通過(guò)直接/間接途徑活化或裂解其下游的Caspases家族成員，如Caspase-1、Caspase- 3、Caspase- 6、Caspase- 7,激活的Caspases通過(guò)對(duì)底物蛋白的水解把凋亡信號(hào)從細(xì)胞外傳遞到細(xì)胞內(nèi)，或者直接作為凋亡的效應(yīng)分子降解細(xì)胞骨架、切割DNA使之成為寡聚核苷酸片段，染色質(zhì)濃縮，細(xì)胞凋亡[9]。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，損傷組傷后第1天即出現(xiàn)腦細(xì)胞凋亡和Fas、Fas-L、Caspase-3蛋白表達(dá)，腦細(xì)胞凋亡第7天達(dá)到高峰，F(xiàn)as蛋白表達(dá)第3天達(dá)高峰，F(xiàn)as-L和Caspase-3蛋白表達(dá)第5天達(dá)高峰，此后緩慢下降，上述這些變化均符合繼發(fā)性腦損傷的病理生理機(jī)制。

盡管許多重要的凋亡蛋白已被證實(shí)，但對(duì)凋亡發(fā)生的分子機(jī)制仍未完全闡明，因此也對(duì)顱腦外傷的治療提出了挑戰(zhàn)。醒腦靜注射液主要成分包括梔子、麝香、郁金、冰片等，其中麝香芳香開竅；冰片可以改善血腦屏障的通透性，興奮呼吸中樞，提高血氧分壓；梔子清熱開竅,具有降壓、止血、脫水作用；郁金化痰開竅，行氣解瘀通經(jīng)絡(luò)。整個(gè)方劑具有清熱涼血、醒神止痙、解毒止痛、行氣活血的功效[10]。現(xiàn)代藥理學(xué)研究顯示，醒腦靜注射液可通過(guò)血腦屏障直接作用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)，改善微循環(huán)，減輕水腫，改善腦細(xì)胞的缺氧缺血狀態(tài)，減輕細(xì)胞炎性反應(yīng)，清除氧自由基，抑制細(xì)胞凋亡，對(duì)受損部位的神經(jīng)細(xì)胞發(fā)揮修復(fù)和保護(hù)作用[11]。楊超等[12]在常規(guī)西藥治療基礎(chǔ)上加用醒腦靜注射液治療急性腦外傷合并意識(shí)障礙患者40例，結(jié)果治療后GCS評(píng)分及NIHSS評(píng)分明顯好轉(zhuǎn)，預(yù)后良好。張紅等[13]用自由落體方法制造腦外傷大鼠模型觀察凋亡調(diào)節(jié)蛋白c-fos的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)外傷組及醒腦靜組造模24 h后均檢測(cè)到c-fos蛋白的高表達(dá),但是醒腦靜組c-fos蛋白表達(dá)量明顯低于外傷組，證實(shí)醒腦靜注射液可抑制損傷細(xì)胞的凋亡。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，醒腦靜組各時(shí)間點(diǎn)Fas-L、Caspase-3蛋白表達(dá)量和第3—21天Fas蛋白表達(dá)量和細(xì)胞凋亡率均明顯低于損傷組，進(jìn)一步證實(shí)了醒腦靜注射液可通過(guò)抑制凋亡調(diào)節(jié)蛋白從而起到抑制凋亡的作用。

綜上所述，F(xiàn)as、Fas-L和Caspase-3蛋白參與了顱腦外傷大鼠腦細(xì)胞損傷過(guò)程；醒腦靜注射液干預(yù)可明顯減少顱腦外傷大鼠腦細(xì)胞的凋亡，降低Fas、Fas-L和Caspase-3蛋白的表達(dá)，其可能是通過(guò)影響信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的死亡受體通路發(fā)揮作用的，但其涉及哪些分子調(diào)控及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的具體路徑還有待進(jìn)一步研究探討。

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