邱順晨 姚小東 劉振齊 谷翊群 寧美英

國家衛(wèi)生計生委科學技術研究所藥物和醫(yī)用材料研究中心(北京，100081)

黃體功能不全不僅能導致閉經、功能性子宮出血等，還是造成不孕和流產的重要原因。因此，給予黃體支持成為多數輔助生殖技術的常規(guī)步驟之一。目前應用的黃體支持藥物主要有人絨毛膜促性腺激素(hCG)、天然黃體酮及人工合成的孕酮類激素。研究報道稱合成孕酮類激素具有致畸胎作用而天然黃體酮未見相關報道[1]。因此，以黃體酮為原料藥開發(fā)的黃體支持產品具有良好的市場前景和經濟效益。陰道給藥是一種新興的給藥系統，黃體酮緩釋凝膠Crinone是一種由微粉化黃體酮制備而成的供陰道給藥的凝膠劑。大量研究表明，Crinone不僅與肌注具有相同的療效[2-5]，還兼具陰道給藥的優(yōu)點。然而，Crinone仍然存在以下缺點：需要每天使用，患者順應性不好；藥物釋放不夠平穩(wěn)；凝膠易流出污染衣物。陰道環(huán)也是陰道給藥系統中的一個劑型[6]，相對于陰道凝膠，具有不需要每天給藥；患者可自行取放，順應性更好；不會污染衣物；藥物釋放更加平穩(wěn)等優(yōu)點。本研究采用了注塑成型法制備黃體酮陰道環(huán)[7]，建立了黃體酮陰道環(huán)中有關物質的高效液相色譜(HPLC)檢測方法并進行方法學驗證，旨為黃體酮陰道環(huán)制劑的體外質量控制提供參考。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑

黃體酮原料藥(云南麗江映華生物藥業(yè)有限公司，批號：1511001W)；MED-6382液體硅橡膠(美國Nusil Technology，批號：63227)；辛酸亞錫催化劑(美國Nusil Technology，批號：63227)；乙腈(Fisher公司，色譜純，批號：150011)；甲醇(Fisher公司，色譜純，批號：150939)。

1.2 儀器

Sartorius-BT224S 電子天平(北京賽多利斯儀器系統有限公司)；CSR-4-10超純水機(北京愛斯泰克科技開發(fā)有限公司)；陰道環(huán)模具(北京東洛機電有限責任公司)；ED23型烘箱(德國賓得公司)；藥物光照試驗箱(YG120,上海一恒科技有限公司)；RT5型磁力攪拌器(ZKA公司)；Waters2695高效液相色譜儀，Waters2487檢測器(Waters公司)；Diamonsil C8型液相色譜柱(北京迪科瑪科技有限公司)。

1.3 黃體酮陰道環(huán)的制備

將陰道環(huán)模具置80℃的烘箱中預熱15min。稱取黃體酮1.33g，MED6382硅橡膠10g，混合均勻后按照100:0.5的比例加入辛酸亞錫催化劑，繼續(xù)攪拌15s?？焖賹⒒旌衔锛尤氲?0ml注射器中，勻速且快速地注入到預熱好的模具中。將模具放到80℃烘箱中加熱30min，成型后開模取出即得。

1.4 實驗方法

1.4.1 HPLC檢測條件色譜柱Diamonsil C8(250 mm × 4.6 mm，5 μm)；流動相甲醇-乙腈-水(31:35:34，v/v)；檢測波長241 nm；流速1.5 ml/min；進樣量10 μl；柱溫30℃。

1.4.2供試品溶液的配制取黃體酮基質型陰道環(huán)(含黃體酮400 mg)，切成0.5mm薄片，置于裝有100 ml甲醇的錐形瓶中，室溫下磁力攪拌24h后， 經0.45μm 濾膜濾過。取續(xù)濾液1ml于100ml量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻。取1 ml稀釋液于25 ml的容量瓶中，加甲醇-乙腈-水(31:35:34，v/v)稀釋至刻度，搖勻，于4℃冷藏，備用。

1.4.3自身對照溶液的配制精密量取1.4.2項下黃體酮供試品溶液1.0 ml，置于100 ml量瓶中，用甲醇-乙腈-水(31:35:34，v/v)稀釋至刻度，搖勻，得黃體酮自身對照溶液，于4℃冷藏，備用。

1.5 專屬性試驗

1.5.1空白干擾按照1.3的方法制備2個空白陰道環(huán)，再將其均勻切成薄片(厚度0.5 mm)，置于裝有100ml甲醇的具塞錐形瓶中，磁力攪拌24h，經0.45μm 濾膜濾過，取續(xù)濾液1.0 ml置于10 ml量瓶中，用流動相稀釋至刻度，HPLC法檢測，記錄色譜圖。

1.5.2酸破壞取黃體酮陰道環(huán)，切成0.5mm 薄片，置于具塞錐形瓶中，再加1mol/L 鹽酸溶液適量，于室溫放置24h，加0.1mol/L NaOH 溶液調節(jié)至中性，加100ml甲醇。室溫下磁力攪拌24h，經0.45μm 濾膜濾過，取續(xù)濾液1 ml于100 ml容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻。取1 ml稀釋液于25 ml的容量瓶中，加甲醇-乙腈-水(31:35:34，v/v)稀釋至刻度，搖勻，HPLC法檢測，得到峰面積數據。

1.5.3堿破壞取黃體酮陰道環(huán)，切成0.5mm 薄片，置于具塞錐形瓶中，加入1 mol/L NaOH溶液適量， 于室溫放置24h， 加0.1 mol/L 鹽酸溶液調節(jié)至中性，再加100ml甲醇。同1.5.2方法制備供試品溶液，HPLC法檢測，得到峰面積數據。

1.5.4氧化破壞取黃體酮陰道環(huán)，切成0.5 mm薄片。加3% 過氧化氫試液適量，室溫放置8h，加100ml甲醇。同1.5.2方法制備供試品溶液，HPLC法檢測，得到峰面積數據。

1.5.5高溫破壞取黃體酮陰道環(huán)，切成0.5mm 薄片，置于具塞錐形瓶中，于60℃烘箱中放置24h后取出，放至室溫，加100ml甲醇。同1.5.2方法制備供試品溶液，HPLC法檢測，得到峰面積數據。

1.5.6光照破壞取黃體酮陰道環(huán)，切成0.5 mm 薄片。于( 4500±500) Lx光照條件下放置48h，置于具塞錐形瓶中，加100 ml甲醇。 同1.5.2方法制備供試品溶液，HPLC法檢測，得到峰面積數據。

1.6 檢測限

將黃體酮對照品儲備液進行稀釋，按照1.4.1 HPLC檢測條件進行HPLC檢測， 直到信噪比(S/N)為3/1，計算得到檢測限。

1.7 重復性試驗

按1.4.2方法平行制備黃體酮供試品溶液，按1.4.3方法平行制備黃體酮自身對照溶液各6份，進行HPLC檢測。按主成分自身對照法計算黃體酮中未知雜質含量。

1.8 溶液穩(wěn)定性試驗

取黃體酮供試品溶液，按照1.4.1項下色譜條件，分別于0，4，8，12，24h時進行HPLC檢測， 記錄主成分、有關物質及雜質的峰面積，考察樣品穩(wěn)定性。

1.9 有關物質檢查

取3批黃體酮陰道環(huán)，制備黃體酮供試品溶液及自身對照溶液，分別精密量取10μl及自身對照溶液10μl注入液相色譜儀，調節(jié)檢測靈敏度，使主成分色譜峰的峰高約為滿量程的10%，再精密量取供試品溶液和對照液各10μl，分別進行HPLC檢測，記錄色譜圖至黃體酮峰保留時間的2倍。供試品溶液色譜圖中如有雜質峰，用自身對照法計算雜質的含量。

2 結果

2.1專屬性實驗

2.1.1空白干擾試驗黃體酮檢測條件下的空白陰道環(huán)HPLC檢測圖譜見圖1。結果表明，在黃體酮相應的保留時間并無其他峰出現，說明空白陰道環(huán)的硅橡膠輔料并不會對黃體酮的相關檢測產生干擾。

2.1.2強制降解試驗結果見圖2所示。黃體酮陰道環(huán)經酸、堿、氧化、高溫、光照破壞后，黃體酮會有輕微的降解，但是各降解產物峰與主要兩峰均可達到良好分離。

圖1黃體酮檢測條件下空白陰道環(huán)HPLC檢測圖譜

圖2在未處理(A)、酸(B)、堿(C)、氧化(D)、高溫(E)、光照(F)條件下黃體酮陰道環(huán)HPLC檢測圖譜

2.2 檢測限

黃體酮陰道環(huán)中黃體酮HPLC檢測限為0.5 ng/ml。

2.3 重復性實驗

6份供試品溶液中黃體酮雜質總和的相對標準偏差(RSD)為1.8 %，重復性良好。

2.4 溶液穩(wěn)定性實驗

黃體酮供試品溶液在24 h內雜質峰面積總和RSD為1.9 %，表明黃體酮供試品溶液在24 h內均基本穩(wěn)定。

2.5 有關物質檢查

3批樣品測定結果見表1。統計結果表明，所制備的3批樣品在黃體酮HPLC檢測條件下，單雜質和總雜質含量均<0.5%，符合藥典要求。

表1 黃體酮陰道環(huán)中黃體酮HPLC檢測的雜質含量(%)

3 討論

本研究對2015版藥典中黃體酮的有關物質的檢測方法進行了優(yōu)化，經過不斷的摸索，將原有的甲醇-乙腈-水(25:35:40，v/v)調整為甲醇-乙腈-水(31:35:34，v/v)，實驗結果顯示，該比例下分離效果更好，峰形也更優(yōu)。

由于陰道環(huán)制劑的特殊性，藥物從硅橡膠中的徹底提取相對困難，因此對于藥物的提取方法也進行了優(yōu)化，通過對超聲法、磁力攪拌法及兩者結合法的考察，篩選了甲醇、乙腈兩種提取溶劑，考察了不同的磁力攪拌時間，最終選擇室溫下磁力攪拌24h作為藥物的提取方法。

本研究采用不加校正因子的主成分自身對照法對黃體酮陰道環(huán)中的有關物質進行檢測。專屬性實驗結果表明輔料完全不干擾主藥黃體酮的測定。有關物質檢查結果表明，單雜質和總雜質含量均<0.5%，也不會對主藥的檢測結果產生干擾。

國內尚無關于黃體酮陰道環(huán)中有關物質的檢測方法的報道，本研究優(yōu)化了流動相比例，將HPLC法應用于黃體酮陰道環(huán)的有關物質的檢測，經方法學驗證，此法的專屬性強，靈敏度高，符合相關規(guī)定的要求，可以為黃體酮陰道環(huán)質量標準的制訂提供科學依據。

參考文獻

[1] 陳紅，宋學菇，隨笑琳，等. 口服黃體酮在黃體支持中的作用 [J]. 中國婦幼保健, 2009, 24(11): 1526-1528.

[2] Berger BM, Philips JA. Pregnancy outcomes in oocyte donation recipients: vaginal gel versus intramuscular injection progesterone replacement [J]. J Assist Reprod Genet, 2012, 29(3): 237-242.

[3] Penzias AS, Alper MM. Luteal support with vaginal micronized progesterone gel in assisted reproduction [J]. Reprod Biomed Online, 2003, 6(3): 287-295.

[4] Gibbons WE, Toner JP, Hamacher P, et al. Experience with a novel vaginal progesterone preparation in a donor oocyte program [J]. Fertil Steril, 1998, 69(1): 96-101.

[5] Schoolcraft WB, Hesla JS, Gee MS. Experience with progeterone gel for luteal support in a highly successful IVF progromme [J]. Hum Reprod, 2000, 15(6): 1284-1288.

[6] Woolfson AD，Malcolm RK，Gallagher R. Drug delivery by the intravaginal route [J]. Crit Rev Ther Drug Carrier Syst, 2000, 17(5): 509-555.

[7] 姚小東，寧美英. 黃體酮給藥系統的研究進展 [J]. 中國計劃生育學雜志，2014，22(12)：855-858.