錢(qián)耀亮 劉鳳芹 肖 龍

圍手術(shù)期的腦保護(hù)一直以來(lái)備受麻醉醫(yī)師的高度關(guān)注，手術(shù)過(guò)程中易出現(xiàn)腦缺血再灌注損傷，圍手術(shù)期腦保護(hù)的預(yù)處理對(duì)患者的預(yù)后起到了至關(guān)重要的作用。國(guó)內(nèi)外學(xué)者深入探討了單獨(dú)使用利多卡因或者烏司他丁對(duì)大鼠腦缺血再灌注損傷的影響，本研究對(duì)二者聯(lián)合預(yù)處理做進(jìn)一步的研究，以探討利多卡因及烏司他丁聯(lián)合預(yù)處理的腦保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

健康成年雄性SD大鼠120只，體重200～250 g，動(dòng)物由廣東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。隨機(jī)分為4組：對(duì)照組(C組)，利多卡因預(yù)處理組(L組)，烏司他丁預(yù)處理組(U組)，利多卡因與烏司他丁聯(lián)合預(yù)處理組(L+U組)，全部大鼠行腦缺血再灌注。

1.2 動(dòng)物模型的建立

大鼠飼養(yǎng)及手術(shù)室溫控制于25℃左右，術(shù)前12 h禁食不禁水。大鼠給予腹腔注射10%水合氯醛3 ml/kg麻醉后，取仰臥位固定，備皮，碘伏消毒，取頸區(qū)正中切口，鈍性分離頸部肌肉，暴露右側(cè)頸總動(dòng)脈、頸外動(dòng)脈和頸內(nèi)動(dòng)脈，結(jié)扎頸外動(dòng)脈和頸總動(dòng)脈近心端，于頸內(nèi)動(dòng)脈遠(yuǎn)心端備線，在頸總動(dòng)脈分叉處剪一約0.2 mm“V”形切口，用直徑約0.24 mm的尼龍線(頭端粘附過(guò)多聚賴(lài)氨酸，后用肝素浸泡處理，呈錐形，頭端直徑約0.26～0.28 mm)，經(jīng)切口插入頸內(nèi)動(dòng)脈約(18±1)mm，遇有輕微阻力，表明栓線穿過(guò)大腦中動(dòng)脈起始端至近端，將大腦中動(dòng)脈起始端阻塞結(jié)扎頸內(nèi)動(dòng)脈，扎緊備線并固定栓線，栓線外端留出約8 mm長(zhǎng)，縫合皮膚。缺血2 h后，只需將栓線抽至頸內(nèi)動(dòng)脈起始部(拔出約10 mm)，即可恢復(fù)大腦中動(dòng)脈血供，實(shí)現(xiàn)再灌注。L組于術(shù)前30 min予利多卡因10 mg/kg腹腔內(nèi)注射，U組于術(shù)前30 min予烏司他丁20萬(wàn)U/kg腹腔內(nèi)注射，L+U組于術(shù)前30 min予利多卡因10 mg/kg，烏司他丁20萬(wàn)U/kg腹腔內(nèi)注射，C組于術(shù)前30 min予生理鹽水2 mL腹腔內(nèi)注射。

1.3 神經(jīng)功能評(píng)分

再灌注后72 h從各組隨機(jī)選取存活之10只大鼠，觀察大鼠行為障礙的程度。采取雙盲法進(jìn)行評(píng)分，參考Longa等的5分制法將行為障礙進(jìn)行分級(jí)評(píng)分：無(wú)神經(jīng)功能缺損癥狀，活動(dòng)正常者為0分；不能完全伸展對(duì)側(cè)前爪者為1分；行走時(shí)出現(xiàn)向?qū)?cè)轉(zhuǎn)圈者為2分；行走時(shí)身體向?qū)?cè)倒者為3分；不能自行行走，意識(shí)喪失者為4分。1～3分為建模成功。

1.4 腦梗死體積比率測(cè)定

再灌注72 h后，各組隨機(jī)取4只大鼠用10%水合氯醛50 mg/kg麻醉后迅速斷頭取腦(除去小腦及腦干)，腦組織取出后置于-20℃低溫冰箱快速(約5 min)冷凍后，由前向后取冠狀面每隔2 mm切取組織片5～6片，置于2%2,3,5-三苯基氯化四氮唑(TTC)溶液中，37℃水浴中避光孵育20～30 min，每5 min翻動(dòng)一次，待顯色完全后置甲醛溶液固定一周。線粒體過(guò)氧化氫酶可氧化TTC，使存活組織呈深紅色，壞死組織不著色呈蒼白色。用數(shù)碼相機(jī)將每片固定好腦組織片照相后，稱(chēng)重，并肉眼下小心挖取梗死腦組織再稱(chēng)重，計(jì)算出梗死區(qū)域重量及腦梗死體積比率(腦梗死體積比率=梗死區(qū)域重量/全腦重量)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 19.0 統(tǒng)計(jì)軟件分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用單因素方差分析進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，同組間兩兩比較采用t檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

各組缺血后神經(jīng)功能評(píng)分無(wú)顯著差異。再灌注72 h后，C組神經(jīng)功能評(píng)分較缺血后顯著升高，并顯著高于3個(gè)預(yù)處理組，其余各組缺血后與再灌注72 h神經(jīng)功能評(píng)分無(wú)顯著差異，3個(gè)預(yù)處理組之間神經(jīng)功能評(píng)分無(wú)顯著差異。腦梗死區(qū)域體積及腦梗死體積比率方面，C組顯著高于其他組，L組與U組之間無(wú)顯著差異，L+U組分別低于L組和U組，見(jiàn)表1。

組別缺血后神經(jīng)功能評(píng)分/分再灌注后神經(jīng)功能評(píng)分/分腦梗死體積比率/%C組2.13±0.242.99±0.551)38.56±5.36L組2.17±0.522.2±0.392)27.34±3.272)U組2.08±0.352.05±0.42)26.88±4.112)L+U組2.11±0.411.98±0.362)20.83±3.022)3)

注：C組與缺血后比較，1)P<0.05；與C組比較，2)P<0.05；分別與L組和U組比較，3)P<0.05

3 討論

在全世界范圍內(nèi)，腦缺血發(fā)作是致殘的最常見(jiàn)原因。腦缺血時(shí)，由于缺氧導(dǎo)致細(xì)胞的能量代謝障礙和酸中毒，大腦局部的內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)被打破，恢復(fù)血液供應(yīng)后，腦功能不僅未能恢復(fù)，反而出現(xiàn)了進(jìn)行性加重的損傷，這一現(xiàn)象稱(chēng)為腦缺血再灌注損傷(Cerebral Ischemia-reperfusion Injury, CIRI)。本研究中C組大鼠再灌注72 h后神經(jīng)功能評(píng)分顯著高于缺血后，表現(xiàn)為典型的CIRI。CIRI是一個(gè)十分復(fù)雜的病理生理過(guò)程，主要機(jī)制包括：氧自由基過(guò)度生成，細(xì)胞內(nèi)鈣超載，興奮性氨基酸的毒性作用，線粒體損傷，炎癥反應(yīng)及細(xì)胞凋亡等[1-4]。

腦缺血是心臟或神經(jīng)外科手術(shù)的常見(jiàn)并發(fā)癥，預(yù)防性使用神經(jīng)保護(hù)藥物可能對(duì)手術(shù)患者由缺血導(dǎo)致的腦損傷有益。利多卡因是一種局麻藥和抗心律失常藥，可通過(guò)血腦屏障，具有減少缺血區(qū)的跨膜離子轉(zhuǎn)運(yùn)，減少興奮性毒素的釋放，減慢新陳代謝，抑制炎癥反應(yīng)及維持腦部血流供應(yīng)等特點(diǎn)，從而可以在圍手術(shù)期提供腦保護(hù)作用[5]。韓樹(shù)海等[6]通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)利多卡因能顯著促進(jìn)腦缺血再灌注大鼠腦組織中熱休克蛋白(HSP70)的表達(dá)，顯著改善缺血后神經(jīng)功能缺陷，減輕腦組織形態(tài)學(xué)損傷。提示利多卡因的腦保護(hù)作用與促進(jìn)腦缺血再灌注時(shí)HSP70的表達(dá)有關(guān)。Lei B等[7]的研究表明利多卡因可減少半暗區(qū)細(xì)胞色素C的釋放，抑制半胱氨酸、天冬氨酸蛋白酶3的激活，減少DNA的斷裂，在早期促進(jìn)電生理學(xué)的恢復(fù)并縮小皮層梗死范圍。提示利多卡因可能通過(guò)抑制半暗區(qū)細(xì)胞凋亡來(lái)達(dá)到上述腦保護(hù)作用。施賢清等[8]通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)利多卡因預(yù)處理可使超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽(GSH)的活性升高，而使內(nèi)皮素(ET)的含量降低，提示利多卡因的腦保護(hù)作用與其增加體內(nèi)抗氧化物質(zhì)SOD、GSH的活性及拮抗ET的毒性有關(guān)。此外，利多卡因預(yù)處理還可抑制水通道蛋白4的表達(dá)，而后者可誘發(fā)神經(jīng)系統(tǒng)炎癥反應(yīng)和導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞的損傷[9]。本研究中利多卡因預(yù)處理組再灌注后神經(jīng)功能評(píng)分及腦梗死體積比率均顯著低于對(duì)照組，表明利多卡因預(yù)處理可有效減輕大鼠的腦缺血再灌注損傷，與文獻(xiàn)報(bào)道相一致。

烏司他丁是從健康成年男性新鮮尿液中分離純化出來(lái)的一種糖蛋白，屬蛋白酶抑制劑，對(duì)胰蛋白酶、α-糜蛋白酶、纖溶酶等多種酶有抑制作用，另具有穩(wěn)定溶酶體膜，抑制溶酶體酶的釋放，抑制心肌抑制因子產(chǎn)生，清除氧自由基及抑制炎癥介質(zhì)釋放的作用[10]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證明，烏司他丁可通過(guò)降低缺血區(qū)中性粒細(xì)胞的浸潤(rùn)，減小梗死體積來(lái)改善缺血再灌注損傷后的腦功能[11]。鄧玉萍等[12]的研究顯示烏司他丁可使腦缺血再灌注后的大鼠神經(jīng)功能缺損明顯改善，腦梗死體積減小，細(xì)胞凋亡數(shù)減少。其機(jī)制可能是烏司他丁增加缺血區(qū)GRP78蛋白表達(dá)，抑制CHOP和Caspase-12蛋白表達(dá)，減輕內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)，從而抑制細(xì)胞凋亡。本研究中烏司他丁預(yù)處理組的大鼠腦缺血再灌注后神經(jīng)功能評(píng)分及腦梗死體積比率均顯著低于對(duì)照組，顯示出與利多卡因預(yù)處理組相類(lèi)似的腦保護(hù)作用。

利多卡因與烏司他丁腦保護(hù)的作用機(jī)理不同，二者聯(lián)合應(yīng)用的腦保護(hù)作用少見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道。本研究中L+U組雖然在再灌注后神經(jīng)功能評(píng)分方面與L組和U組無(wú)顯著差異，但腦梗死體積比率顯著小于上兩組，顯示出更強(qiáng)的腦保護(hù)作用，為臨床預(yù)防腦缺血再灌注損傷提供了新的用藥思路。今后在二者聯(lián)合應(yīng)用提供腦保護(hù)的作用機(jī)制和用藥安全方面尚需做進(jìn)一步的深入探討。

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