林美娜 章 濤 梅序橋 許瑞元

(漳州衛(wèi)生職業(yè)學院,漳州 363000)

類風濕關節(jié)炎(Rheumatoid arthritis,RA)是一種病因未明的以慢性、對稱性、多關節(jié)滑膜炎和關節(jié)結構破壞為主要特征的自身免疫性疾病[1]。有研究指出，TRAIL在RA中具有雙重角色[2]，同時與TRAIL誘導凋亡抵抗的RAFLS和TRAIL與RA中促進疾病活動有關。吳鳳霞等[3]研究認為RA滑膜組織中抗凋亡分子FLIP表達增高,而且與RA滑膜炎癥程度積分相關。在多種腫瘤和炎癥反應中，c-FLIP阻斷腫瘤壞死因子α(TNF-α)、Fas配體(FasL)和TRAIL等誘導的凋亡[4]。另外，臧鳳琳等[5]研究認為c-FLIP對TRAIL生物治療具有輔助作用。

有關RA患者中凋亡相關蛋白TRAIL、c-FLIP等的研究目前多基于滑膜細胞，在外周血細胞當中研究甚少。取材的有創(chuàng)性使得滑膜細胞的研究受到一定的限制。由于RA是一種系統(tǒng)性炎癥性疾病，其免疫病理事件涉及循環(huán)中大部分的淋巴細胞、單核細胞等，且關節(jié)內的活化炎癥細胞均可由外周激活的細胞池中募集而來。因此，對PBMC 的研究可能更能反映患者的整體病理狀況[6]。本研究通過分析RA患者外周血單個核細胞TRAIL、c-FLIP、caspase-8等基因的表達情況，探討其在RA中的臨床意義，為RA 的臨床診治尋找更有效的途徑和方法提供實驗基礎。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1研究對象 選擇從2014年1月至2015年6月入住漳州市醫(yī)院血液風濕內科的患者60例，按RA疾病活動指數(shù)(DAS28)分為低度活動期(L)組(DAS28<3.2)、中度活動期(M)組(DAS28 3.2～5.1)、高度活動期(H)組(DAS28>5.1)。其中L組22例，M組20例，H組18例。女40例，男20例，患者32～78歲，平均年齡(46.75±13.52)歲。RA的診斷標準為2010年美國風濕病學會與歐洲風濕病學會聯(lián)合提出的類風濕關節(jié)炎診斷標準[7]。

對照(N)組為門診健康體檢者，共25例，其中女18例，男7例，31～80歲，平均年齡(45.35±14.02)歲。與RA患者相比性別、年齡構成無統(tǒng)計學差異(P>0.05)。排除其他自身免疫系統(tǒng)等疾病。

1.1.2主要試劑 促凝管(長庚醫(yī)療器械公司)；引物序列(上海生工有限公司)；Anti-TNFSF10/TRAIL Antibody(aa31-80)、Anti-CFLAR TRUEMAB Antibody Clone OTI2D3(ORIGENE)；Caspase-8 Antibody、Beclin 1 Antibody(藥明康德)；HRP標記的抗兔二抗、RNA提取試劑盒、反轉錄試劑盒以及熒光定量PCR試劑盒(北京全式金生物技術有限公司)。

1.2方法

1.2.1臨床資料的收集 對60例RA患者的臨床資料進行收集整理，包括：①患者的一般情況：性別、年齡、病程以及用藥情況；②患者病例情況：晨僵持續(xù)時間、疼痛持續(xù)時間、疼痛程度、疼痛28關節(jié)計數(shù)、疼痛總數(shù)、活動度(DAS28);③類風濕因子RF、超敏C反應蛋白、血沉(ESR)、抗CCP等相關輔助檢查結果信息。

1.2.2PBMC的提取和處理 分別采RA患者和健康人靜脈血2 ml，置于真空采血管中(抗凝劑)，采用Ficoll-Hypaque密度梯度離心法分離PBMC[8]，一部分加入1 ml RNA 提取試劑，吹打混勻，放入-20℃冰箱過夜保存，另一部分保存用于后續(xù)試驗。

1.2.3采用熒光定量PCR檢測TRAIL、c-FLIP、caspase-8等mRNA的表達 總RNA的提取參照RNA提取試劑盒說明書。1%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA質量，紫外分光光度計檢測RNA濃度及純度。取單個核細胞經PBS洗滌2次后，再加入1 ml Trizol混勻；加入氯仿200 μl劇烈混勻，室溫靜置5 min；4℃ 12 000 r/min離心5 min，將400 μl上層水相轉移到新的EP管中；加500 μl預冷異丙醇，靜置10 min后，4℃ 12 000 r/min離心10 min；加入無水乙醇1 ml洗滌沉淀物，4℃ 8 000 r/min離心5 min；加入DEPC水20～80 μl，56℃助溶，總RNA經紫外分光光度計定量OD260∶OD280≥1.8，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

RNA逆轉錄：按RNA逆轉錄試劑盒TransScript Reverse Transcriptase[M-MLV,RNaseH](Cat.No.:AT101-02)說明書操作。反應條件：Step 1，42℃ 15 min；Step 2，85℃ 5 s。得到的cDNA放置-20℃冰箱中備用，或者立即用于Real-time qPCR反應。Real-time qPCR反應體系及反應條件的優(yōu)化，采用北京全式金生物技術有限公司(TransGen)熒光定量PCR試劑盒2×TransStarTMTop Green qPCR SuperMix(Cat.No.:AQ131-02)進行Real-time qPCR試驗，優(yōu)化Real-time qPCR反應體系及反應條件，確定最佳的模板濃度、退火溫度，確保PCR引物的特異性及PCR擴增效率(引物見表1)。

優(yōu)化Real-time qPCR擴增反應體系及反應條件后，進行正式試驗。Real-time qPCR擴增反應體系(見表2) 要在冰上進行配制。每個反應重復3次，配制反應體系時先配制總的反應液，再各個分裝。選擇Bio-Rad CFX96熒光定量PCR儀進行定時定量PCR反應。反應結束后，以GAPDH為內參基因，2-ΔΔCt法分析基因表達水平，比較各基因在不同組織樣本中的表達差異，得到表達差異分析結果。

1.2.4Western blot檢測TRAIL、FADD、caspase-8的表達水平 外周血單個核細胞總蛋白的提?。篜BMC細胞,用1×PBS 洗2次后，加入400 μl含蛋白酶抑制劑 cooktail的RIPA 強裂解液，冰上充分裂解15 min；將裂解液移入1.5 ml離心管，用超聲細胞裂解器在冰上裂解；將液體移入1.5 ml離心管，4℃ 12 000 r/min離心15 min；取上清移入另一新的離心管；BCA法進行蛋白定量；蛋白樣品加入1/4體積上樣緩沖液，沸水煮 5 min，蛋白電泳。

Western blot流程：取蛋白樣品各30 μg，用10% SDS-PAGE凝膠將提取的總蛋白分離，120 V條件下電泳約 90 min；將膠上的蛋白條帶利用濕式轉膜法電轉移至NC膜上，恒壓100 V，冰浴中轉120 min；取出NC膜，麗春紅染色，觀察轉移效果后用 5%脫脂牛奶室溫封閉1 h，TBST洗膜5 min；一抗稀釋液稀釋1∶1 000，含適當稀釋一抗的塑料袋中封膜，4℃搖床孵育冰箱過夜，TBST洗膜 5 min，3 次；TBST稀釋二抗1∶5 000，含適當稀釋二抗的塑料袋中封膜，室溫搖床孵育 1 h，TBST洗膜 5 min，3 次；將膠片進行掃描，用南京馳順科技發(fā)展有限公司的GIS300凝膠成像分析系統(tǒng)分析目標帶的分子量和光密度相對比值。

2 結果

2.1各組RA患者PBMC TRAIL、c-FLIP、caspase-8 mRNA表達情況(見表3、圖1) RA患者PBMC中中M組TRAIL mRNA為3.26±0.78，明顯高于N組1.30±0.20 (P=0.028)，L組和H組 (1.56±0.37、1.83±0.26) 略高于N組(P=0.048、0.043)；L、M、H組中c-FLIP的mRNA相對表達量分別為1.27±0.28、1.32±0.34、1.93±0.40，均高于N組(1.08±0.12)，P分別為0.035、0.034、0.030，均小于0.05，有顯著性差異；L、M、H組中caspase-8的mRNA分別為2.77±0.97、4.52±0.85、2.13±0.44，均高于N組1.04±0.13，P分別為0.023、0.012、0.032，均小于0.05，差異有顯著統(tǒng)計學意義。M組水平較L、H組高(P=0.037、0.029)。

表1Real-timeqPCR反應引物(引物序列5′→3′)

Tab.1Real-timefluorescencequantitativePCRprimer(Primersequence5′→3′)

GeneForwardprimerReverseprimerTRAILCCCAATGACGAAGAGAGTATGAACTGTAGAAATGGTTTCCTCAGAGGTc?FLIPTTTACCACCCAGAGACACGCAGAACCTCTGCCTGCTGAACCaspase?8TGATGAAGAGGCTCTGAGTAATGGCAAAGTGACTGGATATAGAPDHAATGAAGGGGTCATTGATGGAAGGTGAAGGTCGGAGTCAA

表2實時熒光定量PCR反應體系

Tab.2Real-timefluorescencequantitativePCRreactionsystem

ComponentsVolume(μl)2×TransStarTMTopGreenqPCRSuperMix100Forwardprimer(10μmol/L)04Reverseprimer(10μmol/L)04cDNAtemplate20ddH2OUpto20

表3RA患者PBMCTRAIL、c-FLIP、caspase-8的mRNA表達情況

Tab.3mRNAexpressionofPBMCTRAIL,C-FLIPandcaspase-8inRApatients

GroupsTRAILmRNAc?FLIPmRNACaspase?8mRNAN130±020108±012104±013L156±0371)2)127±0281)277±0971)2)M326±0781)132±0341)452±0851)H183±0261)2)193±0401)2)213±0441)2)

Note：Compare with group N,1)P<0.05;compare with group M,2)P<0.05.

圖1 TRAIL、c-FLIP、caspase-8 mRNA相對表達情況Fig.1 Relative expression level of TRAIL,c-FLIP and caspase-8 mRNA

圖2 TRAIL、c-FLIP、caspase-8蛋白表達情況Fig.2 Protein expression of TRAIL,c-FLIP and caspase-8

圖3 TRAIL、c-FLIP、caspase-8蛋白相對表達量Fig.3 Relative expression of TRAIL,c-FLIP and caspase-8 protein

2.2RA患者PBMC TRAIL、c-FLIP、caspase-8蛋白表達變化(見圖2、3) RA患者PBMC中TRAIL蛋白M組明顯高于N組(P=0.013 ),H組稍高于N組(P=0.043),L組與N組差異無明顯統(tǒng)計學意義(P=0.058),M組明顯高于L、H組(P=0.011,0.021)；c-FLIP蛋白M組表達顯著高于N組(P=0.001), L、 H組與N組比較， 差異無統(tǒng)計學意義(P=0.062,0.053)；caspase-8蛋白表達 M、H組明顯高于N組(P=0.003,0.001)；L組與N組比較，差異無統(tǒng)計學意義(P=0.072)。

3 討論

RA是關節(jié)滑膜慢性炎癥為主的自身免疫性疾病，致殘率高[9]。RA發(fā)生發(fā)展是一個多因素參與的復雜過程，RA發(fā)病機制的研究一直處在不斷發(fā)展中。RA關節(jié)軟骨和骨組織的損害，與滑膜細胞的過度增生活化與凋亡不足有關，凋亡機制在RA發(fā)病中占重要地位[10]。對于RA患者細胞的相關研究,NaKajima和Firestein 首先報道了RA滑膜細胞表達fas抗原,且fas抗體可誘導滑膜細胞凋亡[11]。也有研究表明，TRAIL及其受體在T細胞的表達分布可能是RA發(fā)病機制的重要啟示[12]。

TRAIL共有5種受體，包括死亡受體4(DR4 )、死亡受體5(DR5) 、誘騙受體1(DcRI) 、誘騙受體2(DcR1) 和可溶性受體骨保護素。其中DR4、DR5屬于死亡受體，因這兩種受體均含有胞內死亡結構域和依賴caspase系統(tǒng)的凋亡命令的識別結構域，TRAIL與DR4或DR5受體結合后將TRAIL的死亡信息傳遞至細胞內，通過進一步激活caspase系統(tǒng)，從而導致細胞凋亡。本研究RA外周血單個核細胞TRAIL mRNA中L、M、H三個活動組均顯著高于N組，且M組又顯著高于 L、H組。TRAIL蛋白表達中M、H組均明顯高于N組，L組與N組差異無統(tǒng)計學意義；M組明顯高于L、H組，差異有統(tǒng)計學意義。在不同RA組別中TRAIL mRNA及蛋白表達總體趨勢增高，而M組呈明顯高表達，這可能與RA不同活動期不同程度的凋亡抑制的代償體現(xiàn)有關。

細胞型Fas 相關死亡域樣IL-1β轉換酶抑制蛋白(c-FLIP)是外部凋亡通路中的一個重要負調控因子。c-FLIP蛋白在結構與序列上與caspase-8 有很多相似之處,其N-端含有與caspase-8 相似的兩個相互串聯(lián)的DED 。研究認為c-FLIP通過其caspase 同源結構域與caspase-8 相互靠近形成異二聚體c-FLIP(L)/caspase-8，使得c-FLIP 競爭性結合FADD，抑制DISC的形成，阻礙TRAIL誘導細胞凋亡[13]。本研究外周血單個核細胞中c-FLIP mRNA L、M、H組分別高于N組(P=0.035，0.034，0.030)。c-FLIP基因mRNA水平在RA患者不同活動程度的外周血單個核細胞中呈遞進性升高，且與疾病的進程呈正相關。這表明c-FLIP這一凋亡抑制要素在RA患者中的存在，其mRNA水平與RA患者不同活動程度的相關性可在外周血單個核細胞中體現(xiàn)，方便為RA病情評估提供參考。c-FLIP蛋白與c-FLIPmRNA表達不那么同步，M組c-FLIP蛋白表達明顯高于其他組別。L、H組與正常對照表達差異不大(P=0.062，0.053)。原因有待進一步探討，這可能是c-FLIP存在轉錄環(huán)節(jié)的調節(jié)，或是c-FLIP在滑膜細胞與外周血細胞的轉錄差異，或是本實驗中對RA患者收集的病例數(shù)量有限造成的誤差所致。本研究caspase-8 mRNA中，L、M、H組也均高于N組(P=0.023，0.012，0.032)。caspase-8蛋白表達中，L組與N組比較，無顯著性差異(P=0.072)；M、H組明顯高于N組(P=0.003,0.001)。caspase-8總體水平增高，有可能由于c-FLIP通過其caspase 同源結構域與caspase-8 相互靠近形成異二聚體c-FLIP(L)/caspase-8，使得增高的caspase-8不能結合到DISC上,從而不能有效活化，引起下級caspase 酶系的級聯(lián)反應。

TRAIL具有強大的誘導腫瘤細胞凋亡的能力，但對正常細胞基本沒有影響。體內、體外實驗表明，TRAIL可選擇性地誘導肺癌細胞、胃癌細胞等多種腫瘤細胞及轉化細胞的凋亡；對荷瘤動物應用外源性的TRAIL，結果顯示腫瘤生長速度顯著降低，對荷瘤動物本身無明顯的副作用[14]。RA的特征之一就是滑膜組織表現(xiàn)為增生性侵蝕性生長,其生長性質和病理學行為在許多方面類似于腫瘤組織的特性,對軟骨組織造成進行性破壞。因此延緩甚至抑制滑膜細胞異常增殖與誘導其凋亡將成為治療RA的主要策略之一,具有十分重要的意義[15]。近幾年，有關TRAIL或TRAIL相關制劑應用于RA的治療已有一些研究。陳金[16]研究發(fā)現(xiàn)重組人腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體(hTRAIL)可體外誘導RASFs凋亡。周劍鎖等[17]研究發(fā)現(xiàn)EPB可以上調死亡受體DR4、DR5,增強FLS對TRAIL和AD5-10的敏感性,從而為RA治療提供了新的策略。

臧鳳琳等[5]認為c-FLIP很可能是TRAIL治療腫瘤的選擇性標志物，即對TRAIL 耐藥的腫瘤細胞首先要檢測c-FLIP 表達水平。如果c-FLIP 高表達，可以應用特異性降低c-FLIP聯(lián)合TRAIL的方法；如果c-FLIP低表達，說明TRAIL對該腫瘤治療無效，需要改換其他治療手段。本研究RA患者外周血單個核細胞中，腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體TRAIL、c-FLIP、caspase-8等基因表達水平總體趨勢增加，有望為TRAIL或TRAIL相關制劑應用于RA治療或其他RA臨床診治的后續(xù)研究提供實驗參考。

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