戴 佩 鄧湘贏 余敏君 李玲玲 羅 丹 龍 嫻 曾焱華

(南華大學(xué)病原生物學(xué)研究所，特殊病原體防控湖南省重點實驗室，湖南省分子靶標(biāo)新藥研究協(xié)同創(chuàng)新中心，衡陽 421001)

生殖支原體(Mycoplasma genitalium,Mg)是一種能在無生命培養(yǎng)基中生長的最小原核細(xì)胞型微生物，與很多泌尿生殖道感染性疾病有關(guān)，如男性和女性不良生殖后遺癥、子宮內(nèi)膜炎、盆腔炎癥性疾病、宮頸炎和非淋菌性尿道炎[1]。研究表明生殖支原體可能是人類免疫缺陷病毒(Human immunodefici-ency virus,HIV)的協(xié)同因子，能促進(jìn)HIV的感染和復(fù)制[2,3]。此外，生殖支原體可與人類精子結(jié)合，并隨活動的精子引起擴(kuò)散性感染，是引起女性生殖系統(tǒng)疾病和不孕不育的一個重要因素[4]。

生殖支原體黏附蛋白(MgPa)是暴露在Mg膜表面的主要黏附蛋白，具有較強(qiáng)的抗原性和免疫原性，與Mg感染或侵入宿主細(xì)胞并進(jìn)一步引起宿主細(xì)胞受損和死亡有著緊密的聯(lián)系[5]。Mg感染或侵入宿主細(xì)胞的過程，其本質(zhì)是Mg與宿主細(xì)胞發(fā)生相互作用的過程，鑒于目前國內(nèi)外尚未見篩選與鑒定MgPa互作蛋白的報道，本課題組在前期研究中表達(dá)并純化了重組MgPa(rMgPa)，制備了純化的抗rMgPa的抗體[6]，且構(gòu)建了人尿道上皮細(xì)胞T7噬菌體展示cDNA文庫[7]，本研究擬以rMgPa為靶分子，從人尿道上皮細(xì)胞(SV-HUC-1)T7噬菌體展示cDNA文庫中篩選MgPa的互作蛋白，為進(jìn)一步了解MgPa的功能、生殖支原體的致病機(jī)制及其防治提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1實驗材料、試劑 rMgPa的表達(dá)與純化參照本課題組前期研究[5]；抗rMgPa抗體由本課題組前期制備并保存；SV-HUC-1細(xì)胞T7 噬菌體展示cDNA文庫由本課題組前期構(gòu)建[7]；BLT5403菌株由南華大學(xué)病原生物學(xué)研究所保存；T7篩選前引物和T7篩選后引物均購自美國No-vagen公司；HRP標(biāo)記的T7-tag抗體購自中國博奧森公司；RPL35(ab121244)抗體購自Abcam公司；SV-HUC-1細(xì)胞購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫。

1.2方法

1.2.1SV-HUC-1細(xì)胞T7噬菌體展示cDNA文庫的親和篩選 以100 μg/ml的rMgPa蛋白包被96孔板，同時設(shè)立復(fù)孔和空白對照孔， 4℃濕盒過夜。經(jīng)封阻液(BSA)于4℃封閉2 h。棄除封阻液，PBST洗6～8次。加入200 μl擴(kuò)增后的噬菌體文庫，滴度為3×108pfu[8]，室溫平搖2 h。傾倒未結(jié)合的噬菌體，甩干后用PBST洗6～8次，加150 μl的高鹽洗脫液[9]，室溫平搖30 min，收集裂解液于4℃保存?zhèn)溆?。?00 μl第1輪篩選后的噬菌體洗脫液加入預(yù)先包被rMgPa的微孔板，于37℃孵育2 h，棄孔內(nèi)液，1×PBST(0.3% Tween-20)洗板6～8次，加入100 μl BLT5403菌液，37℃孵育2 h，按上述方法得到第2輪噬菌體洗脫液。按第2輪篩選方法再篩選2輪，取200 μl第2輪篩選后的洗脫液與空板孵育2 h，同時用含0.5% Tween-20的PBST洗板以排除與ELISA板結(jié)合的非特異噬菌體。第4輪篩選時將rMgPa的濃度降低為50 μg/ml以增強(qiáng)篩選的特異性。進(jìn)行4輪篩選之后，即得到與rMgPa高親和的噬菌體。

1.2.2噬菌斑的PCR擴(kuò)增 挑選陽性噬菌斑進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR引物為T7 篩選前引物:5′-GGAGCTGTCGTATTCCAGTC-3′和T7 篩選后引物:5′-AACCCCTCAAGACCCGTTTA-3′。PCR擴(kuò)增條件如下： 94℃ 10 min，94℃ 50 s，50℃ 1 min，72℃ 1 min，30個循環(huán)，72℃延伸10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳分析后送上海生工生物有限公司進(jìn)行DNA測序，并將其DNA序列進(jìn)行BLAST分析。

1.2.3ELISA檢測rMgPa與陽性噬菌體的特異結(jié)合 用100 μl rMgPa(100 μg/ml)包被ELISA板，同時設(shè)立復(fù)孔和陰性對照孔(WT型噬菌體)，4℃濕盒過夜。棄掉包被液，加滿封阻液(5%脫脂奶粉)于4℃封阻2 h，用PBST洗8次后拍干，加150 μl陽性噬菌體，37℃孵育2 h后用 PBST洗8次，加抗T7抗體(1∶1 000)于37℃孵育2 h，PBST洗8次后加入HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG抗體(1∶4 000)，37℃孵育1 h 后用PBST洗8次，加A、B顯色液，37℃避光孵育15 min后立即加入終止液，用酶標(biāo)儀在450 nm處測吸光度值(A450)。

1.2.4斑點免疫印跡法驗證rMgPa與陽性噬菌體的特異結(jié)合 用甲醇浸泡PVDF膜至透明后用TBST(0.5% Tween20)清洗，取1 μl噬菌體(107pfu)滴加在PVDF膜上，同時設(shè)立BSA對照、空白對照和陽性對照(rMgPa)，待室溫干燥后4℃封閉過夜。用TBST洗膜3次后，加入1 ml rMgPa(1∶100)于37℃孵育2 h，用TBST洗膜6次后再加入抗rMgPa的抗體(1∶1 000)，37℃孵育2 h后洗膜6次，加入HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG抗體(1∶4 000)于37℃浸膜1 h，用TBST洗膜6次，ECL 法發(fā)光、顯影。

1.2.5SV-HUC-1的培養(yǎng)與細(xì)胞總蛋白的提取 用含10% 胎牛血清和1%雙抗(抗青霉素和鏈霉素)的F-12K培養(yǎng)基，在37℃、5% CO2的條件下培養(yǎng)SV-HUC-1，待細(xì)胞密度達(dá)90%時用PBS洗滌細(xì)胞3次，經(jīng)胰酶消化后收集約5×107個細(xì)胞。1 000 r/min離心6 min，棄掉培養(yǎng)基。加1 ml經(jīng)冰浴的PBS以重懸沉淀，4℃ 1 000 r/min離心5 min，重復(fù)3次。棄上清后加細(xì)胞裂解液500 μl以溶解細(xì)胞，冰浴25 min后超聲處理5 min，加100 μl PBS重懸，即為細(xì)胞總蛋白，保存在-20℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.6Far-western blot驗證rMgPa與RPL35的特異結(jié)合 將rMgPa經(jīng)12%SDS-PAGE膠分離。蛋白條帶經(jīng)半干轉(zhuǎn)印系統(tǒng)轉(zhuǎn)印到PV-DF膜上。用5%脫脂牛奶封閉過夜，TBST洗膜5次，加入提取的SV-HUC-1細(xì)胞總蛋白于4℃孵育6～10 h[10]，TBST(0.5%Tween20)洗膜5次，加RPL35抗體(1∶200)，4℃孵育過夜，TBST洗膜5次，加HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG抗體(1∶2 000)于37℃孵育1 h，TBST洗膜后ECL 法發(fā)光、顯影。

2 結(jié)果

2.1與rMgPa特異結(jié)合的噬菌體得到明顯富集 為篩選到與rMgPa相互作用的噬菌體，本實驗以rMgPa為靶分子，通過“結(jié)合-洗脫-擴(kuò)增”步驟對 SV-HUC-1的T7噬菌體展示cDNA文庫進(jìn)行了4輪親和篩選，每次噬菌體的投入量保持一致(3×108pfu)，如表1所示：第1輪淘選后的產(chǎn)率為0.67×10-4，而第4輪淘選時其產(chǎn)率達(dá)到了1.7×10-3，表明與rMgPa特異結(jié)合的噬菌體明顯得到了富集。

2.2成功擴(kuò)增了噬菌體的外源基因 為擴(kuò)增噬菌體含有的外源基因，對從第4輪篩選的平板上隨機(jī)挑取的32個噬菌斑進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物采用1.5%瓊脂糖凝膠電泳分析，結(jié)果顯示成功提取到32個噬菌體的外源DNA，其片段大小介于250～750 bp之間，且500 bp左右的克隆最多(圖1)。

2.3序列比對與同源性分析 為分析噬菌體含有的外源基因序列，將圖2中PCR擴(kuò)增的噬菌斑陽性產(chǎn)物送上海生工生物工程有限公司進(jìn)行DNA測序。將測序后的序列在NCBI基因數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行BLAST比對，結(jié)果表明32個噬菌體的外源序列中，共包括7種不同的序列，分別用P1～P7表示，其中RPL35蛋白出現(xiàn)的頻率最高，達(dá)到了62.5%，結(jié)果如表2所示。

表14輪親和篩選投入量和產(chǎn)出量的比率

Tab.1Ratioofoutputandinputoffourroundsbyaffinityscreening

Rounds1234Input(pfu)3×1083×1083×1083×108Output(pfu)2×10442×10419×1055×105Ratio067×10-414×10-463×10-417×10-3

2.4ELISA檢測陽性噬菌體與rMgPa的特異結(jié)合 將上述7種代表性噬菌體包被在96板中， 采用間接ELISA法檢測代表性噬菌體與rMgPa的特異結(jié)合，如圖2所示：rMgPa組的A450值明顯高于 BSA組，且P1、P2和P3與MgPa結(jié)合力較強(qiáng)。

2.5斑點免疫印跡檢測陽性噬菌體與rMgPa的特異結(jié)合 采用斑點免疫印跡法進(jìn)一步檢測7個代表性噬菌體能否與rMgPa特異結(jié)合，結(jié)果如圖3所示：P1、P2和P3代表性噬菌體出現(xiàn)了明顯的斑點，說明P1(RPL-35)、P2(Mitochondrio complete genome)和P3(RPN4)能與rMgPa特異結(jié)合，這些結(jié)果與上述ELISA的結(jié)果一致。

2.6RPL35能與rMgPa特異結(jié)合 采用Far-western blot方法進(jìn)一步檢測SV-HUC-1細(xì)胞總蛋白中RPL35與 rMgPa的特異結(jié)合情況，rMgPa蛋白用SDS-PAGE分離并轉(zhuǎn)至PVDF膜上，用提取的SV-HUC-1細(xì)胞總蛋白孵育后，用相應(yīng)抗體檢測，結(jié)果顯示在約37 kD處有明顯條帶，說明RPL35能與rMgPa特異結(jié)合(圖4)。

圖1 部分噬菌斑PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳分析Fig.1 Agarose gel electrophoresis analysis of PCR products of partial phagesNote:M.DNA marker；Lane 1-24.Number of different phage plaques.

表2噬菌斑PCR產(chǎn)物同源性分析結(jié)果

Tab.2ResultsofhomologyanalysisofPCRproductsofphageplaque

NumberForeigngeneSequenceID(range)HomologyNumberofreplicationP1RPL35NM＿0072093，(21-475)99%20P2MitochondriocompletegenomeNC＿0129201，(1312-1600)99%3P3RTN4XM＿0170045191，(1019-1347)98%3P4COX6AINM＿0043733，(35-556)100%2P5RPL21NM＿0009823，(55-394)99%2P6RPS23NM＿0010254，(78-574)99%1P7RPS26NM＿0010293，(240-699)99%1Total32

Note：Homological analysis results to the inserted sequences of thirty-two phages,and the seven proteins edcoded by these genes were numbered as P1 to P7 as shown in table.

圖2 ELISA檢測代表性噬菌體與rMgPa的特異結(jié)合Fig.2 Specific combination between representative phages and rMgPa was detected by ELISANote:P1-P7.Number of representative phages；WT.Wild type phage.BSA was used as blank control.Compared with the BSA group,**.P<0.01;compared with the BSA group，*.P<0.05.

圖3 斑點免疫印跡檢測代表性噬菌體與rMgPa的特異結(jié)合Fig.3 Specific combination between representative phages and rMgPa was detected by Dot immunobind-ing assayNote:A1.P1;A2.P2;A3.P3;A4.P4;B1.WT;B2.BSA;B3，B4.Blank control;C1.rMgPa positive control；C2.P5;C3.P6；C4.P7.

圖4 Far-western blot檢測RPL35和rMgPa的相互作用Fig.4 Interaction between RPL35 and rMgPa was detected by Far-western blotNote:A.The membrane was incubated with cell total protein and B not.Lane 1.rMgPa;2.No rMgPa(blank control).

3 討論

Ueno等[11]發(fā)現(xiàn) Mg能侵入宮頸癌上皮細(xì)胞(HeLa細(xì)胞)和非癌性子宮內(nèi)膜細(xì)胞(EM42細(xì)胞)，但對其侵入宿主細(xì)胞后具體的致病機(jī)制研究甚少。MgPa是Mg黏附或侵入宿主細(xì)胞從而發(fā)揮其對宿主細(xì)胞致病的關(guān)鍵，本研究以前期表達(dá)純化的rMgPa為靶分子，從SV-HUE-1 T7噬菌體展示cDNA文庫中篩選到能與MgPa相互作用的蛋白，通過DNA序列測定和同源性分析，結(jié)果表明成功篩選到7種能與rMgPa特異結(jié)合的代表性噬菌體，通過ELISA和斑點免疫等實驗表明這些代表性噬菌體能與rMgPa特異結(jié)合；Far-western blot實驗進(jìn)一步證實來自SV-HUC-1細(xì)胞總蛋白中的60S核糖體蛋白L35(RPL35)能與rMgPa相互作用，說明RPL35可能是rMgPa的互作蛋白。

噬菌體展示技術(shù)是當(dāng)前用于研究蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用的一種快速、簡便且高效的手段。相比于M13等其他噬菌體，T7噬菌體在各種極端環(huán)境(高溫、低pH值)中穩(wěn)定性較高，且能識別靶細(xì)胞的天然構(gòu)象[12]?，F(xiàn)今，噬菌體展示技術(shù)應(yīng)用比較廣泛，有學(xué)者利用噬菌體7肽庫通過差減篩選得到多肽NPMIRRQ，結(jié)果證實其能與卵巢癌細(xì)胞株HO-8910細(xì)胞表面特異結(jié)合，為早期診斷和監(jiān)測卵巢癌的轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)提供了實驗基礎(chǔ)[13]。此外，T7噬菌體展示技術(shù)還可應(yīng)用于模擬表位的篩選，已有研究篩選到了MUC1的兩個模擬表位：AAPDFRP和SAPDDRP，并成功用于肺癌的早期診斷[14]。羅俊茜等[15]利用噬菌體展示技術(shù)篩選到能應(yīng)用于膀胱癌早期診斷的小分子多肽NYZL1。潘超等[16]從噬菌體隨機(jī)十二肽庫中篩選到與三水白虎湯作用的類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎滑膜成纖維細(xì)胞短肽SGVYKVAYD WQH。本課題組前期利用噬菌體展示技術(shù)篩選到能與MgPa特異結(jié)合的3條多肽，且這3條多肽能抑制Mg對SV-HUC-1的黏附[17]，這些為研究MgPa蛋白與宿主細(xì)胞結(jié)合的特異作用位點提供了實驗依據(jù)。

核糖體是蛋白質(zhì)合成的主要場所，而核糖體蛋白是組成核糖體的主要成分，在細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的生物合成中發(fā)揮重要作用。60S核糖體蛋白L35(RPL35)是核糖體亞基的一個重要組成部分，在蛋白翻譯和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)對接中發(fā)揮著重要的作用[18]。除此之外，核糖體具有參與DNA修復(fù)、細(xì)胞生長周期的調(diào)控和細(xì)胞分化等核糖體外功能，研究表明核糖體蛋白對線粒體蛋白的翻譯也有一定的調(diào)控作用[19]。Amsterdam等[20]研究表明在胃癌、結(jié)直腸癌、肝癌和食管癌等腫瘤組織中會出現(xiàn)核糖體蛋白基因異常表達(dá)，這暗示著核糖體蛋白與腫瘤的發(fā)生息息相關(guān)。

本研究的結(jié)果說明細(xì)胞內(nèi)的RPL35可能是MgPa的互作蛋白，因此，推測Mg經(jīng)黏附并侵入尿道上皮細(xì)胞后，經(jīng)MgPa和RPL35結(jié)合從而阻止上皮細(xì)胞蛋白質(zhì)的翻譯而導(dǎo)致細(xì)胞死亡，從而發(fā)揮其對宿主上皮細(xì)胞的致病性。下一步本課題組將研究MgPa與RPL35互作后對細(xì)胞功能的影響，從而加深對MgPa的功能理解，為進(jìn)一步了解Mg的致病機(jī)制及其防治提供實驗依據(jù)。

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