曲 梅，黃 瑛，張 新，呂 冰，錢海坤，王全意

(北京市疾病預(yù)防控制中心 北京市預(yù)防醫(yī)學(xué)研究中心 食物中毒診斷溯源技術(shù)北京市重點實驗室，北京 100013)

沙門菌是一種重要的人畜共患病原菌，是引起感染性腹瀉和食源性疾患最重要的致病菌之一。隨著抗菌藥物的廣泛使用，沙門菌耐藥問題日趨嚴(yán)重，耐藥水平越來越高，多重耐藥菌的頻繁出現(xiàn)，已成為嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問題。β-內(nèi)酰胺類抗生素(β-lactam antibiotic)是指化學(xué)結(jié)構(gòu)中含β-內(nèi)酰胺環(huán)的一大類抗生素(主要包括青霉素類、頭孢菌素類、頭霉素類、單環(huán)內(nèi)酰胺類及其他非典型β-內(nèi)酰胺類抗生素)。產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶(extended-spectrum β-lactamases，ESBLs)是革蘭陰性菌耐藥最常見的機(jī)制，約占總耐藥機(jī)制的80%[1]。編碼ESBLs的基因分為blaTEM、blaCTX-M、blaOXA和blaSHV及其他5種基因型[2]，呈全球分布，可由染色體外的質(zhì)粒攜帶，通過融合、轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)化等機(jī)制在細(xì)菌間傳遞轉(zhuǎn)移，從而擴(kuò)大耐藥性的傳播與分布，引發(fā)感染暴發(fā)。目前，臨床上治療沙門菌感染性腹瀉，多使用β-內(nèi)酰胺類抗生素，因而對其耐藥的菌株也不斷出現(xiàn)。本研究對北京市臨床分離的非傷寒沙門菌株進(jìn)行藥物敏感性分析及ESBLs基因的檢測，為指導(dǎo)臨床合理使用抗菌藥物，控制沙門菌的流行和疾病傳播，有效應(yīng)對耐藥菌株的擴(kuò)散提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌株來源 2012—2015年在北京市7個監(jiān)測區(qū)縣選取17家腸道門診，每個監(jiān)測區(qū)縣每周采集10～15份急性感染性腹瀉患者新鮮糞便標(biāo)本。按照北京市腸道傳染病監(jiān)測方案的要求進(jìn)行規(guī)范采樣，共收集16 349份標(biāo)本，進(jìn)行沙門菌的分離、培養(yǎng)和鑒定，分離出非傷寒沙門菌677株。急性感染性腹瀉的診斷標(biāo)準(zhǔn)為日腹瀉次數(shù)>3次，比平時次數(shù)增多；大便形狀改變，呈稀便、水樣便、黏液便或膿血便，原則上就診前未使用過抗菌藥物。

1.2 方法

1.2.1 分離、培養(yǎng)及生化鑒定 糞便沙門菌的分離培養(yǎng)參照衛(wèi)生部行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)WS271-2007附錄B進(jìn)行。采集患兒的糞便或肛拭子，插入亞硒酸鹽煌綠(selenite brilliant green，SBG)增菌液肉湯培養(yǎng)(37℃，18～24 h)，在SS選擇性培養(yǎng)基進(jìn)行劃線分離培養(yǎng)(37℃，18～24 h)；挑取可疑單菌落，穿刺三糖鐵瓊脂，于37℃培養(yǎng)18～24 h，斜面呈紅色，底層黃色、產(chǎn)氣，硫化氫陽性為可疑沙門菌。將分離到的可疑沙門菌轉(zhuǎn)種于營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上過夜培養(yǎng)，采用法國梅里埃公司VITEK 2 Compact全自動微生物鑒定系統(tǒng)進(jìn)行系統(tǒng)生化鑒定。上述培養(yǎng)基為英國OXOID公司產(chǎn)品。

1.2.2 血清學(xué)分型試驗 用沙門菌群(A～F)抗原、菌體(O)抗原及鞭毛(H)抗原的不同抗血清對沙門菌進(jìn)行血清型鑒定。方法為挑取三糖斜面上少量菌苔與A～F多價抗血清在室溫下進(jìn)行玻片凝集，1 min 內(nèi)出現(xiàn)凝集顆粒為陽性；按同樣方法與O單價抗血清進(jìn)行逐一凝集確定O抗原，根據(jù)確定的O抗原進(jìn)行相應(yīng)的H多價和單價血清凝集，以確定最終血清型。玻片凝集時需設(shè)生理鹽水對照。沙門菌診斷血清為丹麥SSI血清研究所產(chǎn)品，均在有效期內(nèi)使用。

1.3 ESBLs 耐藥基因檢測 采用煮沸法提取菌體及質(zhì)粒DNA。PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系為25 μL，包含12.5 μL 2×PCR反應(yīng)混合物，上、下游引物0.2 μmol/L，模板DNA 2 μl；反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5 min，94℃變性30 s ，退火30 s ，72 ℃ 延伸1 min，35 個循環(huán)，72℃延伸5 min。OXA、TEM、SHV、PSE和CTX-M 型基因引物序列[4-5]及反應(yīng)條件見表1，引物序列由北京擎科生物技術(shù)有限公司合成。PCR擴(kuò)增在美國ABI9700 PCR儀上進(jìn)行，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用德國QIAGEN公司QIAxcel 全自動電泳系統(tǒng)進(jìn)行檢測，PCR 陽性擴(kuò)增產(chǎn)物交于北京擎科生物技術(shù)有限公司純化、雙相測序。序列拼接后通過NCBI Blast 程序在GenBank 上查詢比較，確定基因亞型。

表1 ESBLs耐藥基因PCR引物及序列

2 結(jié)果

2.1 分離沙門菌及血清型分布 2012—2015年從16 349份腹瀉臨床樣本中共分離非傷寒沙門菌677株，陽性率為4.14%。其中2012年采樣3 364份，陽性率5.68%；2013年采樣3 314份，陽性率4.01%；2014年采樣2 781份，陽性率4.17%；2015年采樣6 890份，陽性率3.44%。677株沙門菌共分為68種不同的血清型，其中腸炎沙門菌為最主要的血清型，占35.45% (240株)，其次為鼠傷寒沙門菌(111株，16.40%)、山夫登堡沙門菌(61株，9.01%)、鼠傷寒沙門菌變種(45株，6.65%)。見表2。

表2 677株沙門菌血清型分布

表3 677株沙門菌對16種抗菌藥物的耐藥結(jié)果

表4 沙門菌多重耐藥結(jié)果

2.3 β-內(nèi)酰胺酶類耐藥基因檢測 677株非傷寒沙門菌中選取對氨芐西林和阿莫西林/克拉維酸均耐藥的244株沙門菌，進(jìn)行blaTEM、blaCTX-M、blaOXA、blaSHV和blaPSE-15種ESBLs基因的檢測，其中blaSHV和blaPSE-1未檢測到，陽性基因電泳結(jié)果見圖1，基因片段測序峰圖見圖2。blaTEM檢出率最高(59.84%，146/244)，經(jīng)測序確證全部為blaTEM-1；30株(12.30%)blaOXA-1陽性，18株(7.38%)blaCTX-M陽性，其中包括7株blaCTX-M-15，6株blaCTX-M-55和5株blaCTX-M-14；154株(63.11%)攜帶一種ESBLs耐藥基因；20株(8.20%)同時攜帶2種ESBLs耐藥基因，其中blaTEM-1和blaOXA-1雙陽性的菌株12株，blaTEM-1和blaCTX-M雙陽性的菌株8株，見表5。所有ESBLs基因陽性的菌株對頭孢菌素的耐藥性不同，18株blaCTX-M基因陽性的菌株頭孢菌素耐藥表型符合率最高，對頭孢曲松的耐藥率為88.89%(16/18)，對頭孢吡肟的耐藥率為77.78%(14/18)，對頭孢西丁的耐藥率僅為5.56%(1/18)。

圖1 耐藥基因毛細(xì)管電泳結(jié)果

Figure1Capillary electrophoresis result of drug resistance genes

A:blaOXA基因;B: blaTEM基因;C: blaCTX-M基因

Table5Detection results of ESBLs drug resistance genes of 244Salmonellastrains

耐藥基因型菌株數(shù)blaTEM-1146blaOXA-130blaCTX-M18 blaCTX-M-157 blaCTX-M-556 blaCTX-M-145blaTEM-1+blaOXA-112blaTEM-1+blaCTX-M8 blaTEM-1+blaCTX-M-154 blaTEM-1+blaCTX-M-143 blaTEM-1+blaCTX-M-551

3 討論

沙門菌引起的感染性腹瀉與諾如病毒一樣全球分布[6-7]，尤其在發(fā)達(dá)國家和地區(qū)更是高發(fā)，在我國感染性腹瀉中位居第3位。許多沙門菌可在人、動物、食品和外環(huán)境之間相互傳播，導(dǎo)致人和動物發(fā)病。北京市2012—2015年自感染性腹瀉病例中分離沙門菌677株，檢測出68種血清型，腸炎沙門菌和鼠傷寒沙門菌為優(yōu)勢血清型，與國內(nèi)其他研究[3,8-9]類似，只是在優(yōu)勢血清型分布順序上略有差別。北京、上海以腸炎沙門菌為第一位，而廣東和河南則以鼠傷寒沙門菌為第一優(yōu)勢血清型，可見沙門菌血清型分布廣泛，并具有區(qū)域特異性。本研究顯示，山夫登堡沙門菌和阿貢納沙門菌是臨床常見的2種沙門菌致病血清型，其中山夫登堡沙門菌可在環(huán)境中持續(xù)存在，成為潛在的污染源，并造成腹瀉病例的持續(xù)發(fā)生[10]。阿貢納沙門菌曾引起過多起聚集性腹瀉疫情，有報道[11]阿貢納沙門菌污染奶粉引起新生兒感染導(dǎo)致腦膜炎。因此，明確鑒定沙門菌血清分型，了解本地區(qū)近幾年沙門菌主要病原構(gòu)成情況，掌握其血清學(xué)變遷，為臨床診療提供病原學(xué)依據(jù)。

CTX-M型ESBLs是一組逐漸被認(rèn)識且家族成員日益龐大的新型ESBLs，該類酶最早由鼠傷寒沙門菌產(chǎn)生，以對頭孢噻肟高水平耐藥為主要表型特征。blaCTX-M基因亞型及菌譜地域分布廣泛，是導(dǎo)致某些地區(qū)ESBLs 產(chǎn)酶株傳播或流行的主要原因。本研究對頭孢曲松耐藥的沙門菌進(jìn)行檢測，檢出3種基因亞型blaCTX-M-15、blaCTX-M-55和blaCTX-M-14，在我國其他地區(qū)也有此3種基因亞型的檢出，提示上述亞型的ESBLs 在我國存在一定的流行，但由于各地區(qū)使用抗菌藥物不同，blaCTX-M流行基因亞型也有差異，深圳和江西報道的流行亞型為blaCTX-M-14[13-14]，而遼寧地區(qū)則以blaCTX-M-55為主[15]。

由于ESBLs家族基因種類繁多，本研究僅選取了研究比較多的經(jīng)典的5種基因。在244株沙門菌中，71.31% 的菌株攜帶上述1種以上ESBLs耐藥基因，但文獻(xiàn)報道還有很多編碼其他類型酶，如BES-1、FEC-1、PER-2、CME-1、VEB-1等的基因[2]，難免會造成一些表型ESBLs耐藥菌株基因型的漏檢。由于細(xì)菌的耐藥機(jī)制相當(dāng)復(fù)雜，耐藥基因的位置、遺傳結(jié)構(gòu)和表達(dá)情況以及不同耐藥基因之間的相互作用等均會影響細(xì)菌對抗菌藥物的耐藥性，產(chǎn)ESBLs菌株不僅對青霉素類和頭孢菌素耐藥，而且對氨基糖苷類、喹諾酮類、磺胺類藥物也交叉耐藥。耐藥表型與耐藥基因存在密切的關(guān)系，但又并非遵循嚴(yán)格的對應(yīng)關(guān)系，細(xì)菌對一種藥物的耐藥可能是幾種耐藥基因和耐藥機(jī)制共同作用的結(jié)果[16]。因此，擴(kuò)大ESBLs菌株耐藥基因監(jiān)測的種類，是后續(xù)研究關(guān)注的重點和有待完善的方面。

[參 考 文 獻(xiàn)]

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