徐佩琳，羅水忠，潘麗華，鄭 志

抗性糊精屬于膳食纖維范疇，具有降低血糖、調(diào)節(jié)血脂和促進腸道益生菌生長繁殖等生理功能，以及良好的溶解性、熱穩(wěn)定性等食品加工性能[1]，受到國內(nèi)外的廣泛關注。目前，制備抗性糊精多采用酸熱法[2-3]，該方法是一種隨機轉化機制，沒有辦法精確控制產(chǎn)品組分的分布，而且經(jīng)過高溫加熱，經(jīng)常會伴隨著一些不利于工業(yè)生產(chǎn)的副反應。與酸熱法相比，酶法工藝具有條件溫和、副反應少、不需要酸堿中和等優(yōu)點。酶法更易于產(chǎn)生相對分子質(zhì)量較低的抗性糊精產(chǎn)品。在酶法制備的基礎上，通過微波預處理淀粉能夠更好地制備抗性糊精，是由于微波能夠很大程度地影響酶切位點，提高淀粉對酶的敏感性，使淀粉自身的性質(zhì)產(chǎn)生了巨大的改變[4]，微波處理后淀粉將會出現(xiàn)爆裂孔，這些爆裂孔為酶從外部進入淀粉內(nèi)部提供了有效的通道，提高了酶解速率，得到更均勻、抗性含量更高、抗消化性能更好的抗性糊精[5-6]。

淀粉是制備抗性糊精的良好原料，以玉米淀粉[2]、馬鈴薯淀粉[7]、木薯淀粉[8]、大米淀粉[9]和糯米淀粉為原料制備抗性糊精已有報道，然而，尚未有以山藥淀粉為原料制備抗性糊精的研究成果。

山藥為薯蕷科（Discoreaceae） 植物薯蕷的干燥根莖，被認為是一種能改善胃脾功能的高級中草藥，山藥的主要活性成分是黏蛋白、薯蕷皂苷、膽堿、植物甾醇、必需氨基酸、低聚糖和尿囊素等[10]，近年來，從山藥中分離活性成分的研究十分活躍，而提取后所剩余的殘渣（主要成分為淀粉） 的利用卻并未得到足夠的重視[2]，并且由于山藥易腐爛、易褐變、不耐儲存、不便運輸?shù)忍匦?，如何更好地發(fā)揮山藥的綜合價值一直以來是學者研究的難點[11]。事實上，充分利用山藥淀粉制備抗性糊精等活性功能產(chǎn)品，不僅能豐富淀粉種類，而且能拓寬山藥的利用范圍，提高其附加值；不但豐富山藥的產(chǎn)品種類，而且擴大了其經(jīng)濟價值，對提升山藥產(chǎn)品質(zhì)量、提高山藥加工新途徑、擴大原材料的資源利用率、延長山藥的貯藏期、提高產(chǎn)品的附加值等都有很好的幫助[12]。

通過微波輔助酶解的方法來制備山藥抗性糊精，并且通過高效液相色譜（HPLC）、差示掃描量熱儀（DSC）和體外消化率來對其進行理化性質(zhì)研究，為山藥的綜合利用提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

山藥，安徽省眾德食品有限公司提供；堿性蛋白酶（CAS：9014-01-1 200 000 U/g），北京索萊寶科技有限公司提供；耐高溫α-淀粉酶（CAS：9000-85-5 40 000 U/g），江蘇銳陽生物科技有限公司提供；耐高溫β-淀粉酶（CAS：9000-91-3 700 000 U/g），江蘇銳陽生物科技有限公司提供；轉苷酶（CAS：9001-42-7 300 000 U/g），Sigma公司提供。

FK-A型組織搗碎機，江蘇金壇市金城國盛實驗儀器廠產(chǎn)品；FD-1A-50型冷凍干燥機，北京博醫(yī)康實驗儀器有限公司產(chǎn)品；Q200型差示掃描量熱儀，美國TA公司產(chǎn)品；NJL07-3型微波實驗爐，南京杰全微波設備有限公司產(chǎn)品。

1.2 山藥淀粉的提取

參照Falade K O等人[13]的方法，并略作改動。新鮮山藥清洗、去皮、切片（2 cm×2 cm×2 cm），于90℃條件下水浴熱燙3 min，取200 g打漿后置于5 L燒杯中，漿液過膠體磨3次后，用濃度1.5 mol/L的NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值至9.5～10.0，置于41℃恒溫水浴鍋中，并用數(shù)顯攪拌器不斷攪拌，加入一定量的堿性蛋白酶提取一定時間后，使用160目濾布過濾3次，收集濾液。以3 500 r/min轉速離心10 min，棄去上清液，洗滌過程重復3次。將沉淀物真空冷凍干燥24 h，碾磨過篩即得白色山藥淀粉。山藥淀粉得率為29.5±3.9 g/100 g。

1.3 山藥抗性糊精的制備

配置20%（W/V）的山藥淀粉溶液，加入原料質(zhì)量0.5%的CaCl2，磁力攪拌20 min，以不同微波功率（0～80 W） 進行微波處理0～10 min，取出后以濃度0.1 mol/L的鹽酸調(diào)節(jié)pH值至5.5，分別加入耐高溫α-淀粉酶40 U/g，耐高溫β-淀粉酶用量0～40 U/g，葡萄糖轉苷酶用量20～40 U/g攪拌均勻，密封后放入恒溫水浴鍋中反應10～30 min，反應結束后加鹽酸調(diào)節(jié)pH值至2.0，放入水浴鍋滅酶3 min后取出，迅速將其用冰水浴冷卻至室溫，冷凍干燥，即得抗性糊精粗品。

（1）山藥抗性糊精含量的測定。參考Kapusniak J等人[2]的方法，稍作修改。將樣品1.000 0 g分散于20 mL的Mes-Tris緩沖溶液中，然后加入熱穩(wěn)定性的α-淀粉酶溶液（500 U），蛋白酶（30 U） 和糖苷酶；消化后，加入4倍體積的乙醇（體積分數(shù)95%，預熱至60℃）；在具有干燥硅藻土床作為助濾劑的焦油燒結玻璃坩堝中過濾沉淀；用乙醇和丙酮洗滌固體殘余物，將殘留的坩堝在110℃的烘箱中干燥過夜，在干燥器中冷卻至室溫，稱質(zhì)量。干燥殘余物與干燥樣品的初始質(zhì)量的比例為抗性糊精含量。

（2） 葡萄糖當量（DE值） 的測定。準確稱取樣品1.000 0 g置于燒杯中，用去離子水稀釋至50 mL，然后放入水浴鍋中進行糊化處理，冷卻稀釋至1000mL，進行葡萄糖含量的測定。

1.4 物化性質(zhì)的測定

（1） 溶解度的測定。參考Kapusniak J等人[2]的方法，略有改動。在室溫下稱取1 g（精確到0.000 1）樣品于100 mL的錐形瓶中，用蒸餾水稀釋至50 mL，磁力攪拌使其充分溶解，將懸浮液以轉速5 000 r/min離心30 min，在60℃烘箱中干燥過夜，然后在105℃烘箱中烘干至恒質(zhì)量，稱量上清液中干物質(zhì)的質(zhì)量。

（2）熱力學性質(zhì)測定。山藥淀粉和山藥抗性糊精的熱力學性質(zhì)用DSC測定，參照Ashri A等人[15]的方法，略有改動。準確稱取一定量的抗性糊精樣品（按干基計）于液體坩堝中，按1∶2的比例加入去離子水，加蓋壓緊、密封，在4℃條件下平衡24 h。平衡后的樣品在DSC中糊化，儀器通N2，速率50 mL/min，以10℃/min的速率升溫，溫度從20℃升到150℃，通過圖譜計算樣品起始溫度（To），峰值溫度（Tp），結束溫度（Tc） 和糊化焓（ΔH）。

（3） 相對分子質(zhì)量的測定。高效液相色譜法（HPLC） 是測量多糖相對分子量常用的方法之一。試驗根據(jù)Pan L H等人[16]描述的測定分子量的方法，進行簡單修改。所用色譜裝置為：色譜柱為TSK G5000PWxl（7.8 mm×300 mm） 和 TSK G54000PWxl（7.8 mm×300 mm）串聯(lián)，以超純水為流動相進行色譜分析；檢測器為示差折光檢測器，柱溫30℃，流速0.5 mL/min，進樣量20 μL；采用一系列葡聚糖T標準品校準分子量測定的校準曲線，包括T-1000，T-500，T-100，T-50和T-20；平均分子量由Breeze軟件版本3.3（Waters Co.Ltd.）計算。

1.5 體外模擬人工胃液與人工腸液

根據(jù)2015年“中國藥典”制備人造胃液（AGJ）和人造腸液（AIF）。按照Shi M M等人[17]所述人工模擬胃腸消化，并稍作修改。消化過程中，取0.5 g抗性糊精于5 mL人造胃液/腸液。配置好消化液，分別對應于人造胃液條件下消化30，60，120，240 min；人造腸液消化0，30，90，180，360 min時取出等分試樣（0.5 mL），并最終用苯酚-硫酸法進行總碳水化合物測定。制作葡萄糖含量與吸光度的標準曲線。

平均消化率根據(jù)下式計算：

總碳水化合物消化產(chǎn)物（CHO）=C×D×（425-S） ×0.001

式中：CHO——總碳水化合物消化產(chǎn)物，mg；

C——碳水化合物在0.5 mL稀釋透析液中參照標準曲線；

D——稀釋倍數(shù)；

425——整個系統(tǒng)的體積，mL；

S——從400 mL稀釋透析液0.5 mL，mL；

0.001——毫克級的轉換；

W——樣品質(zhì)量，mg。

1.6 數(shù)據(jù)分析

上述所有試驗至少進行3次。結果表示為平均值±標準偏差 （SD）。使用 SPSS 19軟件 （IBM Corporation，Armonk，NY，USA），方差分析 （ANOVA）和Duncan's檢驗以95%顯著性水平進行統(tǒng)計分析。用Origin 8.6繪制相關圖表。

2 結果與分析

2.1 微波預處理-酶解制備山藥抗性糊精的工藝研究

微波預處理制備條件對山藥抗性糊精含量和DE值的影響見圖1。

由圖1可知，山藥抗性糊精含量隨著微波功率和微波時間的增加呈現(xiàn)先逐漸增大后減小的趨勢，微波功率60 W，微波時間6 min時達到抗性糊精含量的最大值，為40.33%。當繼續(xù)增加微波功率和時間，淀粉易形成凝膠，從而不利于形成山藥抗性糊精。微波預處理的過程使得直鏈淀粉更易發(fā)生降解，聚合度降低，產(chǎn)品分支度增高，且淀粉經(jīng)過微波作用，影響其酶切位點，有利于小分子的重新聚合，生成更多不被酶消化的抗性糊精。DE值表示淀粉水解程度，隨著微波功率和微波時間的增加，酶解程度不斷增加，DE值也不斷增加[7]。

圖1 微波預處理制備條件對抗性糊精含量和DE值的影響

酶解制備條件對抗性糊精含量和DE值的影響見圖2。

由圖2（a） 可知，抗性糊精含量隨著酶解溫度的升高和加熱時間的增加而呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢，酶解溫度75℃，加熱時間20 min時達到最大值，抗性糊精含量為30.59%。當酶解溫度繼續(xù)升高、酶解時間延長，抗性糊精含量開始急劇降低，這可能是加快了α-淀粉酶內(nèi)切淀粉α-1,4糖苷鍵的速率，形成快速降解，不利于形成抗性糊精。

由圖2（c） 可知，抗性糊精含量隨著β-淀粉酶用量增加而呈現(xiàn)先增加后減小的趨勢，在酶用量達到20 U/g時，達到最大值，而后因為β-淀粉酶用量過大，導致其切開α-1,4糖苷鍵的速度過快，不易形成抗性糊精。β-淀粉酶是一種外切酶，遇1,6鍵或取代集團就酶解停止，保留了淀粉原來的枝杈結構，增加形成抗性糊精的分支度，從而得到抗性糊精，Tester R F等人[18]對此進行了較為詳細的研究與報道。

由圖2（d）可知，隨著轉苷酶用量的不斷增加，其抗性不斷增強。當酶用量達到35 U/g時，增加趨于緩慢。轉苷酶能夠增強抗性的原因可能是因為轉苷酶能夠將游離于溶液中的葡萄糖、麥芽糖等小分子通過其他鍵的結合形式結合于糊精分子上形成潘塘、異麥芽糖和其他分歧低聚糖等，而這部分也是抗性成分，從而形成抗性糊精[14]。Wang Y J等人[19]也進行了相關研究，轉苷酶從高直鏈玉米淀粉中獲得酶抗性糊精。

隨著酶解溫度、酶解時間和β-淀粉酶酶用量增加，山藥淀粉的酶解程度和酶的活性不斷增強，酶解程度相應隨之增加，即DE值不斷增大。

圖2 酶解制備條件對抗性含量和DE值的影響

綜上所述，出于經(jīng)濟成本的考慮，在下面的研究中，以微波預處理功率60 W和微波時間6 min，通過酶解溫度75℃，酶解時間20 min，添加β-淀粉酶20 U/g和轉苷酶35 U/g作為山藥抗性糊精制備條件，進行后續(xù)試驗研究。

2.2 物化性質(zhì)的分析

抗性糊精與山藥淀粉的分子量和熱特性分析見表1。

表1 抗性糊精與山藥淀粉的分子量和熱特性分析

由表1可知，山藥淀粉的相轉變溫度為67.12℃，而以此制備的山藥抗性糊精的相轉變溫度為93.24℃，說明淀粉的基本結構已不存在，形成了新的結構，該物質(zhì)的熱穩(wěn)定性很高，這種吸熱轉變歸因于山藥淀粉制備山藥抗性糊精過程中分子的重新聚合和轉糖基作用[17，20]。通過高效液相色譜測定抗性糊精與山藥淀粉的相對分子量，根據(jù)分子量與保留時間之間的標準曲線，計算微波輔助酶解制備得到的抗性糊精和山藥淀粉的相對分子量分子量（Mw）約為4.0×103Da和3.2×104Da（見表1）。由于抗性糊精在形成過程中發(fā)生解聚，造成嚴重的主鏈結構（α-1,4糖苷鍵）解聚，以及在酶和微波預處理的共同作用形成新的分支，所以抗性糊精的分子量比山藥淀粉顯著降低[21]。

山藥抗性糊精含量對山藥淀粉溶解度的影響見圖3。

圖3 山藥抗性糊精含量對山藥淀粉溶解度的影響

由圖3可知，抗性糊精抗性含量越高，溶解度越好，與原山藥淀粉相比，溶解度提高了47.01%，此時抗性糊精含量為40.33%，抗性糊精溶解度好的原因或許是在形成糊精的過程中，山藥淀粉顆粒的無定形區(qū)和結晶區(qū)都被破壞，山藥淀粉的空間結構也被破壞，使山藥淀粉分子降解得到了很多的可溶性小分子物質(zhì)[7]。良好的水溶性使得山藥抗性糊精能夠更好地應用在食品行業(yè)中。

2.3 山藥抗性糊精體外消化性分析

人工胃液（AGJ） 和人工腸液中（AIF） 中抗性糊精和山藥淀粉的體外消化率見表2。

表2顯示了山藥淀粉及其制備得到的抗性糊精樣品在人造模擬胃液中處理240 min和在人造腸液中處理360 min的體外消化情況。結果表明，在人工胃液消化階段，所有樣品消化緩慢，隨著消化時間的延長，消化率均小于1%。在人造腸液消化階段，山藥淀粉在人造腸液中消化率顯著增加，山藥抗性糊精在人造腸液中的消化率遠低于山藥淀粉。人工胃液對山藥淀粉和抗性糊精微量的消化作用，可能是因為胃液具有較強的酸性，對其具有輕微水解作用和侵蝕作用[22]。據(jù)報道，淀粉分子在形成抗性糊精時，分子重新聚合形成不易消化的1,2-、1,3-或具有高分支度的糊精分子，對酶消化具有抗性[23]，故而山藥抗性糊精在人工腸液中消化緩慢。

表2 人工胃液（AGJ）和人工腸液中（AIF）中抗性糊精和山藥淀粉的體外消化率/%

3 結論

在微波功率60 W，微波時間6 min預處理淀粉的基礎上，酶解溫度75℃，酶解時間20 min，β-淀粉酶酶用量20 U/g，葡糖糖轉苷酶酶用量35 μ/g的制備條件下所制備的山藥抗性糊精含量和溶解度分別達到了40.33%和47.01%，具有較低分子量約為4 000 Da，還具有較好的熱穩(wěn)定性和對人造胃液或小腸液的高耐受性，這些特點使得由山藥淀粉制備得到的抗性糊精更適合應用于食品行業(yè)中。今后，還需要對抗性糊精展開進一步研究，以更好地認識其結構和形成機理，并驗證其是否具有作為膳食纖維和益生元的可能性。

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