何繼宏 楊 海 張芳娣 邱海山 陳遠東

糖尿病主要以慢性血糖升高為臨床特征，主要由胰島素分泌不足或作用缺陷所引起，其具體發(fā)病機制尚不明確[1]。長期血糖控制不佳會誘發(fā)糖尿病微血管病變，明顯增加致殘率及死亡率，因此早期診斷、監(jiān)控糖尿病微血管并發(fā)癥對預(yù)防惡性事件發(fā)生有重要意義[2]。微小核糖核酸(microRNA，miRNAs)是一種新型基因表達調(diào)控因子，與胰島素生成、分泌及胰島素作用有密切關(guān)系[3]。近年來有研究顯示[4-5]，miR-16、miR-126可參與糖尿病發(fā)生、發(fā)展，而且其在糖尿病血管并發(fā)癥的發(fā)生中具有重要作用，但臨床對于兩者在糖尿病血管并發(fā)癥中含量變化還需進一步研究。因此本次研究采取PCR方法定量檢測2型糖尿病患者血清中miR-16、126表達水平，分析其在糖尿病發(fā)生、發(fā)展中的作用。結(jié)果報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 納入我院2015年6月-2017年12月于我院就診的2型糖尿病(糖尿病組)、2型糖尿病微血管并發(fā)癥患者(微血管并發(fā)癥組)各40例為研究對象，本次研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會審查批準(zhǔn)。2型糖尿病組患者均符合糖尿病診斷標(biāo)準(zhǔn)[6]，其中男25例，女15例；年齡20～72歲，平均(50.35±9.87)歲；體重指數(shù)18.54～31.95 kg/m2，平均(25.34±3.95)kg/m2；病程1～9年，平均(1.95±1.05)年。微血管并發(fā)癥組患者均符合2型糖尿癥診斷標(biāo)準(zhǔn)[6]，且發(fā)生微血管并發(fā)癥，其中男23例，女17例；年齡22～76歲，平均(51.78±8.64)歲；體重指數(shù)19.05～32.87 kg/m2，平均(26.14±4.02)kg/m2；病程8個月～7年，平均(2.04±1.13)年。本次患者排除標(biāo)準(zhǔn)：年齡<18歲或>80歲；其他類型糖尿?。缓喜?yán)重心血管疾病、甲狀腺功能紊亂、急性感染及惡性腫瘤者。另選取40例健康體檢者為對照組，男22例，女18例；年齡19～78歲，平均(50.95±8.05)歲。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)本收集與保存，采集80例患者及40例健康體檢者空腹靜脈血3 mL，3 000 r/min低速離心10 min，收集血清標(biāo)本置于-80℃保存。

1.2.2 生化指標(biāo)測定 采用全自動生化分析儀檢測空腹血糖(FPG)、糖化血紅蛋白(HbA1c)、總膽固醇(TC)、甘油三脂(TG)、高密度脂蛋白(HDL-C)、低密度脂蛋白(LDL-C)水平，各檢測試劑盒均購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，嚴(yán)格按照試劑盒操作說明書進行操作。

1.2.3 血清RNA提取及熒光定量PCR檢測miR-16、miR-126 收集的血清標(biāo)本中加入TRIZOL LS試劑及200 μL氯仿?lián)u勻，靜置15 min，4℃ 12 000 rpm離心10 min，將上層水相已至另一離心管中，加入異丙醇，4℃ 12 000 rpm離心10 min，棄上清液，加入乙醇，7 500 rpm離心5 min，加入100 μL 0.1%DEPC ddH2O，嚴(yán)格按照RNA回收試劑盒說明書純化回收RNA。采用逆轉(zhuǎn)錄熒光PCR檢測miR-16、miR-126，以U6為內(nèi)參，引物及探針購自TaKaRa公司，嚴(yán)格按照實驗室操作步驟進行操作。

1.3 觀察指標(biāo) 記錄三組FPG、HbA1c、TC、TG、LDL-C、HDL-C水平差異，并采用熒光定量PCR檢測三組血清miR-16、miR-126變化，分析miR-16、miR-126對糖尿病微血管并發(fā)癥的預(yù)測價值。

2 結(jié)果

2.1 三組血生化檢測結(jié)果比較 微血管并發(fā)癥組、糖尿病組FPG、HbA1c、TC、TG、LDL-C、HDL-C水平均高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。微血管并發(fā)癥組與糖尿病組各生化檢測結(jié)果比較均無顯著差異(P>0.05)。見表1。

組別FPG(mmol/L)HbA1c(%)TC(mmol/L)TG(mmol/L)LDL-C(mmol/L)HDL-C(mmol/L)微血管并發(fā)癥組(n=40)9.26±2.181)9.68±2.541)4.75±1.952.15±0.651)3.12±0.571)1.05±0.071)糖尿病組(n=40)9.24±2.231)10.21±2.311)4.70±2.062.04±0.711)2.97±0.681)1.02±0.081)對照組(n=40)5.13±2.355.32±1.984.32±2.191.02±0.322.33±0.541.43±0.10

注：與對照組比較，1)P<0.05。

2.2 三組血清miR-16、miR-126比較 微血管并發(fā)癥組、糖尿病組、對照組中miR-16呈降低趨勢，miR-126呈升高趨勢，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

組別miR-16miR-126微血管并發(fā)癥組(n=40)42.95±14.671)2)18.35±6.171)2)糖尿病組(n=40)26.69±9.462)26.97±9.862)對照組(n=40)15.06±0.9735.14±0.95

注：與糖尿病組比較，1)P<0.05；與對照組比較，2)P<0.05。

2.3 miR-16、miR-126對糖尿病微血管并發(fā)癥的預(yù)測價值分析 miR-16預(yù)測糖尿病微血管并發(fā)癥的ROC曲線下面積0.810，標(biāo)準(zhǔn)誤為0.051，P=0.000，95%置信區(qū)間為0.710～0.910，當(dāng)最佳截斷值為32.62，此時敏感度與特異度均為0.825。miR-126預(yù)測糖尿病微血管并發(fā)癥的ROC曲線下面積0.784，標(biāo)準(zhǔn)誤為0.051，P=0.000，95%置信區(qū)間為0.683～0.884，當(dāng)最佳截斷值為20.42，此時敏感度與特異度均為0.825，特異度為0.725。見圖1-圖2。

圖1 miR-16預(yù)測糖尿病微血管并發(fā)癥的ROC曲線

圖2 miR-126預(yù)測糖尿病微血管并發(fā)癥的ROC曲線

3 討論

miRNAs與特異性靶信使結(jié)合后可在轉(zhuǎn)錄水平上抑制基因表達，可調(diào)控細胞周期，參與疾病進展，而且這些循環(huán)miRNAs在血漿中含量穩(wěn)定，檢測方便、無創(chuàng)，有可能成為預(yù)測、診斷糖尿病及其相關(guān)微血管并發(fā)癥的生物標(biāo)志物[7-8]。目前臨床有大量研究顯示[9-11]，miRNAs與糖尿病發(fā)病機制有密切關(guān)系，而且其與胰島素發(fā)育、生成及分泌有關(guān)。

本次研究顯示，微血管并發(fā)癥組、糖尿病組各生化指標(biāo)與對照組間有顯著差異，但糖尿病微血管并發(fā)癥患者生化指標(biāo)與糖尿病并無顯著差異，與既往研究結(jié)果相符[12]。但通過PCR技術(shù)檢測患者體內(nèi)miRNAs含量變化結(jié)果顯示，糖尿病微血管并發(fā)癥患者miR-16表達顯著高于糖尿病患者，提示miR-16或許可作為診斷糖尿病微血管并發(fā)癥的輔助標(biāo)志物。本次研究還顯示，miR-16預(yù)測糖尿病微血管并發(fā)癥的ROC曲線下面積0.810，當(dāng)最佳截斷值為32.62，此時敏感度與特異度均為0.825，這也進一步提示miR-16有望成為糖尿病病情進展及血管并發(fā)癥的相關(guān)血清標(biāo)志物。萬淑君等[13]研究

顯示，糖尿病肢體缺血患者血液循環(huán)中miR-16含量增高，而且在血管重建術(shù)后狹窄與血液中miR-16水平有關(guān)，在預(yù)測預(yù)后方面有一定價值。

miR-126在人內(nèi)皮細胞中表達，其在血管形成、血管炎性反應(yīng)方面有重要意義。本次研究顯示，糖尿病微血管并發(fā)癥患者及單純糖尿病患者體內(nèi)miR-126表達低下，而且糖尿病微血管并發(fā)癥患者miR-126與糖尿病患者之間也存在差異，miR-126預(yù)測糖尿病微血管并發(fā)癥的ROC曲線下面積0.784，當(dāng)最佳截斷值為20.42，此時敏感度與特異度均為0.825，提示血清miR-126可作為糖尿病及微血管并發(fā)癥的生物標(biāo)志物。郭曉莉等[14]研究顯示，在肝細胞中，miR-126可靶向抑制胰島素受體底物而發(fā)生胰島素抵抗，這也進一步反應(yīng)血清miR-126與糖尿病進展密切相關(guān)。雖然目前臨床對于miR-16、miR-126在糖尿病及糖尿病微血管并發(fā)癥方面取得一些研究，但關(guān)鍵的基因分子仍需后續(xù)研究進一步探討。

綜上，miR-16、miR-126與糖尿病微血管并發(fā)癥發(fā)生有關(guān)，可為糖尿病及其微血管并發(fā)癥的診斷及治療提供一個新思路。

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