黃懋敏 董丹丹 亓丹丹 凌 晨 張丁丁

(遵義醫(yī)學(xué)院免疫教研室，遵義 563000)

慢性萎縮性胃炎(Chronic atrophic gastritis,CAG)是以胃黏膜萎縮變薄、胃肌層增厚、局部或廣泛性固有腺體減少或消失為主要病理特征，伴或不伴腸上皮化生(Intestinal metaplasia)、上皮內(nèi)瘤變(Dysplasia)的消化系統(tǒng)常見疾病。CAG的致病機(jī)制尚待闡明，已有報(bào)道顯示幽門螺旋桿菌(Helicobacter pylori，Hp)感染、自身免疫性因素、遺傳因素以及吸煙、酗酒等可能與CAG的發(fā)病有關(guān)[1],其中Hp感染是重要的危險(xiǎn)因素之一。

Hp是一種在人胃黏膜有很強(qiáng)定植能力的革蘭氏陰性菌，全球成年人中約50%左右感染Hp[2]。Hp是慢性活動(dòng)性胃炎的主要致病因子，可引起持續(xù)性炎癥反應(yīng)，若不及時(shí)治療，有1/3患者將發(fā)展為CAG[3]。據(jù)報(bào)道，有80%的中重度CAG患者體內(nèi)存在Hp的抗體[3]。1994年IARC已將Hp列為Ⅰ類致癌物[4]，Hp感染后中性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞等聚集，誘導(dǎo)多種促炎癥因子的釋放，引起持續(xù)性活動(dòng)性炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致胃黏膜損傷、腺體萎縮，從而促進(jìn)慢性胃炎由淺表性胃炎逐漸向萎縮性胃炎甚至胃癌的發(fā)生發(fā)展[5]。但炎癥因子在Hp感染引起胃黏膜萎縮乃至癌變中的作用尚存爭(zhēng)議[6,7]，有待明確。

本研究通過PCR熒光法對(duì)CAG患者胃黏膜組織進(jìn)行Hp檢測(cè)，用免疫組化方法檢測(cè)轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β受體Ⅱ(Transforming growth factor-β receptorⅡ，TGF-βRⅡ)、白介素6(Interleukin-6 ，IL-6)和腫瘤壞死因子α(Tumor necrosis factor-α，TNF-α)在胃黏膜中的表達(dá)，旨在研究CAG患者TGF-βRⅡ、IL-6和TNF-α的表達(dá)與Hp感染及與胃黏膜病理特征之間的關(guān)系，為CAG的致病機(jī)制提供新思路。

1 資料與方法

1.1資料

1.1.1臨床資料 采集2016年1月～12月四川省人民醫(yī)院經(jīng)胃鏡和病理檢查共同診斷為CAG患者76例，其中男性34例，女性42例，年齡24～81歲，平均年齡(53.54±13.98)歲。取其胃鏡活檢標(biāo)本，位于胃竇小彎側(cè)距幽門2～3 cm或病變明顯組織處胃黏膜組織。診斷標(biāo)準(zhǔn)參照2012年中國(guó)慢性胃炎共識(shí)意見[8]?；颊邫z查前1周未服用抗生素,黏膜保護(hù)劑及質(zhì)子泵抑制劑等治療，且無其他器質(zhì)性病變。

1.1.2主要實(shí)驗(yàn)試劑和儀器 石蠟包埋組織基因組DNA提取試劑盒(UPTECHTM)，幽門螺旋桿菌核酸檢測(cè)試劑盒(PCR熒光法，北京新基永康生物科技有限公司)，兔抗人TGF-βRⅡ多克隆抗體(美國(guó)NOVUS公司，21850002)、兔抗人IL-6多克隆抗體(美國(guó)NOVUS公司，NB600-1131)、兔抗人TNF-α多克隆抗體(美國(guó)NOVUS公司，NB600-587)，Envision/HRP鼠或兔多克隆抗體(丹麥Dako公司Dako REALTMEnvisionTMDetectionSystem,Peroxidase/DAB+,Code K5007)；ABI Prism7500熒光定量PCR儀。

1.2方法

1.2.1PCR熒光探針技術(shù)檢測(cè)Hp

1.2.1.1DNA提取 取8 μmol/L的石蠟組織薄片6～8張，放入無菌的EP管中，按照石蠟包埋組織基因組DNA提取試劑盒使用說明提取組織DNA，提取后的DNA進(jìn)行核酸濃度測(cè)定。

1.2.1.2幽門螺旋桿菌核酸檢測(cè)(PCR熒光法) 采用Hp核酸檢測(cè)試劑盒對(duì)已提取的DNA進(jìn)行Hp檢測(cè)。通過內(nèi)標(biāo)正常人上皮細(xì)胞中廣泛存在的核糖核酸酶P(RNP)的DNA和外標(biāo)對(duì)照品(Hp陽(yáng)性對(duì)照和Hp陰性對(duì)照)，對(duì)檢測(cè)過程進(jìn)行全程質(zhì)量控制。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后由兩名技術(shù)人員根據(jù)熒光PCR儀自動(dòng)設(shè)置的閾值線以及熒光閾值(Ct值)的大小對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行判讀。VIC熒光指示內(nèi)標(biāo)RNP，F(xiàn)AM熒光指示HP(圖1)。Hp陰性對(duì)照為FAM和VIC兩種熒光信號(hào)均無明顯增長(zhǎng)，并無明顯S型擴(kuò)增曲線；Hp陽(yáng)性對(duì)照為FAM和VIC兩種熒光信號(hào)均有明顯增長(zhǎng)，有典型的S型曲線；Hp陰性樣本為只有VIC熒光信號(hào)而沒有FAM熒光信號(hào)；Hp陽(yáng)性樣本與Hp陽(yáng)性對(duì)照一致。

1.2.2TGF-βRⅡ、IL-6和TNF-α的表達(dá) 采用免疫組化Envision兩步法，檸檬酸高壓修復(fù)抗原。具體如下：石蠟切片常規(guī)脫蠟水化，置于檸檬酸鹽抗原修復(fù)液(pH6.0)，經(jīng)高壓鍋加熱行抗原修復(fù)；3%雙氧水水浴15 min；將切片置于Harris蘇木素染液中進(jìn)行復(fù)染1 min，滴加一抗，TGF-βRⅡ、IL-6和TNF-α抗體的稀釋比例分別是1∶100、1∶1 600和1∶400，4℃孵育過夜；PBS洗5 min×3次，滴加Envision/HRP二抗，37℃孵育30 min，取出后PBS清洗5 min×3次；新鮮配制的DAB顯色，梯度酒精(酒精濃度由低到高)充分脫水；中性樹膠封片液封片。以PBS代替一抗作為陰性對(duì)照組。

1.2.3結(jié)果判定 由兩名未參與實(shí)驗(yàn)的高年資病理科醫(yī)生獨(dú)立觀察切片，協(xié)助判斷免疫組化結(jié)果。TGF-βRⅡ主要定位在細(xì)胞膜，陽(yáng)性物質(zhì)呈棕黃色；IL-6定位在細(xì)胞質(zhì)中，陽(yáng)性物質(zhì)呈棕黃色；TNF-α定位在細(xì)胞質(zhì)，陽(yáng)性物質(zhì)呈棕黃色。按切片中細(xì)胞染色強(qiáng)度(A)記分：0分為細(xì)胞無染色，1分為染色呈淺黃色，2分為棕黃色，3分為褐色；再按切片中顯色細(xì)胞所占比例(B)記分：每片隨機(jī)觀察5個(gè)具有代表性的高倍視野，計(jì)數(shù)500個(gè)細(xì)胞中的染色陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，0分為染色細(xì)胞<5%，1分為5%～25%，2分為25%～50%，3分為50%～75%，4分為>75%。每張切片細(xì)胞染色積分=A×B,0分為陰性(-)，1～4分為弱陽(yáng)性(+)，6～8分為陽(yáng)性(++)，9～12分為強(qiáng)陽(yáng)性(+++)[9,10]。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS20軟件進(jìn)行生物學(xué)統(tǒng)計(jì)分析。基于實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)為等級(jí)資料及特征，組間采用Wilcoxon秩和檢驗(yàn)進(jìn)行差異性分析，經(jīng)Spearman秩相關(guān)性檢驗(yàn)進(jìn)行相關(guān)性分析，P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1CAG患者中的Hp感染情況 經(jīng)PCR熒光法檢測(cè)76例CAG患者Hp感染情況，Hp感染陰性組34例，其中女性19例，男性15例；Hp感染陽(yáng)性組42例，其中女性23例，男性19例。見圖1。

圖1 PCR熒光法檢測(cè)CAG患者結(jié)果圖Fig.1 PCR fluorescence detection of CAG patientsNote:A.Negative control;B.Positive control;C.Negative case;D.Positive case.

表1CAG患者Hp陰性和Hp陽(yáng)性組TGF-βRⅡ、IL-6和TNF-α在胃小凹上皮和間質(zhì)炎細(xì)胞中的表達(dá)

Tab.1ExpressionofTGF-βRⅡ,IL-6andTNF-αingastricfoveolarepithelialandstromalinflammatorycellswithCAGpatientsinHp-negativeandHp-positivegroup

HpinfectionHp(-)(n=34)Hp(+)(n=42)Total(n=76)ZPIL?6expressedingastricfoveolarepithelial-0(0%)1(2%)1(1%)-05670571+13(38%)18(43%)31(41%)++18(53%)19(45%)37(48%)+++3(9%)4(10%)7(10%)IL?6expressedinstromalinflammatorycells-3(9%)3(7%)6(8%)-22390025+27(79%)23(55%)50(66%)++3(9%)13(31%)16(21%)+++1(3%)3(7%)4(5%)TNF?αexpressedingastricfoveolarepithelial-1(3%)1(2%)2(3%)-13160188+2(6%)4(10%)6(8%)++7(21%)14(33%)21(28%)+++24(70%)23(55%)47(61%)TNF?αexpressedinstromalinflammatorycells-0(0%)2(5%)2(3%)-02660790+10(29&)5(12%)15(20%)++7(21%)15(36%)22(29%)+++17(50%)20(47%)37(48%)TGF?βRⅡexpressedingastricfoveolarepithelial-1(3%)0(0%)1(1%)-12710204+3(9%)6(14%)9(12%)++13(38%)22(52%)35(46%)+++17(50%)14(33%)31(41%)TGF?βRⅡexpressedinstromalinflammatorycells-2(6%)0(0%)2(3%)-02130832+2(6%)2(5%)4(5%)++16(47%)26(62%)42(55%)+++14(41%)14(33%)28(37%)ChronicinflammationMild10(29%)3(7%)13(17%)-33300001Moderate21(62%)24(57%)45(59%)Severe3(9%)15(36%)18(24%)AtrophyMild17(50%)29(69%)46(61%)-15410123Moderate13(38%)9(21%)22(29%)Severe4(12%)4(10%)8(10%)IntestinalmetaplasiaNone11(32%)18(43%)29(38%)-11360256Mild10(29%)14(33%)24(32%)Moderate9(27%)5(12%)14(18%)Severe4(12%)5(12%)9(12%)DysplasiaNone16(47%)25(60%)41(54%)-10770282Lowgrade18(53%)17(40%)35(46%)

2.2TGF-βRⅡ、IL-6和TNF-α在胃小凹上皮和間質(zhì)炎細(xì)胞中的表達(dá)

2.2.1TGF-βRⅡ、IL-6和TNF-α與Hp的關(guān)系 ①在間質(zhì)炎細(xì)胞中IL-6的表達(dá)，Hp陰性組以弱陽(yáng)性為主(79%)，Hp陽(yáng)性組也以弱陽(yáng)性為主(55%)，但陽(yáng)性和強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)明顯多于Hp陰性組(圖2)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.025)。②在間質(zhì)炎細(xì)胞中，TNF-α在兩組中以強(qiáng)陽(yáng)性為主，TGF-βRⅡ在兩組中均以陽(yáng)性為主，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。③在小凹上皮中，IL-6在兩組中都以弱陽(yáng)性為主，TNF-α在兩組中均以強(qiáng)陽(yáng)性為主，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，TGF-βRⅡ雖然在Hp陰性組以強(qiáng)陽(yáng)性為主，Hp陽(yáng)性組以陽(yáng)性為主，但是兩組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

圖2 HP陰性和Hp陽(yáng)性組中IL-6的免疫組化結(jié)果(En-vision法，20×10倍)Fig.2 Immunohistochemical staining of IL-6 in Hp negat-ive and Hp positive groups(Envision，20×10)Note:A.Hp(-)；B.Hp(+).

2.2.2CAG患者中慢性炎癥程度與Hp的關(guān)系 慢性炎癥程度在Hp陰性組以中度為主，輕度次之，在Hp陽(yáng)性組以中度為主，重度次之，兩組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.001,P<0.05)。見表1。

2.2.3不同慢性炎癥程度下間質(zhì)炎細(xì)胞中IL-6的表達(dá) 在76例CAG患者中，慢性炎癥程度以中度為主，間質(zhì)炎細(xì)胞中IL-6以弱陽(yáng)性為主，間質(zhì)炎細(xì)胞中IL-6的表達(dá)與慢性炎癥程度呈正相關(guān)關(guān)系(P=0.03，r=0.249),見表2。

表2不同慢性炎癥程度下間質(zhì)炎細(xì)胞IL-6的表達(dá)情況

Tab.2ExpressionofIL-6instromalinflammatorycellswithchronicinflammation

ChronicinflammationMildModerateSevereTotal-3(23%)3(7%)0(0%)6+9(69%)29(64%)12(67%)50++0(0%)12(27%)4(22%)16+++1(8%)1(2%)2(11%)4Total13451876

表3CAG患者不同病理特征與TGF-βRⅡ、IL-6和TNF-α之間的相關(guān)性

Tab.3CorrelationbetweendifferentpathologicalfeaturesandTGF-βRII,IL-6andTNF-αinpatientswithCAG

ChronicinflammationAtrophyIntestinalmetaplasiaDysplasiaGastricfoveolarepithelialIL?6TNF?αTGF?βRⅡStromalinflammatorycellsIL?6TNF?αTGF?βRⅡChronicr1000016001570156-0004-0129-011002591)-0069-0167InflammationP016801770179097402670344003005520149Atrophyr0160100006972)03662)0177000500410071-0099-0071P016800000001012609690727054403950541Intestinalr015706972)100005522)02391)0122007600640037-0086MetaplasiaP017700000000003802940512058507490461Dysplasiar015603662)05222)10000127-00130162-00100000093P017900000000027309140163093110000426

Note：1)P<0.05；2)P<0.01.

表4不同萎縮程度下，腸上皮化生和上皮內(nèi)瘤變的表現(xiàn)情況

Tab.4Expressionofintestinalmetaplasiaanddysplasiaindifferentatrophicseverity

AtrophyMildModerateSevereTotalIntestinalmetaplasiaNone25(54%)4(18%)0(0%)29Mild20(43%)4(18%)0(0%)24Moderate1(2%)12(55%)1(13%)14Severe0(0%)2(9%)7(87%)9DysplasiaNegative32(70%)6(27%)3(38%)41Lowgrade14(30%)16(73%)5(62%)35

2.2.4不同慢性萎縮程度下腸上皮化生的情況(表3、4) 在76例CAG患者中，萎縮程度為輕度時(shí)，腸上皮化生以陰性為主，中度時(shí)腸上皮化生以中度為主，重度時(shí)腸上皮化生以重度為主，萎縮程度與腸上皮化生嚴(yán)重程度呈正相關(guān)關(guān)系(r=0.697)。

2.2.5不同慢性萎縮程度下上皮內(nèi)瘤變的情況 在76例CAG患者中，萎縮程度為輕度時(shí)，上皮內(nèi)瘤變以陰性為主，中度和重度時(shí)上皮內(nèi)瘤變以灶性低級(jí)別為主，萎縮程度與上皮內(nèi)瘤變程度呈正相關(guān)關(guān)系(r=0.366)。見表3、4。

3 討論

CAG是一種慢性炎癥過程，每年發(fā)病率為0～11%，其中無Hp感染的人群中CAG發(fā)病率低于1%[11]。Hp感染陽(yáng)性患者較陰性患者出現(xiàn)CAG的概率要高[12,13]。Hp感染后可促使免疫活性細(xì)胞釋放生長(zhǎng)因子、增殖因子、促炎癥細(xì)胞因子和抗炎癥細(xì)胞因子等[5]，通過多種方式作用于胃黏膜，在CAG的發(fā)病中發(fā)揮作用。

IL-6常通過激素樣物質(zhì)來調(diào)節(jié)機(jī)體內(nèi)分泌過程[14]，在持續(xù)性炎癥和失控性炎癥反應(yīng)中是最豐富的細(xì)胞因子[15]，具有促炎癥和抗炎癥雙重生物學(xué)效應(yīng)，通過產(chǎn)生不同的效應(yīng)來平衡體內(nèi)促炎和抗炎反應(yīng)[16,17]。在炎癥過程中，IL-6可以促進(jìn)中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞在炎癥及感染部位的聚集，防止組織的過度損傷[18,19]，在Hp感染引起的炎癥反應(yīng)中可過度表達(dá)[20]。在本實(shí)驗(yàn)中，間質(zhì)炎細(xì)胞中IL-6的表達(dá)與Hp感染有關(guān)，且隨著慢性炎癥程度的增加，IL-6在間質(zhì)炎細(xì)胞中的表達(dá)也增加，與慢性炎癥程度呈正相關(guān)關(guān)系，提示IL-6是CAG患者慢性炎癥中的重要介質(zhì)，在間質(zhì)炎細(xì)胞中Hp感染促進(jìn)IL-6的分泌，可能發(fā)揮著促進(jìn)炎癥的作用。在小凹上皮中IL-6的表達(dá)可能與Hp感染并無關(guān)聯(lián)，機(jī)制尚待探明。

TGF-β是一種多功能細(xì)胞因子，其生物學(xué)效應(yīng)是通過受體(TGF-βRⅠ、TGF-βRⅡ、TGF-βRⅢ等)轉(zhuǎn)導(dǎo)信號(hào)來完成，參與多條信號(hào)通路。TGF-β/TGF-βRⅡ信號(hào)通路可以通過腫瘤抑制途徑來調(diào)節(jié)胃癌的發(fā)生[21,22]，TGF-βRⅡ表達(dá)減少可以影響該信號(hào)通路對(duì)腫瘤抑制途徑的調(diào)節(jié)和加重組織的炎癥反應(yīng)[23]。2004年Liu等[24]在研究TGF-β對(duì)細(xì)胞增殖作用的時(shí)候提出Hp感染可能會(huì)削弱TGF-β對(duì)細(xì)胞增殖的抑制作用，通過降低TGF-βRⅠ和TGF-βRⅡ的表達(dá)使胃黏膜大量增生。2010年Jo等[25]研究發(fā)現(xiàn)在Hp感染陽(yáng)性慢性胃炎和胃潰瘍患者中TGF-βRⅠ和TGF-βRⅡ的表達(dá)比Hp感染陰性組顯著降低。2016年Ana等[26]在51例慢性胃炎(含慢性非萎縮性胃炎)患者中，采用免疫組化的方法發(fā)現(xiàn)TGF-βRⅡ在間質(zhì)炎細(xì)胞中的表達(dá)Hp陽(yáng)性組強(qiáng)于陰性組，在小凹上皮中Hp陽(yáng)性組表達(dá)弱于陰性組，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。本實(shí)驗(yàn)中，TGF-βRⅡ在CAG患者小凹上皮和間質(zhì)炎細(xì)胞中表達(dá)，在Hp陽(yáng)性組和Hp陰性組差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。TGF-βRⅡ在Hp相關(guān)性炎癥過程中的作用有待深入研究。

TNF-α是炎癥過程中的重要介質(zhì)，也是關(guān)鍵的腫瘤啟動(dòng)因子[27]，在消化性潰瘍患者中TNF-α在Hp陽(yáng)性組過度表達(dá)，明顯高于Hp陰性組，在胃癌的發(fā)展過程中也會(huì)持續(xù)高表達(dá)[28-30]。2016年Ana等[26]對(duì)51例慢性胃炎患者進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，TNF-α在間質(zhì)炎細(xì)胞中的表達(dá)Hp陽(yáng)性組明顯強(qiáng)于陰性組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但在小凹上皮的表達(dá)Hp陽(yáng)性組和Hp陰性組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。本實(shí)驗(yàn)中，TNF-α在胃黏膜(小凹上皮和間質(zhì)炎細(xì)胞)中Hp陽(yáng)性組和Hp陰性組表達(dá)差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。不同研究小組結(jié)論出現(xiàn)不同，提示TNF-α可能經(jīng)其他致炎機(jī)制或信號(hào)通路參與炎癥過程，也可能與長(zhǎng)時(shí)間活動(dòng)性炎癥反應(yīng)過程中多種細(xì)胞因子綜合作用有關(guān)。

CAG作為胃癌癌前病變之一，本實(shí)驗(yàn)顯示萎縮程度與腸上皮化生和上皮內(nèi)瘤變關(guān)系密切，隨著萎縮程度的增加，發(fā)生腸上皮化生和上皮內(nèi)瘤變的概率和嚴(yán)重程度也增加，與文獻(xiàn)報(bào)道一致[31]。由于時(shí)間所限，樣本量偏少,有待進(jìn)一步增加樣本量，為深入研究CAG致病機(jī)制提供幫助。

IL-6與Hp相關(guān)性CAG患者的慢性炎癥程度有關(guān)，慢性萎縮程度促進(jìn)腸上皮化生和上皮內(nèi)瘤變的發(fā)生，提示CAG患者的早期診斷和治療是預(yù)防胃癌的關(guān)鍵，有助于降低胃癌的發(fā)生率。

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