李春艷 高勝蘭 劉 剛

1 Tetraspanins

1.1 Tetraspanins的結構

Tetraspanins即四跨膜蛋白超家族，它是一類在所有多細胞真核生物中表達的小分子跨膜蛋白，分子量多在20～30 kDa。該家族共有39個成員，其中有34 種在哺乳動物中被發(fā)現(xiàn)，在人類已經確認33種，包括Tspan1～Tspan33。四跨膜蛋白結構上由4 個疏水性跨膜結構域及其在細胞外形成的兩個大小不等的環(huán)狀結構EC1、EC2和在細胞內形成的短氨基端、羧基端組成[1](如圖1)。Tetraspanins的大細胞外環(huán)即EC2結構域由兩個亞結構域組成，一個是具有極大變異性的亞結構域，其氨基酸的序列和蛋白質的折疊受關鍵的二硫鍵支配；另一個是高度保守的亞結構域，其保守基序包括4個不變的半胱氨酸殘基：CCG(Cys-Cys-Gly)，PXSC(Phe-X-Ser-Cys)和EGC(Glu-Gly-Cys)[2-3]。四跨膜蛋白的EC2環(huán)是四跨膜蛋白和其他跨膜蛋白如整聯(lián)蛋白或其他信號分子之間相互作用所必需的[4]。四跨膜蛋白的功能主要取決于該蛋白質的序列、翻譯后修飾及組織細胞分布。四跨膜蛋白具有2種重要的翻譯后修飾功能，包括EC2環(huán)上的N-糖基化和跨膜區(qū)CXXC基序的棕櫚?；?。大部分的四跨膜蛋白在大的EC2環(huán)中具有一個或多個N-糖基化位點，但有2個除外，即在小EC1環(huán)中具有N-糖基化位點的CD9和非糖基化的CD81[5]。目前為止，所發(fā)現(xiàn)的四跨膜蛋白均含有棕櫚?；Y構，棕櫚?；c蛋白質的形態(tài)及其在質膜中的功能密切相關。多數(shù)情況下，半胱氨酸殘基翻譯后的?；蜃貦磅；瘜λ目缒さ鞍赘患瘏^(qū)域(TEMs)的組成至關重要，相反，四跨膜蛋白棕櫚?；娜笔В瑫绊懰c其他信號分子的相互作用，亞細胞分布，生物合成過程中的穩(wěn)定性以及細胞形態(tài)[6]。四跨膜蛋白超家族的成員在基因水平也有一定的關聯(lián)性，具有20%～30%的氨基酸序列同源性。

圖1 Tetraspanin結構模式圖[7]

四跨膜蛋白EC2的可變結構域由兩個二硫鍵(橙線)穩(wěn)定，保守基序由4個不變的Cys殘基(黃色)組成，其中2個Cys殘基位于Cys-Cys-Gly(CCG)基序(黃色和綠色)中。

1.2 Tetraspanin Enriched Microdomains(TEMs)

盡管Tetraspanins的作用和機制尚未被完全了解，但已明確其在真核細胞的質膜中起到支架蛋白的作用。四跨膜蛋白可以與自身或其他四跨膜蛋白以及與眾多配體蛋白質結合，形成“四跨膜蛋白網(wǎng)絡”或“四跨膜蛋白富集區(qū)域”(TEMs)，從而作為質膜的結構和功能單位發(fā)揮作用[1]。TEMs可以作為信號平臺，類似于脂筏，但通常由不同的組分組成。另外，Tetraspanins通過蛋白質與蛋白質之間的相互作用以及TEMs的特異性組成，而對各種蛋白質包括整合素，免疫球蛋白超家族蛋白，蛋白酶，生長因子受體和細胞內信號分子的功能起到修飾作用[2]。四跨膜蛋白的4個跨膜區(qū)域對TEMs的組成及生物功能至關重要，參與了分子內部和分子之間的相互作用。盡管四跨膜蛋白的EC2環(huán)存在高度保守的半胱氨酸基序，它亦是四跨膜蛋白結構中最可變的區(qū)域，是四跨膜蛋白與其他蛋白相互作用所必需的，且在特異性分子的識別及功能中起重要作用。四跨膜蛋白不僅參與各種正常的細胞過程如細胞信號轉導、細胞粘附、遷移、增殖、分化等，還參與各種病理過程包括血管生成、腫瘤轉移、炎癥和病毒感染[1]。

關于四跨膜蛋白是否參與信號轉導的過程，有研究者認為，盡管四跨膜蛋白與其他跨膜蛋白有許多關聯(lián)，但能夠與胞質蛋白質相互作用的四跨膜蛋白非常少，因為四跨膜蛋白在胞質內的部分即氨基端和羧基端很短，通常小于20個氨基酸[8]，這使得四跨膜蛋白不直接參與信號轉導。但有研究報導了一些四跨膜蛋白能夠與細胞內的信號蛋白相關聯(lián)，比如細胞質伴侶PI4K、PKC和其它信號蛋白等[9]，因此，四跨膜蛋白能通過與受體蛋白結合及相互作用而影響細胞信號傳導。

基于四跨膜蛋白的結構特征，其突出于細胞外的部分至多5 nm，大部分四跨膜蛋白被認為不可作為潛在的細胞表面受體[10]。近來越來越多的研究對這一觀點提出了質疑。據(jù)報道，CD9具有多種可溶性的配體，其可替代肥大細胞中IL-16受體，誘導巨噬細胞釋放IL-10，IL-6和TGFβ；還能結合PSG17(妊娠期間釋放的一種胎盤蛋白)，對卵、精子的融合起到重要作用，而CD9缺陷的雌性小鼠表現(xiàn)出生育障礙[11-12]。CD81已被確定為丙型肝炎病毒包膜蛋白E2的基本受體，且CD81上E2的結合位點位于緊鄰EC2環(huán)二硫鍵的內螺旋中[13]。CD82作為內皮細胞表面蛋白DARC的受體，它的表達能夠抑制腫瘤轉移，而這種抑制作用在DARC敲除小鼠中被消除[14]。盡管有這些偶然的報道，四跨膜蛋白以反式作用的方式結合內源性配體的能力目前仍有爭議。

1.3 Tetraspanins的組織分布

幾乎在所有的組織和細胞類型中都能發(fā)現(xiàn)四跨膜蛋白，它們在細胞膜表面和/或細胞內囊泡表達，而且每個成員表現(xiàn)出不同的表達譜[7]。例如，四跨膜蛋白CD9、CD63、TSPAN7、CD81、CD82和CD151在各種細胞類型中廣泛分布，而C37(B細胞)和CD53(淋巴和骨髓細胞)主要存在于造血細胞中[5, 15]。僅有幾種四跨膜蛋白(UP1 a，UP1b，外周蛋白和ROM-1)的分布限于特定的組織[16]。盡管四跨膜蛋白在多種細胞類型中表達豐富，但缺乏某些四跨膜蛋白的動物并未顯示出異常的表型，可能由于其他四跨膜蛋白對其功能的補償作用。而有些單個Tetraspanin基因的突變或缺失可造成危及生命的疾病，在某些情況下，我們觀察到缺乏特定四跨膜蛋白的小鼠，與具有相同四跨膜蛋白缺陷的人類相比，表現(xiàn)出相似的疾病表型[1]。如CD151敲除的小鼠能自發(fā)形成衰老相關的肺纖維化，CD37缺失的小鼠能自發(fā)形成淋巴瘤等；在這些致死性疾病的人群中同樣發(fā)現(xiàn)有相同蛋白的表達缺陷[17-18]。因此，不同的四跨膜蛋白對疾病有著不同的影響。

2 Tetraspanins與疾病

2.1 Tetraspanins與腫瘤

2.1.1 Tetraspanins與腫瘤轉移 細胞癌變的過程涉及多種機制，包括基因突變、基因過度表達或表達不足、內分泌激活和表觀遺傳改變。這些變化的積累導致細胞基因表達的平衡喪失，從而造成細胞發(fā)生轉化[19]，進而獲得腫瘤細胞特性。Tetraspanins超家族成員參與調節(jié)細胞增殖、運動、粘附、血管生成及腫瘤轉移[20]。有研究發(fā)現(xiàn)CD82 / KAI1與前列腺癌的進展呈負相關，CD9在癌癥進展期間表達下調，提示該四跨膜蛋白具有腫瘤抑制作用[21-22]。自從Testa等[23]人首次發(fā)現(xiàn)CD151在促進腫瘤遷移及轉移中的作用以來，眾多研究已經在各種腫瘤中尋找到這種四跨膜蛋白的異常表達。CD151影響非小細胞肺癌、胰腺癌及結直腸癌中的細胞運動和侵襲，并且也在中性粒細胞、成纖維細胞和內皮細胞的遷移中起作用[24-26]。已經證實CD151表達與前列腺癌、非小細胞肺癌、結腸癌、腎細胞癌、胰腺癌、食管鱗狀細胞癌、肝內膽管癌、乳腺癌和肝細胞癌的預后和存活時間相關[24, 27-32]。同樣地，TSPAN1和TSPAN8在胰腺癌、胃癌、結直腸癌、肝癌、卵巢癌等腫瘤中表達上調，提示其對腫瘤發(fā)展的促進作用[33]。以上研究表明，四跨膜蛋白Tetraspanins與腫瘤轉移具有相關性。

2.1.2 整合素、EMT與腫瘤轉移 人體內的單層上皮細胞通過細胞與細胞之間緊密連接蛋白如E-鈣黏蛋白以及細胞表面蛋白整合素與基底膜蛋白的結合而維持上皮細胞的形態(tài)。當上皮細胞發(fā)生轉化及癌變時，整合素在腫瘤細胞的侵襲和轉移起到重要作用。整合素與細胞外的配體結合形成復雜的蛋白結構，使ECM與應力纖維結合，形成細胞質肌動蛋白細胞骨架，并在蛋白酪氨酸激酶的控制下，影響細胞的粘附及運動[34]。近年來，越來越多的證據(jù)表明整合素參與了腫瘤血管生成、淋巴管生成及癌癥的轉移。在內皮細胞中，已發(fā)現(xiàn)整合素參與誘導血管生成[35-36]。整合素α1β1、α2β1、α4β1、α5β1、α9β1、α6β4、αvβ3和αvβ5在血管生成中起作用，而整合素α2β1、α4β1、α5β1和α9β1參與淋巴管生成[37-38]。在血管生成的過程中，與纖連蛋白和玻連蛋白結合的整合素α5β1、αvβ5和αvβ3表達上調，而與基礎ECM成分膠原蛋白和層粘連蛋白結合的整合素如α1β1、α2β1、α3β1、α5β1、α6β4等則趨于下調[39]。血管內皮生長因子作為血管(VEGF-A)和淋巴管(VEGF-C和VEGF-D)生成的主要調節(jié)因子，整合素α9β1與VEGF-A，-C和-D直接相關[40-43]。因此，整合素的表達變化是調控細胞內信號轉導途徑及參與腫瘤轉移的重要決定因素。

上皮間質轉化(EMT)作為一種上皮細胞向間充質細胞特異性轉化的過程,在上皮性癌的侵襲和轉移中起著重要作用。研究影響EMT的相關因素，能夠幫助我們更好地了解癌性上皮細胞如何從相鄰細胞分離，侵入相鄰組織，并獲得轉移的能力。已有研究表明，整合素作為一類極為重要的粘附分子，與鈣黏蛋白一同參與了EMT 的發(fā)生。整合素不僅在細胞與細胞間及細胞與細胞外基質間的黏附功能中起關鍵作用,還通過激活多種激酶的酪氨酸磷酸化級聯(lián)反應,介導多種信號轉導通路,直接或間接的參與EMT過程[44]。因此，EMT與腫瘤轉移相關，而整合素與EMT存在一定的相互作用。

2.1.3 Tetraspanins與整合素 研究發(fā)現(xiàn)，Tetraspanins能與其他細胞膜分子如整合素結合，調控細胞形態(tài)、細胞遷移和免疫反應等[45]。整合素對細胞粘附、細胞遷移、細胞周期和凋亡起著重要作用。它們不具有任何內在活性，僅存于細胞表面，通過與各種ECM蛋白和微環(huán)境信號相互作用，形成整合素依賴性信號傳導途徑，調節(jié)細胞增殖、遷移、侵襲、凋亡和血管生成[46]。與層粘連蛋白(層粘連蛋白是基底膜中的細胞粘附蛋白)結合的整合素主要是α3β1、α6β1、α6β4和α7β1[47]。四跨膜蛋白超家族成員如CD81、CD9、CD53、CD63、CD82和CD151與整合素關系密切，它們與整合素一起在各種類型的人類細胞中參與調節(jié)細胞形狀，細胞遷移及信號轉導[48]。有證據(jù)表明CD81與α4β1整合素相關，而CD151與α3β1、α6β1、α6β4和α7β1相關[49-50]。Berditchevski等[34]學者研究顯示，四跨膜蛋白CD81和CD151能夠直接與整合素相互作用，并由此將其他蛋白分子與整合素整合到一起。例如，磷脂依賴性絲氨酸和蘇氨酸激酶的PKC家族作為細胞內蛋白質，其與幾種不同的四跨膜蛋白例如CD9、CD81、CD82和CD151結合，并特異性存在于四跨膜蛋白的胞內結構域中，于是四跨膜蛋白充當連接分子而將PKC與β1、β2和β3整聯(lián)蛋白相結合[51]。有研究顯示，CD151-α3β1復合物的形成是大多數(shù)研究的重點，其在細胞內信號轉導中起到重要作用，尤其是肌動蛋白-細胞骨架動力學的變化導致細胞遷移侵襲的形成[48]。CD151作為整合素依賴性細胞運動信號轉導過程中的基本連接子，對細胞內整合素的定位起到重要作用，從而影響癌癥的侵襲和轉移[52-53]。因此，Tetraspanin影響其與整合素結合，并影響細胞整合素的分布和轉運，從而影響細胞運動性和侵襲性。

2.1.4 Tetraspanins與EMT EMT與腫瘤轉移相關，有研究顯示，四跨膜蛋白參與調節(jié)EMT過程。例如，已發(fā)現(xiàn)四跨膜蛋白超家族成員CD151能夠與β1整合素形成復合物，增加β1整合素與其配體的親合力，影響皮膚黑色素細胞的遷移能力。另有研究顯示CD151能夠下調E-鈣黏蛋白的表達促進肝癌細胞的侵襲與轉移。Lupia等[54]的研究證實了CD63在黑色素瘤細胞EMT過程中起到負性調控作用。通過RNAi技術沉默CD63后，黑色素瘤細胞的運動能力及基質降解能力均增加，同時伴有E-鈣黏蛋白的下調及N-鈣黏蛋白和Snail蛋白的上調；而過表達CD63后，細胞的運動及侵襲性明顯降低，同時伴有N-鈣粘蛋白，波形蛋白，Zeb1和a-SMA的減少；將過表達CD63的黑色素瘤細胞移植到裸鼠皮下，觀察到腫瘤發(fā)生率及腫瘤生長速率明顯降低。以上均表明了四跨膜蛋白通過影響腫瘤EMT過程而促進腫瘤進程。

2.2 Tetraspanin與纖維化疾病

2.2.1 EMT與纖維化 大量研究證實，纖維化是一種與腫瘤的發(fā)病機制存在很多相似之處的疾病，其最大的共同特點即是EMT[55]。纖維化疾病如特發(fā)性肺纖維化等的研究一直是研究的熱點及難點，其發(fā)病機制至今仍不清楚。過去觀點認為，炎癥反應在纖維化疾病的發(fā)展過程中扮演重要角色，但隨著研究的深入，越來越多的證據(jù)表明，上皮驅動的異?？赡苁瞧浒l(fā)病機制的關鍵。眾多研究顯示，異?；罨闹夤芑蚍闻萆掀ぜ毎置诘纳L因子、趨化因子等對成纖維細胞的活化、增殖及遷移起到重要作用。這些上皮細胞通過EMT而發(fā)生表型轉換，是成纖維細胞/肌成纖維細胞的重要來源。

2.2.2 CD151與肺纖維化 Tsujino研究團隊證明了上皮細胞的完整性在纖維化疾病的發(fā)病過程中起到關鍵作用[17]。他們發(fā)現(xiàn)四跨膜蛋白CD151作為一個通過對基底膜的粘附作用而維持上皮完整性的基本分子，它的缺失能夠促進上皮細胞間質性改變及TGF-β信號通路的活化，最終導致自發(fā)性的肺纖維化的發(fā)生。他們進一步研究發(fā)現(xiàn)，CD151敲除的小鼠肺組織中，與結締組織相關的基因表達異常升高，而在這些異常升高的基因中，多數(shù)與細胞外基質相關，如Collagen-1 和Collagen-3，表明CD151的缺失能夠造成肺的纖維化改變。另外，形態(tài)學、功能學和生物化學證據(jù)顯示CD151敲除小鼠在30周齡時出現(xiàn)明顯的纖維化，但無明顯的炎癥反應。并且，CD151敲除的小鼠表現(xiàn)出低劑量博來霉素氣管灌注就能加速上皮完整性的喪失，導致嚴重的纖維化及死亡率的增加。同時，這一纖維化的過程在肝內膽管及腎小球也能觀察到。從CD151敲除的小鼠肺組織中分離的肺泡上皮細胞，其上皮完整性喪失，表現(xiàn)出形態(tài)細長，α-平滑肌肌動蛋白表達增加，P-Smad2的表達上調并與α-平滑肌肌動蛋白和前表面活性蛋白C染色的共定位，這些證據(jù)均表明肺泡上皮細胞發(fā)生了EMT。有研究觀察到，正常人的肺組織中大多數(shù)肺泡上皮細胞(AECs)表達CD151，但在IPF病人的肺組織中CD151陽性的肺泡上皮細胞數(shù)量明顯減少，表明這種四跨膜蛋白的下調可能在IPF的發(fā)病機制中起重要作用。

2.2.3 TM4SF5與肝纖維化 TM4SF5因其具有4個跨膜結構域，最初被認為是四跨膜蛋白超家族Tetraspanins的成員之一，之后的研究認為其在EC2環(huán)中缺乏相應的保守區(qū)域如CCG基序，而與TM4SF1(L6,L6-Ag)、TM4SF4(IL-TIMP)、TM4SF18(L6D)、TM4SF19和TM4SF20組成四次跨膜L6家族成員[56-57]。TM4SF5與肝癌EMT相關，而超過80%的肝癌病例與晚期纖維化或肝硬化有關聯(lián)，Kang等的研究證實了TM4SF5參與肝纖維化的發(fā)生[57-58]。TM4SF5在CCl4誘導的小鼠肝纖維化模型中表達上調，同時伴有纖維化隔膜區(qū)域中α-平滑肌肌動蛋白表達升高、EMT標志物的表達改變及I型膠原蛋白的沉積，且與TGFβ1介導的Smad通路以及EGFR信號通路相關。在動物模型中使用抗TM4SF5試劑TSAHC，間質標志物明顯下調，纖維化程度減輕。(TSAHC最初被篩選為α-糖苷酶抑制劑，其影響TM4SF5細胞外環(huán)2即EC2環(huán)的結構完整性及N-糖基化(Asn-138/Asn155),從而影響TM4SF5的功能。)Kang等[59]進一步研究證實了TM4SF5與CD151、CD63之間在肝細胞纖維化及肝細胞遷移、侵襲中的關系。其研究表明TM4SF5與CD151在肝細胞纖維化及遷移侵襲過程中具有協(xié)同作用，并且TM4SF5在CD151的上游；而TM4SF5 和CD151均能夠拮抗CD63在肝纖維化發(fā)展過程中以及肝細胞遷移/侵襲過程中的作用。目前，四跨膜蛋白與纖維化疾病相關的研究并不多，相信隨著研究的不斷深入，將會有更多的四跨膜蛋白在纖維化疾病中的作用會被挖掘出來。

3 小結

本文主要論述了Tetraspanins的基本結構和功能以及其在腫瘤、纖維化疾病中的作用。EMT作為腫瘤與纖維化疾病共有的特點，在疾病的發(fā)病過程中扮演著重要的角色。Tetraspanins如CD151、CD63等通過影響腫瘤EMT過程從而促進腫瘤進程，CD151、TM4SF5等參與纖維化疾病的EMT發(fā)病過程。關于Tetraspanins與整合素的相互作用，在腫瘤疾病的研究中報道較多，而在肺及肝纖維化中尚未被報道。Tetraspanins影響疾病的具體機制還需更多更深入的研究。Tetraspanins作為細胞表面分子，在細胞信號通路中起著關鍵的橋梁作用，是一個潛在的治療靶標，隨著今后對Tetraspanins的深入研究，將為疾病的預防和/或治療提供更有價值的實驗依據(jù)。

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