邱錦忠

(沃特世科技(上海)有限公司, 上海 201206)

Waters公司超高效液相色譜儀配置高靈敏度質(zhì)譜儀組成了LC-MS/MS系統(tǒng),被廣泛應(yīng)用于臨床診斷(IVD)、藥物分析及有機(jī)化合物分析。部分使用單位發(fā)現(xiàn)在新生兒篩查系統(tǒng)、維生素D檢測(cè)或其他血液/蛋白質(zhì)類樣本檢測(cè)時(shí),I-Class FTN進(jìn)樣器易發(fā)生壓力高/堵塞現(xiàn)象,影響正常使用。本文從原理入手,根據(jù)故障排查流程圖,幫助使用者判斷問題所在,讓實(shí)驗(yàn)人員自己動(dòng)手解決部分問題。文中探討了FTN進(jìn)樣器壓力高/堵塞問題發(fā)生的部分原因,供實(shí)驗(yàn)人員參考。

1 I-Class FTN組成及特點(diǎn)

組成 二元溶劑管理器(BSM),支持最高耐壓18 000 psi(約為124 MPa, 1 MPa≈145 psi,下文不一一換算);樣品管理器(SM-FTN),不銹鋼進(jìn)樣針,溫控4～40 ℃;柱溫控制器(Col HT):室溫～90 ℃;檢測(cè)器:質(zhì)譜檢測(cè)器(與Xevo TQD組成LC-MS/MS或新生兒篩查系統(tǒng))或二極管陣列(PDA)/紫外可見光(TUV)組成普通UPLC系統(tǒng)。

特點(diǎn) 由于使用超高壓設(shè)計(jì),系統(tǒng)擴(kuò)散極小(93 μL),使用ID=0.003″ NP35不銹鋼管,故其系統(tǒng)壓力較常規(guī)HPLC高。

2 UPLC系統(tǒng)壓力高/堵塞故障排查流程圖

3 故障排查實(shí)驗(yàn)所用溶劑及工具

色譜級(jí)乙腈;超純水;100 mL燒杯;1/2″、1/4″、16/5″雙開口扳手;2 mm內(nèi)六角螺絲刀;T6、T10、T20梅花頭螺絲刀;一次性無粉手套一盒;超聲波清洗器一臺(tái)。

圖 1 (a)六通閥進(jìn)樣(inject)位置和(b)六通閥上樣加載(load)位置

4 利用控制臺(tái)功能判斷或定位FTN進(jìn)樣器堵塞的部位

I-Class控制臺(tái)交互界圖二元溶劑管理器(BSM)的功能包括流速控制、溶劑灌注和漏液壓力檢測(cè);控制臺(tái)交互界圖樣品管理器(SM-FTN)的功能包括進(jìn)樣針密封測(cè)試、進(jìn)樣針高度校正、六通進(jìn)樣閥(簡(jiǎn)稱:六通閥)流路壓差檢測(cè)和閥手動(dòng)切換。

FTN進(jìn)樣器發(fā)生堵塞的地方常見有進(jìn)樣針(sample needle)、針座(needle seal)、針座到六通閥的回流管路(seal extension tube)及六通閥(injector),可通過切換六通閥位置來快速隔離發(fā)生堵塞的地方。啟動(dòng)二元溶劑管理器流速,確認(rèn)針處于針座內(nèi),進(jìn)入到控制臺(tái)FTN的交互界面,手控切換六通閥的位置并記錄壓力,如果進(jìn)樣(inject)位置(圖1a)比上樣加載(load)位置(圖1b)壓力高很多(常規(guī):系統(tǒng)壓力是69.0 MPa(10 000 psi), inject位置壓力比load位置高2.8 MPa(400 psi)左右),可以判斷針、針座、針座回流管路及六通閥中的某些部位發(fā)生堵塞。(請(qǐng)參考ACQUITY UPLC I-Class IVD Sample Manager-Flow Through Needle Overview and Maintenance Guide 715003737IVD。Waters公司官網(wǎng)http://www.waters.com。)

5 如何判斷針堵

先將六通閥上4#口的針螺絲擰開,啟動(dòng)二元溶劑管理器,設(shè)定0.5 mL/min 100%乙腈,將FTN的門打開,進(jìn)入Acquity UPLC控制臺(tái),點(diǎn)FTN模塊的reset讓FTN進(jìn)行自檢,自檢完后FTN會(huì)將針停在樣品盤上方而非針座里面,此時(shí)進(jìn)入到FTN控制臺(tái)的交互模式,點(diǎn)控制,手控,將閥位置切換到進(jìn)樣(inject)狀態(tài),此時(shí)如果壓力很小(40 psi左右),說明六通閥的4#-5#口沒有發(fā)生堵塞;此時(shí)再將針連到4#口,如果壓力仍然很小(40 psi左右)且肉眼能見液體順利從針尖滴下,說明針未發(fā)生堵塞,如果壓力高,說明針已發(fā)生堵塞。

圖 2 (a)門擋板移除、(b)松開六通閥的4#口針、(c)松開針鎖定銷、(d)松開卡位銷和(e)進(jìn)樣針的示意圖

5.1 拆進(jìn)樣針步驟

在Acquity UPLC控制臺(tái)界面,點(diǎn)Maintain>Replace>Needle。(1)開FTN門,擰松鎖定螺絲(見圖2a,紅圈位),移除擋板;(2)松開六通閥的4#口針(見圖2b,紅圈位); (3)針鎖定銷(needle latch)逆時(shí)針轉(zhuǎn)動(dòng)(見圖2c,左圖黑色箭頭),將針從導(dǎo)管中移出;(4)松開卡位銷(圖2d紅箭頭位),將針取出(見圖2d及圖2e)。

5.2 針壓力高/堵塞解決方案

高壓沖洗:將針拆下,移至FTN外面,放入量筒或燒杯內(nèi),針可重新連接4#口,啟動(dòng)I-Class二元溶劑管理器,流速可逐漸增大,直到泵壓上升至10 000～15 000 psi,通?？蓪⒍氯餂_出。換針:建議將原15 μL進(jìn)樣針改換成30 μL針,針體積增大一倍,針內(nèi)徑自然增大,堵塞風(fēng)險(xiǎn)就會(huì)降低。

6 判斷針座及針座回流管路堵

打開FTN的門,在控制臺(tái)上點(diǎn)FTN reset,將針停留在樣品盤上方而非針座;將6#口螺絲擰開,啟動(dòng)二元溶劑管理器,設(shè)定0.5 mL/min 100%乙腈,六通閥處于加載(load)位置,如果壓力低(40 psi左右),說明5#-6#口沒有發(fā)生堵塞;將針座回流管路1#口螺絲擰到6#口,如果壓力低,說明針座和針座回流管路通暢,如果壓力高則說明針座或/和針座回流管路堵。如果判斷是針座或/和針座管回流路堵,需要將FTN針座拆出,再反沖針座回流管路,如果壓力較小,說明針座回流管路暢通,是針座堵,如果壓力仍然很高,說明針座回流管路堵。

7 處理針座及針座回流管路堵

圖 3 (a)清洗臺(tái)分解及(b)針座取出示意圖

針座反沖處理:將FTN門打開,在控制臺(tái)中,點(diǎn)FTN重設(shè)(reset),讓FTN完成自檢,使得針處于樣品盤之上而非針座內(nèi),將六通閥上的6#口管線擰開,將針座回流管路1#口螺絲擰開接到6#口上,啟動(dòng)二元溶劑管理器,設(shè)定流速進(jìn)行反沖,建議先使用小流速(0.1 mL/min),逐漸加大流速,直到壓力正常為止。

針座回流管路反沖:可按針座反沖步驟處理,也可將針座取出后再反沖,如反沖無效,則需要更換針座管路。

拆針座:在I-Class控制臺(tái),選擇Maintain>Replace>Seal。(1)開FTN門,將前擋板移除;(2)卸清洗臺(tái)鎖定螺絲;(3)取出清洗臺(tái)并分離座組件(見圖3a); (4)取出針座(seal)(見圖3b)。

針座超聲處理:將針座取出,放入燒杯,加入超純水超聲20 min,棄去液體,然后加入甲醇-水(90∶10, v/v)超聲20 min,取出針座,安裝好,反沖,如果仍然無法將壓力降到正常水平,則需要更換針座。

8 六通閥堵塞判斷及清洗

堵塞判斷及反沖:先將六通閥上4#口及5#口的針螺絲擰開,啟動(dòng)二元溶劑管理器,設(shè)定0.5 mL/min 100%乙腈,將FTN的門打開,進(jìn)入到FTN控制臺(tái)的交互模式,點(diǎn)控制,手控,將閥位置切換到進(jìn)樣(inject)狀態(tài),此時(shí)如果壓力很小(40 psi左右),說明六通閥的4#-5#口間沒有發(fā)生堵塞,反之堵塞;切換到上樣(load)狀態(tài),如果壓力很小(40 psi左右)說明六通閥的5#-6#口間沒有發(fā)生堵塞,反之堵塞;若堵塞,可將5#口管路連接4#或6#口,啟動(dòng)二元溶劑管理器,設(shè)定流速由0.2 mL/min慢慢增大,直至壓力為15 000 psi,反沖,如果沒沖通,則按下列方法清洗六通閥。

清洗:進(jìn)入FTN控制臺(tái),在界面頂部選中Maintain,下拉菜單選中Park needle and injector valve,并點(diǎn)擊,使六通閥進(jìn)樣器處于初始可拆下位置,用T10螺絲刀擰下10點(diǎn)鐘位螺絲,取下六通閥,用T20螺絲刀分別擰下2點(diǎn)鐘位、6點(diǎn)鐘位及10點(diǎn)鐘位螺絲,分別取下定子(stator)(Waters獨(dú)特設(shè)計(jì)定子與定子面組件集成一體化為不斷流六通閥)及密封轉(zhuǎn)子(rotor seal),并將這2個(gè)部件放入燒杯,純水超聲30 min,對(duì)光目測(cè)檢查這2個(gè)部件孔是否導(dǎo)通,或?qū)⒍軇┕芾砥鞒隹诠苈分苯舆B接到六通閥定子的每個(gè)入口,高壓沖洗檢查,直至定子端口全部導(dǎo)通。在確認(rèn)定子端口全部正常、密封轉(zhuǎn)子沒被損壞后,按原位組裝回去,此時(shí)切勿將密封轉(zhuǎn)子面方向搞錯(cuò),密封轉(zhuǎn)子位置是唯一的,用手?jǐn)Q緊鎖定定子的3顆螺絲,然后用T20螺絲刀慢慢交替均衡加力鎖緊,確保其在18 000 psi壓力下不滲液。

9 針座、進(jìn)樣針及針座回流管路堵塞的原因

9.1 針座堵

將堵塞針座拆下,用放大鏡觀察,在針座seal處發(fā)現(xiàn)有:(1)黑色黏稠的物質(zhì)(膠),見圖4;(2)發(fā)光亮的錫箔紙/鋁箔紙;(3)雜質(zhì)顆粒。

經(jīng)與使用者溝通探討,分析故障源如下:

*黑色黏稠物質(zhì)(膠)是用戶使用不當(dāng)導(dǎo)致96孔板覆蓋膜或密封膠吸入所致。

*樣品中的有機(jī)溶劑(例:甲醇)揮發(fā)溶解錫箔紙/鋁箔紙上的膠,使之回流到樣品孔內(nèi)。

*發(fā)光亮的錫箔紙/鋁箔紙是用戶使用劣質(zhì)的錫箔紙/鋁箔紙所致。FTN的進(jìn)樣針尖是平口的,針尖吸樣,當(dāng)針插入96孔板時(shí),密封板的錫箔紙/鋁箔被快速刺穿時(shí),易產(chǎn)生碎片并沉入樣品孔底部,再被吸入針內(nèi),注入針座(已有維修案例證實(shí))。建議使用高品質(zhì)的96孔樣品盤覆蓋膜,覆蓋膜應(yīng)富有彈性、韌性且質(zhì)地較厚。

*雜質(zhì)顆粒疑似流動(dòng)相沒過濾、血液樣品中的蛋白質(zhì)凝固或是溶液中的鹽析出。建議實(shí)驗(yàn)室采購高品質(zhì)的有機(jī)試劑/水。

*環(huán)境中的灰塵有可能會(huì)被引入到樣品中。需保證實(shí)驗(yàn)室環(huán)境清潔,不開窗。

*過濾流動(dòng)相的濾膜品質(zhì)較差。建議實(shí)驗(yàn)室采購高品質(zhì)過濾膜。

9.2 進(jìn)樣針或針座回流管路堵

圖 5 (a)96孔樣品板和(b)2 mL樣品瓶

(1)儀器和方法設(shè)定方面的原因:血樣中的蛋白質(zhì)等物質(zhì)的沉淀,吸樣時(shí)被吸入到進(jìn)樣器內(nèi),這主要是樣品處理不到位,進(jìn)樣濃度高所致。建議降低進(jìn)樣濃度,提高針位置,降低吸樣速率和進(jìn)樣量,避免吸入底部可能存在的沉淀物。96孔樣品板(圖5a)與48孔托盤2 mL樣品瓶(圖5b)缺省設(shè)定針尖與瓶底距離分別為2 mm與4 mm,我們可設(shè)定96孔板此距離為4 mm,將針上提2 mm。

(2) FTN洗針時(shí),無法清洗到插入到針座needle seal部位。該部位可能有少量殘留的樣品中的蛋白質(zhì),隨著進(jìn)樣次數(shù)增多,逐漸堵塞針座。建議定時(shí)將針座超聲清洗。

10 結(jié)語

一般而言,Waters UPLC及LC-MS/MS新篩系統(tǒng)中所使用的I-Class FTN進(jìn)樣器壓力高/堵塞是使用中的技術(shù)問題造成的;我們分析了各種堵塞原因,為實(shí)驗(yàn)人員提供了故障排查思路及自己動(dòng)手解決方案。我們期待上述內(nèi)容能幫助實(shí)驗(yàn)人員使用好現(xiàn)有的儀器,充分發(fā)揮儀器的卓越性能,保證測(cè)試數(shù)據(jù)準(zhǔn)確可靠,減少宕機(jī)時(shí)間及維修次數(shù),節(jié)省使用成本。