張念華 武如通 李壽杰 陳高峰

結(jié)腸癌的發(fā)病率不斷增高，是目前我國(guó)最常見(jiàn)的消化道惡性腫瘤，很難早期發(fā)現(xiàn)及治療，整體治療效果并不好?；熢诮Y(jié)腸癌的綜合治療中占據(jù)重要地位。然而化療過(guò)程中產(chǎn)生的多藥耐藥現(xiàn)象又會(huì)造成腫瘤治療失敗。腫瘤治療過(guò)程中，總有部分腫瘤細(xì)胞可以逃避化療藥物的殺傷，這部分殘留的腫瘤細(xì)胞隨時(shí)有可能增殖形成新的腫瘤。能夠逃避化療藥物殺傷的腫瘤細(xì)胞往往都是腫瘤干細(xì)胞。這部分細(xì)胞平時(shí)大都處于休眠狀態(tài)，化療藥物并不能有效殺滅，多程化療后往往會(huì)造成腫瘤干細(xì)胞殘留。殘留的腫瘤干細(xì)胞隨時(shí)可能再進(jìn)入增殖狀態(tài)，導(dǎo)致結(jié)腸癌復(fù)發(fā)。在目前發(fā)現(xiàn)的腫瘤干細(xì)胞標(biāo)志物中，CD133在結(jié)腸癌干細(xì)胞中多有表達(dá)，在耐藥的結(jié)腸癌細(xì)胞中CD133的表達(dá)更是出現(xiàn)明顯上調(diào)。本研究運(yùn)用RNA干擾技術(shù)下調(diào)結(jié)腸癌耐藥細(xì)胞株CD133的表達(dá)，觀察其對(duì)耐藥細(xì)胞株化療藥物敏感性的影響，以期為靶向CD133的治療提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

lovo細(xì)胞株為人結(jié)腸癌腫瘤細(xì)胞，保存于中山大學(xué)華南腫瘤學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室。細(xì)胞培養(yǎng)基為RPMI-1640培養(yǎng)基，購(gòu)自Gibco公司，細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中加10%的胎牛血清。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 人結(jié)腸癌耐藥細(xì)胞株的建立 運(yùn)用藥物濃度梯度遞增間歇誘導(dǎo)法建立人結(jié)腸癌lovo細(xì)胞耐5-FU細(xì)胞株。細(xì)胞培養(yǎng)液中首先加入2 mg/l的5-FU進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)48 h后更換普通培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，待細(xì)胞重新長(zhǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)，再次加5-FU進(jìn)行誘導(dǎo)。在此過(guò)程中，不斷增加5-FU的濃度，直到獲得能在50 mg/l的5-FU濃度中穩(wěn)定生長(zhǎng)的細(xì)胞，并命名為lovo/5-FU。平時(shí)傳代過(guò)程中，為維持其耐藥性，培養(yǎng)液中加入50 mg/l的5-FU。運(yùn)用MTT法檢測(cè)結(jié)腸癌耐藥細(xì)胞株的耐藥能力，并計(jì)算半數(shù)抑制濃度(IC50)及耐藥指數(shù)。

1.2.2 CD133特異性干擾載體的構(gòu)建

CD133基因序列參考GeneBank數(shù)據(jù)庫(kù)，選取針對(duì)CD133的干擾序列構(gòu)建到慢病毒RNA干擾載體上，形成CD133特異性RNA干擾慢病毒載體。慢病毒載體中含G418抗性基因。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的lovo/5-FU細(xì)胞，接種于12孔培養(yǎng)板中。密切觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況，待細(xì)胞匯合度達(dá)80%時(shí)，利用Lipofectamine TM2000將CD133特異性RNA干擾慢病毒載體轉(zhuǎn)染lovo/5-FU細(xì)胞。轉(zhuǎn)染時(shí)間為6 h，轉(zhuǎn)染結(jié)束后更換為選擇培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，選擇培養(yǎng)基中含濃度為800ug/ml的G418。繼續(xù)培養(yǎng)2周后，挑選出抗性克隆，繼續(xù)維持培養(yǎng)。

1.2.3 Western blot法分析CD133的表達(dá)

1.2.3.1 細(xì)胞總蛋白的提取及定量 將細(xì)胞上層培養(yǎng)液倒掉，經(jīng)PBS沖洗后加蛋白裂解液，收集細(xì)胞裂解液保存?zhèn)溆谩２捎肂SA法進(jìn)行蛋白定量，根據(jù)蛋白定量結(jié)果及所需加的蛋白量計(jì)算加樣量。

1.2.3.2 加樣、跑膠及電轉(zhuǎn) 根據(jù)目的蛋白的分子量選擇相應(yīng)濃度的膠。將marker及蛋白樣品進(jìn)行編號(hào)，按編號(hào)加入不同泳道。加樣結(jié)束，進(jìn)行跑膠及電轉(zhuǎn)。

1.2.3.3 一抗反應(yīng)及二抗反應(yīng) 將CD133抗體以1∶2000的比例用5%脫脂奶-TBST溶液10 ml進(jìn)行稀釋，將PVDF膜浸入其中，進(jìn)行一抗反應(yīng)。反應(yīng)結(jié)束后，二抗用5%脫脂奶-TBST溶液稀釋至10 ml，將PVDF膜置于其中，進(jìn)行二抗反應(yīng)。二抗反應(yīng)結(jié)束后，在暗房進(jìn)行發(fā)光洗片。

1.2.4 細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)

1.2.4.1 基質(zhì)膠準(zhǔn)備 首先將matrigel基質(zhì)膠進(jìn)行融化，應(yīng)用無(wú)血清RPMI-1640培養(yǎng)基將融化的，在Transwell小室上室底部鋪50μl稀釋的matrigel基質(zhì)膠。

1.2.4.2 細(xì)胞遷移 胰酶消化lovo腫瘤細(xì)胞，運(yùn)用無(wú)血清的RPMI-1640培養(yǎng)基進(jìn)行重懸，調(diào)整細(xì)胞密度至1×107個(gè)/L。100 μl不含血清的細(xì)胞懸液加入Transwell小室上室，下室加入含血清培養(yǎng)基。

1.2.4.2 染色觀察 培養(yǎng)結(jié)束后取出transwell小室用PBS緩沖液漂洗2次，多聚甲醛固定細(xì)胞后，置入蘇木精溶液中染色。染色結(jié)束后，顯微鏡下觀察并計(jì)數(shù)。運(yùn)用高倍視野(X 200)進(jìn)行觀察，隨機(jī)選取上、下、中心、左、右5個(gè)視野，計(jì)算視野內(nèi)侵出的細(xì)胞數(shù)。

1.2.5 MTT法測(cè)定對(duì)化療藥物耐藥的逆轉(zhuǎn)作用 選擇結(jié)腸癌lovo細(xì)胞株及其對(duì)應(yīng)的耐5-FU細(xì)胞株，共設(shè)3個(gè)組：空白對(duì)照組、化療藥物組、CD133特異性RNA干擾慢病毒載體聯(lián)合化療藥物處理組。MTT法檢測(cè)經(jīng)轉(zhuǎn)染CD133特異性RNA干擾慢病毒載體后，結(jié)腸癌耐藥細(xì)胞株對(duì)化療藥物的IC50值，觀察其對(duì)化療藥物耐藥的逆轉(zhuǎn)作用。重復(fù)三次，根據(jù)結(jié)果計(jì)算逆轉(zhuǎn)倍數(shù)。

2 結(jié)果

2.1 結(jié)腸癌耐藥細(xì)胞株的建立及耐藥能力測(cè)定

通過(guò)運(yùn)用藥物濃度梯度遞增間歇誘導(dǎo)法建立人結(jié)腸癌lovo耐5-FU細(xì)胞株(lovo/5-FU)。MTT法分析lovo及l(fā)ovo/5-FU細(xì)胞株對(duì)5-FU的敏感性，結(jié)果顯示，5-FU對(duì)lovo細(xì)胞株的IC50為14.2 mg/l，對(duì)lovo/5-FU細(xì)胞株的IC50為119.5 mg/l。根據(jù)耐藥指數(shù)=子代細(xì)胞IC50(119.5 mg/l)/親代細(xì)胞IC50(14.2 mg/l)，得出耐藥指數(shù)為：8.42。

2.2 RNA干擾CD133的表達(dá)對(duì)化療藥物耐藥的逆轉(zhuǎn)作用

選擇結(jié)腸癌lovo細(xì)胞株及其對(duì)應(yīng)的耐5-FU細(xì)胞株(lovo/5-FU)，共設(shè)3個(gè)組：空白對(duì)照組、化療藥物組、RNA干擾聯(lián)合化療藥物處理組。MTT法檢測(cè)經(jīng)CD133特異性RNA干擾慢病毒載體轉(zhuǎn)染后，lovo/5-FU細(xì)胞株對(duì)5-FU的IC50值為11.2 mg/l：而對(duì)照組lovo/5-FU細(xì)胞株對(duì)5-FU的IC50為119.5 mg/l。根據(jù)逆轉(zhuǎn)倍數(shù)RF=化療藥物組IC50(119.5 mg/l)/聯(lián)合用藥組IC50(11.2 mg/l)，得出逆轉(zhuǎn)倍數(shù)(RF)為10.67。結(jié)果顯示：RNA干擾CD133的表達(dá)后耐藥性明顯逆轉(zhuǎn)。

2.3 Western blot法分析CD133的表達(dá)

lovo/5-FU細(xì)胞經(jīng)CD133特異性RNA干擾慢病毒載體轉(zhuǎn)染后，繼續(xù)維持培養(yǎng)48小時(shí)，加入細(xì)胞裂解液收集蛋白，運(yùn)用western blot法分析CD133的表達(dá)(設(shè)lovo對(duì)照組及l(fā)ovo/5-FU對(duì)照組)。結(jié)果示：lovo/5-FU細(xì)胞CD133的表達(dá)水平顯著高于lovo細(xì)胞；運(yùn)用RNA干擾lovo/5-FU細(xì)胞CD133的表達(dá)后，其CD133的表達(dá)水平明顯下調(diào)(圖1)。結(jié)果表明RNA干擾有效。

圖1 Western blot法分析CD133的表達(dá)

2.4 細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)分析加入中成藥后對(duì)結(jié)腸癌耐藥細(xì)胞株遷移能力的影響

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的lovo/5-FU細(xì)胞株進(jìn)行Transwell遷移實(shí)驗(yàn)，遷移實(shí)驗(yàn)設(shè)四組：lovo/5-FU細(xì)胞株空白對(duì)照組、5-FU組(IC20濃度)、RNA干擾組、RNA干擾加5-FU(IC20濃度)組。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：lovo/5-FU細(xì)胞株空白對(duì)照組侵出小室的細(xì)胞數(shù)目最多，遷移能力最強(qiáng)，平均每個(gè)高倍視野內(nèi)侵出小室的細(xì)胞數(shù)為92.3±8.3個(gè)；5-FU組和RNA干擾組侵出小室的細(xì)胞數(shù)目較多，遷移能力稍弱于空白對(duì)照組，平均每個(gè)高倍視野內(nèi)侵出小室的細(xì)胞數(shù)分別為67.5±8.2個(gè)和62.3±7.9個(gè)；RNA干擾加5-FU組侵出小室的細(xì)胞數(shù)目最少，平均每個(gè)高倍視野內(nèi)侵出小室的細(xì)胞數(shù)僅有31.4±6.7個(gè)。

3 討論

結(jié)腸癌在化療過(guò)程中極易產(chǎn)生化療耐藥，產(chǎn)生的多藥耐藥(multidrug resistance，MDR) 現(xiàn)象是造成化療失敗的根源。結(jié)腸癌化療失敗后，腫瘤進(jìn)展極易出現(xiàn)腸梗阻，出現(xiàn)腸梗阻患者對(duì)治療的耐受性變差，預(yù)后不佳[1]。目前在結(jié)腸癌中也發(fā)現(xiàn)存在腫瘤干細(xì)胞，腫瘤干細(xì)胞具有高度自我更新能力，能夠隨時(shí)分化成增殖活躍的腫瘤細(xì)胞，造成腫瘤治療失敗，出現(xiàn)復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移[2]。在腫瘤治療過(guò)程中，腫瘤干細(xì)胞可能逃避抗腫瘤藥物的殺傷，逐漸產(chǎn)生耐藥性，增殖形成新的腫瘤，新生腫瘤將會(huì)對(duì)抗腫瘤治療產(chǎn)生更強(qiáng)的耐受，具有更高的增殖和轉(zhuǎn)移潛能，從而導(dǎo)致腫瘤進(jìn)展[3]。CD133與結(jié)腸癌腫瘤干細(xì)胞密切相關(guān)，在其中多有表達(dá)[4]。來(lái)自于結(jié)腸癌的CD133陽(yáng)性腫瘤細(xì)胞具有高度的致瘤性，種植在裸鼠中能夠形成腫瘤，CD133陰性腫瘤細(xì)胞則不能形成腫瘤[5]。

本研究首先運(yùn)用藥物濃度梯度遞增間歇誘導(dǎo)法建立人結(jié)腸癌lovo耐5-FU細(xì)胞株，同時(shí)構(gòu)建了CD133特異性RNA干擾慢病毒載體。Western blot法分析發(fā)現(xiàn)，出現(xiàn)耐藥性的lovo/5-FU細(xì)胞株較lovo細(xì)胞株CD133表達(dá)明顯上調(diào)。結(jié)腸腫瘤標(biāo)本中CD133陽(yáng)性表達(dá)是手術(shù)患者預(yù)后不良因素之一，同時(shí)也是接受5-FU化療患者的預(yù)后不良因素。CD133低表達(dá)患者具有更好的生存率[6-8]。lovo/5-FU細(xì)胞株在耐藥過(guò)程中出現(xiàn)CD133的表達(dá)提示預(yù)后不良。我們運(yùn)用CD133特異性RNA干擾慢病毒載體轉(zhuǎn)染lovo/5-FU細(xì)胞株后，其CD133的表達(dá)出現(xiàn)明顯下調(diào)。伴隨著CD133的表達(dá)下調(diào)，lovo/5-FU細(xì)胞株對(duì)化療藥物的耐藥性也出現(xiàn)逆轉(zhuǎn)。同時(shí)細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)表明，經(jīng)轉(zhuǎn)染CD133特異性RNA干擾慢病毒載體后，細(xì)胞遷移能力明顯下降。這表明，運(yùn)用RNA干擾下調(diào)CD133的表達(dá)能夠逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞的耐藥，提高腫瘤細(xì)胞對(duì)化療的敏感性。RNA干擾下調(diào)CD133的表達(dá)對(duì)化療具有增敏作用，在結(jié)腸癌基因治療中有望成為新的治療靶點(diǎn)。

腫瘤干細(xì)胞大多處于休眠狀態(tài)，傳統(tǒng)化療藥物僅能殺傷增殖活躍的腫瘤細(xì)胞，并不能有效殺滅處于休眠狀態(tài)腫瘤干細(xì)胞，這是腫瘤復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移的重要原因。CD133的表達(dá)能夠預(yù)測(cè)結(jié)腸癌患者的預(yù)后，CD133低表達(dá)患者預(yù)后較好，高表達(dá)患者預(yù)后較差。CD133高表達(dá)的患者除了給予輔助化療外，還應(yīng)該考慮新的治療方法[9]。有研究表明靶向CD133的溶瘤腺病毒能夠選擇性的感染并殺死CD133陽(yáng)性的結(jié)腸癌細(xì)胞[10]。我們的研究表明在結(jié)腸癌細(xì)胞株lovo細(xì)胞在對(duì)5-FU發(fā)生耐藥后，出現(xiàn)CD133的表達(dá)上調(diào)。運(yùn)用RNA干擾方法抑制CD133的表達(dá)，可逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞的耐藥性。

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