羅朝文 成金玲 張楚瑜 蕭丹賢 馮嘉欣 陳盛強 沈巖松 胡 楠 黃梅秀

高壓氧(hyperbaric oxygenation，HBO)治療是一種常見臨床治療手段，指機體處于高氣壓環(huán)境中呼吸純氧或高濃度氧, 以達(dá)到治療疾病目的的一種治療方法。高壓氧常用于冠心病[1]，炎癥性腸病[2]，急性腦梗死[3]和顱腦損傷[4]等眾多臨床疾病的治療，而隨著進(jìn)一步的臨床實踐發(fā)現(xiàn)，高壓氧療法對老年癡呆[5]、孤獨癥[6]等患者的腦功能的恢復(fù)和改善也能取得良好的療效。

人與動物的行為是在中樞神經(jīng)系統(tǒng)控制下的極其復(fù)雜的過程，這一過程起始于內(nèi)外環(huán)境的變化作用于相應(yīng)感覺器官，個體往往會通過外在動作、行為和情緒表現(xiàn)出這種變化。生活環(huán)境條件的改變或受到外界環(huán)境的刺激后，人與動物會在中樞神經(jīng)系統(tǒng)控制下，做出一系列的如向性、趨性、反射、本能、學(xué)習(xí)和推理等行為反應(yīng)。

在臨床實驗方面，Rossignol，hungpaibulpatana等人[7-9]證明高壓氧療法與現(xiàn)有一些治療方法相結(jié)合能普遍提高孤獨癥患兒的社會功能；唐龍沖等[5]證明高壓氧治療有助于改善血管性癡呆患者認(rèn)知行為；動物實驗方面，徐曉虹等發(fā)現(xiàn)高壓氧也能改變昆明小鼠[10]、Wistar大鼠[11]的一些行為學(xué)實驗的表型，但高壓氧對FVB品系小鼠高架十字迷宮行為影響目前尚未報道。因此為進(jìn)一步明確高壓氧對于小鼠高架十字迷宮行為的影響，本實驗對4周齡FVB129 小鼠進(jìn)行高壓氧干預(yù)后，再進(jìn)行高架十字迷宮行為觀察，嘗試為進(jìn)一步開展高壓氧影響神經(jīng)系統(tǒng)生理機制的研究提供行為學(xué)實驗的參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物 4周齡FVB129近交系小鼠(荷蘭伊拉斯塔斯大學(xué)細(xì)胞生物學(xué)及遺傳學(xué)研究中心Oostra BA教授惠贈)，廣州醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心飼養(yǎng)及繁殖，所有小鼠均遵循人道原則和廣東省及廣州醫(yī)科大學(xué)實驗動物管理飼養(yǎng)條例的要求進(jìn)行飼養(yǎng)及操作。

1.1.2 高壓氧干預(yù)設(shè)備 NG90IIIB型單人醫(yī)用高壓純氧艙廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院康復(fù)科提供。

1.1.3 十字高架迷宮材料 高架十字迷宮(自制):兩條兩側(cè)有擋板圍蔽的閉臂和兩條兩側(cè)沒有擋板圍蔽的開臂互相垂直成“十”字型交叉，裝置離地面50 cm，每條臂均長30 cm、寬5 cm，閉臂擋板高15 cm，每條臂底部均涂黑。

1.1.4 動物行為分析軟件 Smart v2.5.21(西班牙Panlab公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 實驗動物分組及高壓氧處理 實驗使用30日齡FVB129近交系小鼠分成兩組：高壓氧組和對照組。高壓氧組小鼠處理方案為采用單人醫(yī)用高壓純氧艙進(jìn)行高壓氧干預(yù)，每次干預(yù)前用純氧洗艙10 min，然后逐漸加壓20 min至2.0ATA,穩(wěn)壓維持40 min, 期間持續(xù)純氧通風(fēng)，氧流量維持5 L/min，艙內(nèi)氧濃度在95%以上，艙內(nèi)溫度在20～25 ℃，隨后減壓10 min至1。OATA出艙, 1次/天,10天一個療程，中間間隔1天，再進(jìn)行第2個療程。對照組小鼠置于籠內(nèi)，不做任何特殊處理，單純飼養(yǎng)21天。兩個療程的高壓氧干預(yù)結(jié)束后立刻對兩組小鼠進(jìn)行高架十字迷宮行為學(xué)實驗。

1.2.2 高架十字迷宮 實驗開始前確認(rèn)裝置無上次實驗留下的小鼠的糞便，是清潔、無味道的。將小鼠提前3小時左右安置于行為學(xué)實驗室適應(yīng)環(huán)境，減少小鼠緊張。把高架十字迷宮放在光線充足的地方，在開臂與閉臂接合處上方安置好攝像機, 并與計算機記錄系統(tǒng)相聯(lián)接，調(diào)整好錄像畫面。實驗開始時將小鼠從籠內(nèi)取出，背向?qū)嶒炚?，頭朝開臂放入開臂與閉臂結(jié)合處。小鼠進(jìn)入開臂與閉臂結(jié)合處后開始計時，讓小鼠在迷宮中自由活動，使用Smart v2.5.21軟件跟蹤小鼠活動軌跡并記錄下小鼠在高架十字迷宮中5 min 的行為表現(xiàn)。實驗結(jié)束后將小鼠放回籠內(nèi)，用75%乙醇擦洗1遍迷宮并待乙醇揮發(fā)干凈，防止殘留氣味干擾下一次的實驗結(jié)果，用軟件分析錄像。觀察指標(biāo)：①進(jìn)入閉臂次數(shù)(Close arm Entry，CE)，進(jìn)入到任一閉臂的次數(shù)，以小鼠四個爪子均進(jìn)入臂內(nèi)為準(zhǔn)，中途一個爪子從該臂中完全退出則為該次進(jìn)入活動完成; ②進(jìn)入開臂次數(shù)(Open arm Entry，OE)，進(jìn)入到任一開臂的次數(shù)，以小鼠四個爪子均進(jìn)入到臂內(nèi)為準(zhǔn)，中途一個爪子從該臂中完全退出則為該次進(jìn)入活動完成;③閉臂停留時間(Close arm Time，CT)，單位: 秒; ④開臂停留時間(Open arm Time，OT)，單位: 秒; ⑤進(jìn)入閉臂路程(Close arm Tracking，CTR) ; ⑥進(jìn)入開臂路程(Open arm Tracking，OTR) 。由①～⑥分別計算出：進(jìn)入開臂和封臂的總次數(shù)(OE+CE)；進(jìn)入開臂次數(shù)比例(OE%)，即OE/(OE+CE)×100%；進(jìn)入閉臂次數(shù)比例(CE%)，即CE/(OE+CE)×100%；開臂停留時間比例(OT%)，即OT/(OT+CT)×100%；閉臂停留時間比例(CT%)，即CT/(OT+CT)×100%；進(jìn)入開臂路程比例(OTR%)，即OTR/(OTR+CTR)×100%；進(jìn)入閉臂路程比例(CTR%)，即CTR/(OTR+CTR)×100%。

圖1 高架十字迷宮試驗

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 小鼠進(jìn)入不同臂的次數(shù)

高壓氧組小鼠閉臂進(jìn)入次數(shù)及進(jìn)臂總次數(shù)較對照組小鼠顯著增加(P<0.05)。兩者開臂進(jìn)入次數(shù)無明顯差異(P>0.05)；開臂進(jìn)入次數(shù)占總進(jìn)臂次數(shù)百分比與閉臂進(jìn)入次數(shù)占總進(jìn)臂次數(shù)百分比，兩者之間無明顯差異(P>0.05)。

表1 小鼠進(jìn)入不同臂的次數(shù) 次)

注：1)與對照組比較有顯著差異，P<0.05

2.2 小鼠在不同臂的運動路程及總路程

與對照組相比較，高壓氧組小鼠在開臂的路程顯著減少(P< 0.05)，在閉臂的路程顯著增加(P< 0.05)，開臂總路程與閉臂總路程兩者無明顯差異(P>0.05)；高壓氧組小鼠的開臂路程占總路程百分比顯著小于對照小鼠的開臂路程占總路程百分比(P< 0.05)，高壓氧組小鼠的閉臂路程占總路程百分比顯著大于對照小鼠的閉臂路程占總路程百分比(P< 0.05)。

高壓氧組(n=9)對照組(n=13)OTR472.89±380.121)1 549.89±947.39CTR3 412.29±837.771)2 568.35±631.36OTR+CTR3 885.18±680.044 118.23±903.22OTR/ OTR+CTR(%)12.78±10.681)36.06±17.01CTR/ OTR+CTR(%)87.22±10.681)63.94±17.01

注：1)與對照組比較有顯著差異，P<0.05

2.3 小鼠在不同臂的停留時間

高壓氧組小鼠的開臂停留時間顯著小于對照小鼠的開臂停留時間(P< 0.05)，高壓氧組小鼠的閉臂停留時間顯著大于對照小鼠的閉臂停留時間(P< 0.05)；高壓氧組小鼠的開臂停留時間占各臂總停留時間百分比顯著小于對照小鼠的開臂停留時間占各臂總停留時間百分(P< 0.05)，高壓氧組小鼠的閉臂停留時間占總停留時間百分比顯著大于對照小鼠的閉臂停留時間占總停留時間百分比(P< 0.05)。

高壓氧組(n=9)對照組(n=13)OT39.88±28.231)97.00±57.62CT164.48±33.961)118.13±48.98OT/OT+CT(%)19.79±14.181)43.72±18.99CT/ OT+CT(%)80.21±14.181)56.28±18.99

注：1)與對照組比較有顯著差異，P< 0.05

注：A對照組；B高壓氧組(其中上、下為開臂區(qū)域,左、右為閉臂區(qū)域)

3 討論

動物行為學(xué)是研究動物的行動舉止的科學(xué)。它不僅包括明顯的運動如行走跑跳和飛翔等，也包括一些身體局部的細(xì)微反應(yīng)如注目、豎耳、立毛、發(fā)聲、變色、釋放 氣味等。本能行為、學(xué)習(xí)行為、母性行為、探究行為、性行為、群體的社會行為以及行為的生理機制和遺傳發(fā)育規(guī)律等都是動物行為學(xué)的主要研究內(nèi)容。個體動物的行為表現(xiàn)既由先天所決定，又受后天經(jīng)驗的左右。本能是遺傳貯存在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的固定行為模式，而學(xué)習(xí)能通過經(jīng)驗或練習(xí)使行為發(fā)生比較持久的臨時改變，原有的天賦不足以應(yīng)付，需用學(xué)習(xí)來修正行為反應(yīng)以達(dá)到適應(yīng)。行為學(xué)研究的深入，使人們更加了解動物以及它們與環(huán)境的相互作用。因此人們通過各種各樣的實驗方法的設(shè)計，從行為學(xué)、腦成像、電生理、組織化學(xué)及分子生物學(xué)角度試圖分析動物的認(rèn)知過程，意向過程及人的人格和個性。其中認(rèn)知過程包括了感覺、直覺、注意、學(xué)習(xí)、記憶和思維，意向過程包括情緒、情感、動機、意向、意志及意志行為等。雖然動物行為學(xué)實驗不能反映微觀機制，但能觀察多因素混合作用對動物的綜合影響，可以反映動物整體狀態(tài)。盡管實驗醫(yī)學(xué)的研究不斷應(yīng)用各種先進(jìn)的科技手段，從宏觀到微觀，從整體到局部，從行為到基因，不同層次的研究廣泛展開，而動物行為學(xué)依然是研究者評估動物神經(jīng)系統(tǒng)變化的主要指標(biāo)。

行為學(xué)評估的內(nèi)容有很多方面，主要包括動物的自主行為、肌力及協(xié)調(diào)運動能力、學(xué)習(xí)與記憶能力等，而高架十字迷宮是評價嚙齒類動物焦慮反應(yīng)的重要實驗方法[12]。小鼠既有面對新事物想去探究的好奇心, 又有嗜暗的天性, 高懸的高架十字迷宮開臂如同懸崖, 易導(dǎo)致小鼠產(chǎn)生恐懼，不安。利用動物對新異環(huán)境的探究特性和對高懸開放臂的恐懼心理，形成動物的矛盾沖突狀態(tài)，反映動物的焦慮情緒[13]。通過比較小鼠在開臂和閉臂內(nèi)的滯留時間和路程來評價小鼠的焦慮行為，進(jìn)臂總次數(shù)與進(jìn)入閉臂次數(shù)可以整體評價小鼠的活躍程度；小鼠進(jìn)出各區(qū)域活動的時間和路程反映小鼠對環(huán)境的探索及興奮程度，小鼠走動的路程越多，說明小鼠的探索行為越多，興奮性越強[14- 15]。本實驗的高架十字迷宮行為實驗數(shù)據(jù)采集采用攝像機拍動物活動的錄像，結(jié)合計算機記錄、分析系統(tǒng)，用SMART v2.5.21軟件分析錄像來處理數(shù)據(jù)，比以往人工觀察更加客觀，靈敏。本實驗采用的計算機圖像分析技術(shù)能動態(tài)分析動物在高架十字迷宮的活動軌跡，可以客觀提取定量數(shù)據(jù)，可以更加全面地評價動物活動特點，并為病理狀態(tài)的分析提供了有用的基礎(chǔ)。

我們實驗結(jié)果表明，高壓氧能改變FVB小鼠高架十字迷宮行為的表型。其中，高壓氧組小鼠進(jìn)入閉臂次數(shù)及進(jìn)臂總次數(shù)較對照組小鼠顯著增加(P<0.05)，說明高壓氧組小鼠活力增加。與對照組相比較，高壓氧組小鼠在開臂的路程、開臂路程占總路程百分比、開臂停留時間及開臂停留時間占各臂總停留時間百分比都顯著減少(P<0.05)；而在閉臂的路程、閉臂路程占總路程百分比、閉臂停留時間及閉臂停留時間占總停留時間百分比都顯著增加(P< 0.05)，開臂總路程與閉臂總路程兩者無明顯差異(P> 0.05)，說明高壓氧組小鼠興奮性不變，對環(huán)境的認(rèn)知能力增強，對危險情況意識增強，焦慮感增加，小鼠會主動選擇“安全”閉臂，避開高懸“危險”的開臂。綜上所述，經(jīng)過高壓氧干預(yù)的小鼠高架十字迷宮的行為的改變都更符合小鼠的天性，這可能更有利于其在自然界的生存。

以往的實驗證明高壓氧有增加血漿溶解氧， 從而增加腦組織的氧供的作用[16]，劉仕成等人[17]證實高壓氧可以降低細(xì)胞因子IL-1β、IL-6、IL-10 的水平，對外周及中樞神經(jīng)系統(tǒng)起抗炎作用從而改善孤獨癥大鼠的生長發(fā)育及社會行為；高壓氧治療對下調(diào)Nogo-A及NgR表達(dá)是促進(jìn)中樞神經(jīng)再生的機制之一[18]；徐淳等證實間歇高壓氧暴露可以促進(jìn)小鼠腦組織中Prx 6的含量增加，從而增強組織的抗氧化能力[19]；趙宏等人[20]證實高壓氧治療可有效改善缺氧缺血性腦病新生兒的氧化應(yīng)激狀態(tài)及腦血流狀態(tài)；劉岱等人[4]證實高壓氧可以有效減輕氧化應(yīng)激損傷和炎癥反應(yīng),改善重型顱腦損傷患者血管內(nèi)皮細(xì)胞功能,降低顱內(nèi)壓。所以本實驗中高壓氧干預(yù)改變正常生理狀態(tài)下FVB小鼠高架十字迷宮行為的表型,可能與其促進(jìn)腦組織的有氧代謝和能量合成,使腦組織獲得更豐富的營養(yǎng)物質(zhì),使神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)的酶活性增強,降低氧自由基、炎癥因子,進(jìn)而保護腦組織細(xì)胞功能有關(guān)。

齊玲等人[21]在2.3ATA， 2.5ATA和2.8ATA不同的高壓氧治療壓力急性一氧化碳中毒療效觀察中發(fā)現(xiàn)2.8ATA首次治療壓力可縮短中重度急性一氧化碳中毒的促醒時間,減少遲發(fā)性腦病的發(fā)生,提高治愈率；陳玉燕等人[22]在1.8ATA， 2.0ATA和2.2ATA不同壓力高壓氧對實驗性腦出血大鼠出血灶周圍水腫及水通道蛋白4表達(dá)的影響研究中發(fā)現(xiàn)2.0ATA壓力治療效果優(yōu)于1.8ATA及2.2ATA，而臨床實驗證明較長時間吸入 60-200 kPa 的氧氣，會導(dǎo)致肺型氧中毒，吸入 200 kPa 以上的氧氣會導(dǎo)致驚厥型氧中毒[23]，提示臨床應(yīng)用中在高壓氧的安全壓力范圍內(nèi)應(yīng)該還存在最有效壓力。

行為學(xué)實驗受溫度、光照、噪音及操作人員氣味等影響因素較多，在不同實驗室的結(jié)果可能有較大差異。近年來，隨著計算機技術(shù)的發(fā)展，高架十字迷宮實驗結(jié)合計算機數(shù)字化采樣和分析技術(shù)，可自動記錄小鼠自發(fā)活動的全過程，并分析其運動軌跡，得到一系列行為學(xué)指標(biāo)，使實驗更加高效、客觀。過去通過目測小鼠在高架十字迷宮里的活動過程研究小鼠行為學(xué)的傳統(tǒng)方法，只能夠計算小鼠在高架十字迷宮里進(jìn)入各個區(qū)域的次數(shù)，無法記錄小鼠的活動軌跡，更無法目測小鼠的行動速度、路程，而且也會因目測者主觀因素而產(chǎn)生很大的誤差，達(dá)不到滿意的空間分辨率或時間分辨率。本實驗采用計算機圖像分析技術(shù)自動識別小鼠的運動軌跡，并結(jié)合了計算機記錄、分析系統(tǒng)，較以往主觀定性人工觀察方法更加客觀、靈敏，可以提取客觀定量數(shù)據(jù)，可以更加全面地評價小鼠高架十字迷宮活動特點，為下一步的研究提供了有用的基礎(chǔ)。高壓氧對FVB小鼠高架十字迷宮行為影響的作用機制還值得進(jìn)一步探討。

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