梁啟慧, 楊 奕, 邵 兵, 高 也, 宋 宇, 韓南銀*

(1, 北京大學(xué)藥學(xué)院, 北京 100191; 2, 北京疾病預(yù)防控制中心, 北京 100013)

非對稱場流分離技術(shù)(asymmetrical flow field-flow fractionation, AF4)是目前可信賴的納米顆粒分離和表征方法,尤其適合表征多分散的顆粒尺寸分布,且條件溫和無損[1]。AF4和多種檢測器聯(lián)用,例如多角度激光散射檢測器、紫外/可見分光光度計(jì)、熒光檢測器等,可以在線監(jiān)測物質(zhì)尺寸和濃度信息。

圖 1 AF4儀器通道中分離過程示意圖Fig. 1 Schematic of the asymmetrical flow field-flow fractionation (AF4) channel showing processes during analysis

AF4技術(shù)全過程最重要的一步是分析物在通道中的分離。分離在一個(gè)薄的領(lǐng)帶形的通道中進(jìn)行,見圖1。進(jìn)入通道的載液流分成兩部分,一部分沿著通道自入口向出口方向移動(dòng)(inflow),另一部分垂直于主體載液的液流,叫作交叉流(cross flow)。交叉流穿過通道底部一定截留分子量的可滲透超濾膜,并產(chǎn)生力場使分析物向膜方向移動(dòng)[2,3]。在非對稱流場流分離系統(tǒng)中,松弛過程也叫作聚焦-松弛(focusing-relaxation)過程,從入口處和出口處進(jìn)入通道的載液會(huì)在通道入口附近進(jìn)行聚焦-松弛,這一位置也叫作聚焦點(diǎn)(focusing point),在此期間,樣品停止遷移;樣品受到擴(kuò)散作用(diffusion effect)和交叉流流場兩種作用力影響并在通道橫截面上某個(gè)位置達(dá)到平衡。顆粒距離積累壁的距離取決于顆粒的擴(kuò)散系數(shù)和自身的尺寸大小。尺寸較大的顆粒,擴(kuò)散系數(shù)較小,距離積累壁的距離較近,保留時(shí)間較長。

在AF4的應(yīng)用過程中,經(jīng)常遇到的問題是被分析蛋白質(zhì)的膜吸附和聚集作用。膜吸附作用使蛋白質(zhì)在通道中產(chǎn)生質(zhì)量損失,浪費(fèi)了珍貴的樣品,不利于定量。蛋白質(zhì)的聚集作用使不同蛋白質(zhì)之間的分離變得困難,不利于蛋白質(zhì)產(chǎn)品的質(zhì)量控制。

本實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)地研究了不同pH、陰離子和陽離子的載液組成對目標(biāo)蛋白質(zhì)卵白蛋白在AF4分離過程中膜吸附和聚集行為的影響;分析蛋白質(zhì)在不同溶液環(huán)境下表面電荷、尺寸大小等因素的改變,比較不同載液條件下蛋白質(zhì)的行為。希望通過本實(shí)驗(yàn)可以找到AF4分析蛋白質(zhì)的最佳載液組成條件,最大限度地減少膜吸附和聚集行為,避免蛋白質(zhì)在通道中的損失。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

非對稱流場流分離儀購自美國懷亞特(Wyatt)公司,型號為Eclipse AF4,和安捷倫1200系列四元泵、脫氣裝置和自動(dòng)進(jìn)樣器連接,在線聯(lián)用Agilent 1200 UV/Vis檢測器(美國安捷倫公司)。Zetasizer Nano儀器來自英國馬爾文公司,超純水系統(tǒng)來自美國Millipore公司。

卵白蛋白凍干粉購自德國Sigma-Aldrich公司,除非特別說明,蛋白質(zhì)樣品均溶解于超純水(18.2 MΩ5cm)中。NaCl、MgCl2、KCl、Na2HPO4512H2O、NaH2PO452H2O、HCl、NaOH、磷酸均為分析純,來自于美國Fisher Scientific公司。100 mmol/L磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer, PB)的制備方法為:約29 g Na2HPO4512H2O和3 g NaH2PO452H2O溶解于1 L超純水中,用磷酸調(diào)節(jié)pH至7.4,經(jīng)0.2 μm濾膜過濾備用。不同種類和濃度的鹽中加入10 mmol/L磷酸鹽緩沖液調(diào)節(jié)離子強(qiáng)度,按照相應(yīng)配方使用超純水配制后,經(jīng)0.2 μm濾膜過濾備用。

1.2 實(shí)驗(yàn)條件

1.2.1AF4條件

AF4實(shí)驗(yàn)中設(shè)定紫外檢測器檢測波長為215 nm。通道的幾何參數(shù)為:長度153 mm,最大寬度為22 mm;使用350 μm墊片作為通道厚度,截止分子質(zhì)量30 kD再生纖維素膜作為積累壁膜。所有的樣品,除非特別指明,均使用表1的流速條件進(jìn)行洗脫。

表 1 AF4實(shí)驗(yàn)的洗脫條件

所有載液在使用前經(jīng)過0.2 μm膜過濾,當(dāng)天配制。載液組成變化如表2所示。選用10 mmol/L磷酸緩沖液作為空白對照,加入不同種類和濃度的鹽,考察載液組成的影響。在進(jìn)樣前,載液先沖洗、平衡通道至少30 min,確保通道的潔凈和實(shí)驗(yàn)重復(fù)性。儀器操作和數(shù)據(jù)處理均使用安捷倫Openlab軟件。

表 2 AF4中使用的不同載液(CF)組成

PB: phosphate buffer.

樣品溶液的進(jìn)樣量為20 μL,卵白蛋白水溶液的質(zhì)量濃度均為2 mg/mL,新鮮配制使用,并在4 ℃保存。

1.2.2zeta電位和水合半徑的測定

卵白蛋白凍干粉溶解于相應(yīng)的緩沖液中,質(zhì)量濃度為2 mg/mL。每次測定結(jié)果都是50次重復(fù)測試的平均值。

1.2.3吸附行為表征——相對回收率(RR)

樣品與通道中膜的相互作用使樣品保留在通道膜上,造成質(zhì)量損失。為了研究AF4分離過程中蛋白質(zhì)的膜吸附現(xiàn)象,改變載液的組成。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,隨著膜使用時(shí)間的延長,膜老化加劇,相應(yīng)的樣品回收率逐漸下降。所以日間結(jié)果之間直接比較是不科學(xué)的。因此,每天先以10 mmol/L磷酸鹽緩沖液為載液進(jìn)行對照實(shí)驗(yàn),紫外信號的峰面積定義為A*。同一天時(shí)間內(nèi),蛋白質(zhì)在其余的載液條件下進(jìn)樣,所得到的峰面積為A。以兩者的百分比計(jì)算相對回收率:

RR=A/A*×100%

(1)

其中,峰面積A、A*為3次連續(xù)進(jìn)樣所得峰面積的平均值。相對回收率避免了由于膜老化造成的日間回收率差異。

1.2.4聚集行為表征——多聚體占比(P)

如圖2所示,在高離子強(qiáng)度的條件下,紫外圖譜中雙峰的特征更加明顯。多聚體所占的比值由多聚體的峰面積占總峰面積的比值表示:

(2)

其中P1是單體峰面積,P2是聚合物峰面積。

圖 2 不同濃度磷酸鹽緩沖液時(shí)的卵白蛋白AF4-UV流出圖Fig. 2 AF4-UV fractograms of ovalbumin with various concentrations of phosphate buffer

2 結(jié)果與討論

2.1 不同載液條件對卵白蛋白吸附和聚集行為的影響

2.1.1pH的影響

因?yàn)樯锏鞍踪|(zhì)的生理最佳pH條件為7.4,為了保持蛋白質(zhì)的活性,在總離子濃度為10 mmol/L的PB中,于pH 7.4左右小范圍內(nèi)取兩個(gè)pH值6.2和8.2,研究pH對卵白蛋白AF4通道中行為的影響(見圖3)。在3種pH條件下,AF4的流出圖中蛋白質(zhì)的保留時(shí)間沒有明顯變化,說明卵白蛋白的尺寸和分子大小在3種pH條件下沒有太大改變。從相對回收率來看,載液pH為6.2時(shí)的卵白蛋白相對回收率明顯低于pH為7.4和8.2時(shí)的相對回收率。3種條件下均有聚集行為發(fā)生,多聚物占總蛋白質(zhì)的比例都高于35%。其中,pH 6.2時(shí),多聚物比例最高,接近45%。通過動(dòng)態(tài)光散射檢測到3種pH下蛋白質(zhì)的zeta電位都在-5 mV左右,zeta電位隨pH變化不大。

圖 3 不同載液pH時(shí)卵白蛋白的(a)相對回收率和多聚物比例及(b)zeta電位(n=3)Fig. 3 (a) Relative recovery (RR), aggregate proportion (P), and (b) the zeta potential plot of ovalbumin with various pH (n=3)

2.1.2陰離子類型和濃度的影響

圖 4 不同濃度的磷酸鹽緩沖液時(shí)卵白蛋白的(a)相對回收率和多聚物比例及(b)zeta電位(n=3)Fig. 4 (a) Relative recovery, aggregate proportion, and (b) the zeta potential plot of ovalbumin with various concentrations of phosphate buffer (n=3)

不同濃度的PB對通道中蛋白質(zhì)行為的影響見圖4。10、20、50 mmol/L的PB中離子強(qiáng)度依次升高,得到的蛋白質(zhì)RR依次降低,其中從10到20 mmol/L下降幅度最大,從100%直接降至約50%。計(jì)算得到的P與磷酸根離子強(qiáng)度成正比關(guān)系,從折線圖斜率來看,與相對回收率結(jié)果相似,濃度從10到20 mmol/L的增加導(dǎo)致多聚物占比大幅度增高。zeta電位絕對值的減小和離子強(qiáng)度的增加呈近似線性關(guān)系。

Cl-及其濃度對卵白蛋白行為的影響見圖5。NaCl濃度從0上升到10 mmol/L的過程中,卵白蛋白的RR和P的絕對值變化最大;而從50到100 mmol/L過程里,RR和P值幾乎不變。由動(dòng)態(tài)光散射測得不同濃度下的卵白蛋白zeta電位均在-6 mV左右,變化不大(變化幅度小于4 mV),電位絕對值整體呈下降趨勢。

圖 5 不同濃度的NaCl時(shí)卵白蛋白的(a)相對回收率、多聚物比例及(b)zeta電位(n=3)Fig. 5 (a) Relative recovery, aggregate proportion,and (b) the zeta potential plot of ovalbumin with various concentrations of NaCl (n=3)

圖 6 不同濃度的磷酸根和Cl-時(shí)卵白蛋白的(a)相對回收率、(b)多聚物比例及(c)zeta電位(n=3)Fig. 6 (a) Relative recovery, (b) aggregate proportion,(c) the zeta potential plot of ovalbumin with various phosphate and chloride concentrations (n=3)

圖 7 Na+、K+濃度不同時(shí)卵白蛋白的(a)相對回收率、(b)多聚物比例及(c)zeta電位(n=3)Fig. 7 (a) Relative recovery, (b) aggregates proportion,(c) the zeta potential plot of ovalbumin with various Na+ and K+ concentrations (n=3)

2.1.3陽離子類型和濃度的影響

10 mmol/L的PB中加入一價(jià)的Na+、K+,濃度分別為1、5、10 mmol/L,調(diào)節(jié)pH到7.4。由圖7中看出,RR的總體趨勢為:K+Na+。Na+、K+的RR和P曲線均接近,這點(diǎn)在zeta電位圖中也得到證明。相同濃度下Na+和K+的zeta電位相差不大,說明對于同一價(jià)態(tài)的陽離子溶液,離子強(qiáng)度是最主要的影響因素。在含Mg2+的磷酸緩沖液中,蛋白質(zhì)zeta電位(-4.02 mV)的絕對值小于一價(jià)陽離子(Na+、K+)溶液。

2.2 蛋白質(zhì)在通道中的膜吸附行為

在非對稱流場流分離中,垂直于通道方向的交叉流把蛋白質(zhì)帶到靠近再生纖維素(regenerated cellulose, RC)膜的積累壁區(qū)域。蛋白質(zhì)分子的布朗運(yùn)動(dòng)引發(fā)顆粒之間和顆粒、膜之間的碰撞反應(yīng),增加了蛋白質(zhì)吸附在膜上的可能性[5]。

蛋白質(zhì)和膜的相互作用主要受到兩種力的影響:范德華力和靜電作用[6]。范德華力FvdW與R3/l2(2R+l)2呈正比,其中R是顆粒的半徑,l是顆粒表面到膜的距離[7]。依據(jù)文獻(xiàn)[8], RC膜因?yàn)轸然拇嬖?其pKa約為3.5。卵白蛋白的pI值為5.19,Mw為42 881。所以在本研究中使用載液pH 6.2、7.4、8.2的條件下,再生纖維素膜和卵白蛋白都帶負(fù)電,兩者之間存在著靜電排斥力Fel[9]:

(3)

其中k是波爾茲曼常數(shù),R和l與范德華力公式中的意義相同,T為溫度,ρ是介質(zhì)的密度,zi為離子價(jià)態(tài),e為單個(gè)電子的電位,δ為雙電子層的厚度,ζ為物質(zhì)的zeta電位。

pH的大小對膜表面zeta電位也有著重要影響,pH為6.8時(shí),膜的zeta電位最低[7],膜與物質(zhì)之間的排斥力變小,更易吸附,RR最低。

金屬陽離子的價(jià)態(tài)和形態(tài)大小影響蛋白質(zhì)分子的zeta電位和雙電子層的厚度,從而影響蛋白質(zhì)和膜之間的相互作用。一價(jià)陽離子Na+、K+的載液中,蛋白質(zhì)分子的zeta電位變化不大,蛋白質(zhì)吸附作用在K+載液條件下更明顯。在溶液中,金屬陽離子的水合半徑應(yīng)該Na+>K+,水合陽離子導(dǎo)致蛋白質(zhì)分子表面雙電子層的Stern層厚度增加,結(jié)合公式(3),Fel增大,排斥力增大;同時(shí)增加的分子外圍電子層厚度使蛋白質(zhì)相對遠(yuǎn)離積累壁表面,范德華吸引力減少,因此吸附現(xiàn)象減弱。二價(jià)陽離子Mg2+條件下,更高的化學(xué)價(jià)對分子的擴(kuò)散雙電層產(chǎn)生更大的壓迫力。另外,Mg2+溶液引起的蛋白質(zhì)分子表面zeta電位的下降明顯[11],因此Fel變大,蛋白質(zhì)和膜的吸附作用增強(qiáng);此外,從蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)來看,Mg2+與蛋白質(zhì)中的羧基易結(jié)合形成沉淀,導(dǎo)致膜吸附加劇。

蛋白質(zhì)在溶液中的吸附行為是一個(gè)相當(dāng)復(fù)雜的過程,取決于蛋白質(zhì)三維空間結(jié)構(gòu)、結(jié)構(gòu)硬性、穩(wěn)定性等諸多因素。所以,下一步應(yīng)該對蛋白質(zhì)在不同條件下的三維空間結(jié)構(gòu)及其穩(wěn)定性進(jìn)行測試研究,對吸附行為進(jìn)行更深入的解釋。

2.3 蛋白質(zhì)在通道中的聚集行為

溶液對蛋白質(zhì)聚集行為的影響較一般納米顆粒更加復(fù)雜,涉及蛋白質(zhì)的分子大小、構(gòu)象、穩(wěn)定性和功能等各個(gè)方面[12,13]。如2.1節(jié)所述,在實(shí)驗(yàn)中的載液條件下,所有蛋白質(zhì)表面攜帶負(fù)電荷。由動(dòng)態(tài)光散射(dynamic light scattering, DLS)測量結(jié)果顯示,所有條件下,蛋白質(zhì)的zeta電位均大于-30 mV,理論上溶液體系不穩(wěn)定,易形成聚集體。當(dāng)離子強(qiáng)度增加時(shí),蛋白質(zhì)表面絕對zeta電位降低,蛋白質(zhì)之間的靜電排斥力減少,傾向于形成聚集物。由DLS測得在1、5、10、50、100 mmol/L NaCl條件下,卵白蛋白的蛋白質(zhì)樣品分布系數(shù)(polydispersity index, PDI)從0.658增加到0.849,證明樣品在高離子強(qiáng)度下有著更廣的聚集物尺寸分布,對應(yīng)的AF4流出圖里的峰更寬。必須指出的是,在動(dòng)態(tài)光散射中蛋白質(zhì)的聚集度檢測環(huán)境和AF4通道中溶液環(huán)境相比要溫和許多;在一次典型的AF4洗脫過程中,分析物的濃度會(huì)經(jīng)歷大幅度的改變,最終出口端濃度稀釋了2至4倍[14],在場流分離過程中分析物還會(huì)受到載液流剪切力的影響,因此動(dòng)態(tài)光散射得到的PDI的結(jié)果還不能完全反映AF4過程中蛋白質(zhì)的聚集行為,但可以提供一個(gè)參考的變化趨勢。

鹽離子與蛋白質(zhì)中的帶電氨基酸的特殊作用是導(dǎo)致蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)構(gòu)象變化的原因之一。例如,有文獻(xiàn)[15]報(bào)道二價(jià)金屬離子Ca2+可以與卵白蛋白的特異位點(diǎn)結(jié)合。本實(shí)驗(yàn)中,含Mg2+溶液條件下得到的P(接近70%)高于含10 mmol/L Na+、K+載液條件下的P。在蛋白質(zhì)聚集行為研究中,二價(jià)Mg2+對蛋白質(zhì)的聚集有顯著的影響,為了得到均一單體的卵白蛋白,需要避免二價(jià)離子的加入;當(dāng)希望研究兩個(gè)或多個(gè)蛋白質(zhì)在AF4中的結(jié)合行為時(shí),二價(jià)Mg2+創(chuàng)造了極佳的溶液環(huán)境。

3 結(jié)論

蛋白質(zhì)在非對稱流場流分離系統(tǒng)中的膜吸附和聚集行為極大地限制了AF4的應(yīng)用和發(fā)展。本實(shí)驗(yàn)以卵白蛋白作為特征分析物,研究了不同載液條件對AF4分離過程中蛋白質(zhì)的膜吸附和聚集行為的影響;引入RR和P作為分析參數(shù),研究如何避免場流分離中不必要的蛋白質(zhì)樣品損失。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,載液的離子強(qiáng)度對卵白蛋白的吸附和聚集行為影響最大;載液的pH主要通過改變再生纖維素膜表面的zeta電位來影響膜與分子之間的靜電排斥力;二價(jià)陽離子Mg2+由于自身的金屬離子特性,極大地提高了聚集物比例。蛋白質(zhì)在溶液中的吸附和聚集行為是一個(gè)相當(dāng)復(fù)雜的過程,取決于蛋白質(zhì)的分子大小、構(gòu)象、穩(wěn)定性和功能等各個(gè)方面。后續(xù)實(shí)驗(yàn)可以從蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)的角度，借助計(jì)算機(jī)模擬技術(shù)更全面地理解蛋白質(zhì)在AF4通道中的行為。

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[1] von der Kammer F, Legros S, Hofmann T, et al. TrAC-Trends Anal Chem, 2011, 30(3): 425

[2] Zattoni A, Rambaldi D C, Reschiglian P, et al. J Chromatogr A, 2009, 1216(52): 9106

[3] Schmidt B, Loeschner K, Hadrup N, et al. Anal Chem, 2011, 83(7): 2461

[4] Schachermeyer S, Ashby J, Kwon M, et al. J Chromatogr A, 2012, 1264: 72

[5] Jochem A R, Ankah G N, Meyer L A, et al. Anal Chem, 2016: 10065

[6] Karaiskakis G, Douma M, Katsipou I, et al. J Liq Chromatogr R T, 2000, 23(13): 1953

[7] Ulrich A, Losert S, Bendixen N, et al. J Anal Atom Spectrom, 2012, 27(7): 1120

[8] Fras L, Laine J, Stenius P, et al. J Appl Polym Sci, 2004, 92: 3186

[9] Bolea E, LabordaF, Castillo J R. Anal Chim Acta, 2010, 661(2): 206

[10] Williams S K R, Schimpf M E, Caldwell K D, et al. Field-Flow Fractionation Handbook. New York: John Wiley & Sons, 2000

[11] Kirby B J, Hasselbrink E F. Electrophoresis, 2004, 25: 187

[12] Lan Q D, Bassi A S, Zhu J, et al. Chem Eng J, 2001, 81: 179

[13] Raghuraman H, Ganguly S, Chattopadhyay A. Biophys Chem, 2006, 124(2): 115

[14] Bria C R, Williams S K. J Chromatogr A, 2016, 1465: 155

[15] Stein P E, Leslie A G W, Finch J T, et al. J Mol Biol, 1991, 221: 941