羅敏娜 劉志翠 曹宗富 孫殿榮 馬斯禹,3 高華方 馬 旭 李玉堂*

1. 國(guó)家衛(wèi)生計(jì)生委科學(xué)技術(shù)研究所(北京，100081)；2. 青島市婦女兒童醫(yī)院；3. 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院研究生院

Joubert綜合征(簡(jiǎn)稱JS，MIM#213300)是一種罕見(jiàn)的神經(jīng)系統(tǒng)疾病，發(fā)病率約為1:100 000[1]。Joubert綜合征的臨床表現(xiàn)主要有小腦蚓部發(fā)育不良或缺如、肌張力低、新生兒期的陣發(fā)性呼吸過(guò)度或呼吸暫停、眼球運(yùn)動(dòng)障礙、共濟(jì)失調(diào)、發(fā)育遲緩和認(rèn)知缺陷，部分患兒有視網(wǎng)膜發(fā)育不良、多囊腎和多指(趾)癥、肝纖維囊腫等伴發(fā)癥[2]。Joubert綜合征通常由MRI結(jié)合臨床表現(xiàn)進(jìn)行確診，其主要的影像學(xué)特點(diǎn)有：小腦蚓部部分或完全缺如，表現(xiàn)出“磨牙征”(MTS)，“中線裂”或“蝙蝠翼”，其中“磨牙征”是Joubert綜合征診斷的最重要特征[3]。已有的研究表明Joubert綜合征是常染色體隱性遺傳病，僅在因OFD1所致的Joubert綜合征的家庭表現(xiàn)為X連鎖隱性遺傳模式。目前已報(bào)道的Joubert綜合征致病基因有30個(gè)，分別為：INPP5E，TMEM216，AHI1，NPHP1，CEP290，TMEM67，RPGRIP1L，ARL13B，CC2D2A，OFD1，TTC21B，KIF7，TCTN1，TMEM237，CEP41，TMEM138，C5orf42，TCTN3，ZNF423，TMEM231，CSPP1，PDE6D，KIAA0586，TCTN2，CEP104，KIAA0556，B9D1，MKS1，TMEM107以及ARMC9[4-10]。這些基因絕大部分參與了纖毛的功能以及相關(guān)的信號(hào)途徑調(diào)控，是纖毛相關(guān)疾病的典型代表[11-12]。本研究采用全外顯子組測(cè)序技術(shù)對(duì)一個(gè)中國(guó)Joubert綜合征家系的先證者DNA進(jìn)行檢測(cè)，分析測(cè)序數(shù)據(jù)并按照美國(guó)醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)和基因組學(xué)學(xué)院(ACMG)的解讀規(guī)則[13]進(jìn)行解讀，在父母中進(jìn)行Sanger測(cè)序驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)了CSPP1基因上的2個(gè)雜合突變位點(diǎn)：c.1132C>T和c.2244_2245delAA，這兩個(gè)復(fù)合雜合突變位點(diǎn)是Joubert綜合征的致病原因。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

用于高通量測(cè)序分析的血液樣本取自青島市婦女兒童醫(yī)院收治的Joubert綜合征患者及其家屬。全血基因組DNA提取試劑盒購(gòu)自QIAGEN公司，Taq酶、DNA marker購(gòu)自全式金公司，PCR擴(kuò)增引物由華大六合科技有限公司合成。本課題研究所有的樣本采集及實(shí)驗(yàn)流程均已通過(guò)國(guó)家衛(wèi)生計(jì)生委科學(xué)技術(shù)研究所倫理審查委員會(huì)的審查，本人及家屬均簽署知情同意書(shū)。血樣的采集及家系、臨床資料的收集符合知情同意的原則。

1.2 DNA提取和全外顯子組測(cè)序

按照QIAamp DNA Blood Mini Kit(Qiagen，德國(guó))的操作說(shuō)明從全血中提取基因組DNA，利用Qubit2.0(Invitrogen)進(jìn)行定量。取0.5 μg待測(cè)樣品DNA用Bioruptor NGS超聲儀(Diagenode，比利時(shí))隨機(jī)打斷成200 bp的片段，分別用Truseq Nano DNA Library Prep Kit (Illumina，美國(guó)) 和SeqCap EZ Exome +UTR Library(96M) Kit(Roche，瑞士)進(jìn)行建庫(kù)和全外顯子組捕獲，在Hiseq 2500測(cè)序儀上(Illumina，美國(guó))進(jìn)行2×125雙端測(cè)序。測(cè)序過(guò)程由安諾優(yōu)達(dá)公司完成。

1.3 測(cè)序數(shù)據(jù)分析

得到的數(shù)據(jù)去除污染的、低質(zhì)量的數(shù)據(jù)后，以GRCh37.1/hg19基因組為參考基因組，依次使用Burrows-Wheeler Aligner(BWA)軟件、Genome Analysis Toolkit(GATK)軟件和ANNOVAR軟件對(duì)所有的變異位點(diǎn)進(jìn)行比對(duì)、分析和注釋。將全部變異位點(diǎn)與dbSNP137數(shù)據(jù)庫(kù)、千人基因組數(shù)據(jù)庫(kù)(1000 Genomes, 1000g, http://www.1000genomes.org)、外顯子組測(cè)序項(xiàng)目數(shù)據(jù)庫(kù)ESP6500(http://evs.gs.washington.edu/EVS)以及Exome Aggregation Consortium數(shù)據(jù)庫(kù)(http://exac.broadinstitute.org)進(jìn)行比對(duì)分析和過(guò)濾篩選，去除位于內(nèi)含子中的突變以及同義突變，去除MAF≥0.01的變異位點(diǎn)，優(yōu)先對(duì)所有Joubert綜合征已知致病基因的變異位點(diǎn)進(jìn)行分析，篩選出無(wú)義突變、移碼突變、剪切位點(diǎn)突變、終止密碼子丟失等對(duì)蛋白質(zhì)功能影響較大的變異位點(diǎn)，并結(jié)合已有文獻(xiàn)報(bào)道，確定候選的致病基因變異位點(diǎn)。

1.4 Sanger測(cè)序驗(yàn)證及突變功能分析

對(duì)候選的致病基因突變位點(diǎn)，針對(duì)其所在外顯子設(shè)計(jì)上下游引物，以患兒及其父母的基因組DNA為模板進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)?PCR)反應(yīng)，并利用Sanger測(cè)序法進(jìn)行驗(yàn)證。PCR引物序列及退火溫度列表如下。PCR擴(kuò)增反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后由ABI 3730完成Sanger測(cè)序；使用Chromas軟件查看Sanger測(cè)序峰圖，用SeqMan軟件比對(duì)Sanger測(cè)序結(jié)果。

表1 CSPP1致病位點(diǎn)擴(kuò)增引物

2 結(jié)果

2.1 臨床表現(xiàn)

患兒女，現(xiàn)年4歲，因生后至今走路不穩(wěn)來(lái)診?；純鹤杂装l(fā)育落后，約1歲多獨(dú)坐，現(xiàn)能獨(dú)走，不穩(wěn)；雙手不靈活，現(xiàn)持勺進(jìn)食撒漏多，不會(huì)正確持筆；語(yǔ)言認(rèn)知落后，近2歲說(shuō)話，至今僅會(huì)單詞、少數(shù)短句表達(dá)，不認(rèn)顏色且不識(shí)數(shù)?；純合档谝辉械谝划a(chǎn)，足月剖宮產(chǎn)，無(wú)宮內(nèi)窘迫，出生時(shí)無(wú)產(chǎn)傷、無(wú)窒息，Apgar評(píng)分10分。家族史無(wú)特殊。查體：表情淡漠，聽(tīng)從簡(jiǎn)單指令，頭圍49cm，面容無(wú)特殊，眼球運(yùn)動(dòng)不協(xié)調(diào)，心肺腹無(wú)異常，四肢肌張力低，肌力大致正常，雙膝反射可引出，立位雙足外翻，可獨(dú)走，步態(tài)不穩(wěn)，蹣跚狀。輔助檢查：Gesell發(fā)育測(cè)查：大運(yùn)動(dòng)36分，精細(xì)運(yùn)動(dòng)49分，應(yīng)物能57分，語(yǔ)言57分，應(yīng)人能62分；染色體核型分析46，XX；血氨基酸及尿有機(jī)酸代謝篩查無(wú)明顯異常；肝臟、膽囊、脾臟、雙腎、輸尿管及膀胱超聲未見(jiàn)異常；腦電圖正常；顱腦MRI，軸位T1WI中腦呈“磨牙征”，小腦半球于中線處靠近，可見(jiàn)線狀裂隙，呈“中線裂征”(圖1A)，小腦下蚓部缺如、上蚓部發(fā)育不良，小腦上腳增粗(圖1B)，第四腦室上部呈蝙蝠翼狀。診斷：Joubert綜合征。

A：軸位T1WI顯示“磨牙征”和“中線裂征”。B：矢狀位T1WI顯示小腦下蚓部缺如、上蚓部發(fā)育不良，小腦上腳增粗。

圖1患兒頭部MRI影像圖

2.2 全外顯子組測(cè)序分析

全外顯子組測(cè)序產(chǎn)出原始數(shù)據(jù)為10.9 G，目標(biāo)捕獲區(qū)平均測(cè)序深度為51.26×，≥1×測(cè)序深度下的覆蓋度為96.88%，≥4×測(cè)序深度下的覆蓋度為95.47%，≥10×測(cè)序深度下的覆蓋度為92.99%，≥20×測(cè)序深度下的覆蓋度為87.46%，數(shù)據(jù)量符合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)要求。

在經(jīng)dbSNP137、ESP6500、千人基因組數(shù)據(jù)庫(kù)，ExAC數(shù)據(jù)庫(kù)的過(guò)濾篩選以后，在已知的30種致病基因中發(fā)現(xiàn)了8號(hào)染色體上CSPP1基因(NM_024790.6)的1個(gè)點(diǎn)突變位點(diǎn)及1個(gè)InDel位點(diǎn)。其中，點(diǎn)突變位點(diǎn)位于9號(hào)外顯子區(qū)的第1132位，由胞嘧啶突變?yōu)樾叵汆奏?c.1132C>T)，可導(dǎo)致其蛋白質(zhì)翻譯在第378位氨基酸位點(diǎn)發(fā)生提前終止，產(chǎn)生截短的蛋白質(zhì)(p.R378X)。該位點(diǎn)在dbSNP數(shù)據(jù)庫(kù)中的編號(hào)為rs374703898，在ExAC中數(shù)據(jù)庫(kù)中顯示其突變頻率為0.00003，ClinVar數(shù)據(jù)庫(kù)將其定義為致病性突變(Allele ID:214262)，且已被HGMD數(shù)據(jù)庫(kù)收錄(CM140106)。InDel位點(diǎn)是在18號(hào)外顯子區(qū)的2244_2245位堿基發(fā)生了缺失(c.2244_2245delAA)，可導(dǎo)致其蛋白質(zhì)翻譯在第750位谷氨酸變成甘氨酸，并產(chǎn)生移碼，于第780位終止編碼(p.E750GfsX30)，產(chǎn)生截短的蛋白質(zhì)。該位點(diǎn)在dbSNP數(shù)據(jù)庫(kù)中的編號(hào)為rs587777139，在ExAC中數(shù)據(jù)庫(kù)中顯示其突變頻率為0.0001085，ClinVar數(shù)據(jù)庫(kù)將其定義為致病性突變(Allele ID:106546)，且已被HGMD數(shù)據(jù)庫(kù)收錄(CD140092)。

2.3 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物 Sanger測(cè)序驗(yàn)證

Sanger測(cè)序結(jié)果表明，先證者的無(wú)義突變位點(diǎn)c.1132C>T來(lái)自于父親，而移碼突變位點(diǎn)c.2244_2245delAA來(lái)自于母親，符合常染色體隱性遺傳共分離規(guī)律(圖2)。上述兩個(gè)位點(diǎn)在過(guò)去的文獻(xiàn)中已有報(bào)道[9，14-15]。由此判定，CSPP1基因的c.1132C>T以及c.2244_2245delAA的復(fù)合雜合突變?yōu)樵揓oubert綜合征患兒的致病性突變。

3 討論

Joubert綜合征最早于1969年被發(fā)現(xiàn)，是一種罕見(jiàn)的神經(jīng)系統(tǒng)疾病，除了影像學(xué)MRI中的“磨牙征”表現(xiàn)[16]以外，其臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)有以下4項(xiàng)：①小腦蚓部發(fā)育不全；②肌張力低；③發(fā)育遲緩；④異常呼吸或者異常眼運(yùn)動(dòng)[1，17]。由于Joubert綜合征的臨床表現(xiàn)具有很強(qiáng)的異質(zhì)性，目前國(guó)際上將所有具有“磨牙征”的疾病統(tǒng)稱為“Joubert綜合征及相關(guān)疾病”(JSRD)，并根據(jù)并發(fā)癥的不同將其分為6大類：①單純型Joubert綜合征；②Joubert綜合征合并眼部缺陷；③Joubert綜合征合并腎缺陷；④Joubert綜合征合并眼腎缺陷；⑤Joubert綜合征合并肝損害；⑥Joubert綜合征合并口面指(趾)缺陷[4，18]。本文報(bào)道的家系先證者，小腦蚓部“磨牙征”清晰可見(jiàn)，小腦下蚓部缺如，上蚓部發(fā)育不良，四肢肌張力低，發(fā)育落后，符合Joubert綜合征的基本特點(diǎn)。同時(shí)，該患兒無(wú)多指、無(wú)肝腎損傷、無(wú)眼組織缺損，考慮為單純型的Joubert綜合征。

A：c.1132C>T位點(diǎn)的Sanger測(cè)序峰圖；B：c.2244_2245delAA位點(diǎn)的Sanger測(cè)序峰圖

圖2 Sanger測(cè)序驗(yàn)證結(jié)果圖

目前國(guó)內(nèi)已報(bào)道Joubert綜合征病例70余例[19-20]，已明確致病基因及位點(diǎn)的有5例，致病基因分別是CC2D2A[21-22]、CEP290[23]、OFD[24]以及C5orf42[25]，均采用高通量測(cè)序技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)。全外顯子測(cè)序技術(shù)是近年來(lái)在遺傳性疾病檢測(cè)中應(yīng)用最廣泛的高通量測(cè)序技術(shù)[26]。鑒于目前已經(jīng)有30個(gè)Joubert綜合征致病基因被發(fā)現(xiàn)，且仍然有約40%的病例未在已知的致病基因中發(fā)現(xiàn)突變，因此我們選用了全外顯子組測(cè)序法進(jìn)行檢測(cè)。所得測(cè)序數(shù)據(jù)經(jīng)過(guò)標(biāo)準(zhǔn)分析流程，按照ACMG的解讀規(guī)則[13]對(duì)變異位點(diǎn)進(jìn)行解讀，最終在已知的致病基因CSPP1中篩選到了候選的致病突變位點(diǎn)。經(jīng)PCR擴(kuò)增及Sanger測(cè)序驗(yàn)證，并在父母中進(jìn)行比對(duì)和驗(yàn)證，證實(shí)了CSPP1的c.1132C>T，p.R378X以及c.2244_2245delAA，p.E750GfsX30位點(diǎn)是該家系的致病突變位點(diǎn)。有研究認(rèn)為CSPP1相較其它Joubert綜合征基因更容易表現(xiàn)出截短突變致病的特點(diǎn)[9]，本文所報(bào)道的兩個(gè)位點(diǎn)均產(chǎn)生截短翻譯的蛋白，與此研究相符。

CSPP1是第21個(gè)被發(fā)現(xiàn)的Joubert綜合征致病基因。2014年，Akizu等[14]在對(duì)287名Joubert綜合征患兒的外顯子組測(cè)序中發(fā)現(xiàn)有6名先證者攜帶有CSPP1的截短突變并且在家系中符合遺傳分離規(guī)律，因此確定CSPP1是Joubert綜合征的致病基因，他同時(shí)還發(fā)現(xiàn)，CSPP1突變?cè)斐傻腏oubert綜合征患兒通常僅有神經(jīng)系統(tǒng)的表現(xiàn)，沒(méi)有或者很少有腎臟損害、肝損害或者多指等其他伴發(fā)癥，僅在2名患兒中存在聽(tīng)力損傷的現(xiàn)象，因此傾向于認(rèn)為CSPP1與單純型的Joubert綜合征相關(guān)；幾乎同時(shí)，在另一個(gè)研究中，Tuz等在19名纖毛疾病的患兒中檢測(cè)到CSPP1的截短突變，這些患者都具有Joubert綜合征典型的“磨牙征”表型，同時(shí)還有一些患者具有窒息性胸廓發(fā)育不良的表現(xiàn)，比如鐘形胸廓，短肋骨等骨骼發(fā)育異?，F(xiàn)象[15]。而Shaheen等[27]在另外的2個(gè)加拿大哈特人的近親家系中檢測(cè)到3名患兒具有CSPP1的截短突變，其中有2名胎兒具有與Meckel綜合征相類似的表現(xiàn)。此后，在阿拉伯國(guó)家、韓國(guó)、日本等均發(fā)現(xiàn)因CSPP1突變而導(dǎo)致的遺傳性疾病案例[10，28-29]。這些研究結(jié)果提示CSPP1突變所導(dǎo)致的各個(gè)疾病之間表型存在很大的差異[30]。

在模式動(dòng)物中的機(jī)制研究表明，CSPP1基因的缺失會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重的纖毛發(fā)生缺陷。morpholino敲除cspp1的斑馬魚(yú)胚胎會(huì)表現(xiàn)出與其他斑馬魚(yú)Joubert綜合征模型一致的表型，比如體型彎曲、腎囊腫和小腦畸形等，CSPP1是通過(guò)降低纖毛標(biāo)記蛋白Arl13b的纖毛內(nèi)定位來(lái)實(shí)現(xiàn)其作用的[15]。有研究者通過(guò)RT-PCR的方法來(lái)比較成人的大腦、皮質(zhì)、小腦、胼胝體、腦橋以及胎兒的大腦、皮質(zhì)、小腦以及肝臟、心臟、腎臟中CSPP1的表達(dá)量水平，發(fā)現(xiàn)CSPP1在神經(jīng)組織中有大量表達(dá)，其中胎兒和成人的小腦中表達(dá)量最高[14]。此外，從CSPP1突變的Joubert綜合征患者身上分離的成纖維細(xì)胞也表現(xiàn)出纖毛數(shù)量減少或長(zhǎng)度變短等特點(diǎn)，并且檢測(cè)到纖毛標(biāo)記蛋白ARL13B在纖毛內(nèi)定位的減少，這些研究結(jié)果表明CSPP1通過(guò)對(duì)纖毛功能的影響導(dǎo)致了疾病的發(fā)生[14-15]。

本文采用全外顯子組測(cè)序技術(shù)，結(jié)合Sanger測(cè)序驗(yàn)證，檢測(cè)到了Joubert綜合征家系中CSPP1基因的兩個(gè)突變(c.1132C>T和c.2244_2245delAA)，是國(guó)內(nèi)首次報(bào)道由CSPP1基因突變引起的Joubert綜合征病例。這一研究結(jié)果為將來(lái)可能進(jìn)行的產(chǎn)前診斷提供了分子基礎(chǔ)。

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