張彩鳳 齊廣海 王曉翠 武書庚* 張海軍* 王 晶 史兆國 王 梁 王 暉

(1.中國農(nóng)業(yè)科學院飼料研究所，農(nóng)業(yè)部飼料生物技術重點開放實驗室，生物飼料開發(fā)國家工程研究中心，北京 100081；2.甘肅農(nóng)業(yè)大學動物科學技術學院，蘭州 730070；3.北京市畜牧總站，北京 100107；4.廈門泓禾谷生物科技有限公司，廈門 361000)

肉雞養(yǎng)殖業(yè)是我國畜牧業(yè)中發(fā)展速度最快、規(guī)?；阶罡叩漠a(chǎn)業(yè)[1]。飼用抗生素廣泛、大量地應用于畜牧養(yǎng)殖業(yè)中[2]，在預防疾病促生長的同時，導致細菌耐藥性增強[3-4]，世界上的“禁抗”始于1986年，當今越來越多的國家推出了自己的“禁抗”和“限抗”行動。因此，通過營養(yǎng)調(diào)控肉雞健康狀況成為當今的研究熱點。

乳酸菌(Lactobacillus)和酵母菌(Saccharomycetes)可促進肉仔雞脾臟、胸腺和法氏囊等免疫器官發(fā)育[5-9]，顯著增加淚液、器官液、腸液和膽汁中免疫球蛋白M(IgM)、免疫球蛋白A(IgA)、免疫球蛋白G(IgG)的含量[10]，進而提高免疫力。乳酸菌和酵母菌通過代謝產(chǎn)物的互補和群體感應作用相互促進生長，本課題組前期研究已證實飼糧添加0.1%乳酸菌和酵母菌復合制劑可通過調(diào)控腸道健康，改善肉仔雞的生長性能[11]。目前，關于乳酸菌和酵母菌復合制劑替代抗生素及與抗生素聯(lián)合使用對肉雞抗氧化能力和免疫功能影響的研究還不充分，不能較好地解釋乳酸菌和酵母菌復合制劑改善生長性能[11]的機理。因此，本試驗通過研究飼糧中添加乳酸菌和酵母菌復合制劑及其與維吉尼亞霉素聯(lián)合使用對肉仔雞血清生化指標、抗氧化能力和免疫功能的影響，以期為該微生態(tài)制劑在肉仔雞養(yǎng)殖生產(chǎn)中的合理應用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

乳酸菌和酵母菌復合制劑由廈門泓禾谷生物科技有限公司提供，其中乳酸菌(BCRC 16092)的活菌數(shù)為2.5×109CFU/g，酵母菌(BCRC 20262)的活菌數(shù)為1.3×109CFU/g。維吉尼亞霉素購自美國輝寶有限公司，有效成分含量為50%。

1.2 試驗設計與飼養(yǎng)管理

隨機選取400只1日齡的健康愛拔益加(AA)肉仔雞公雛，根據(jù)體重相近的原則分為4組，分別飼喂基礎飼糧(對照組)，基礎飼糧+30 mg/kg維吉尼亞霉素(VM組)、基礎飼糧+15 mg/kg維吉尼亞霉素+0.1%乳酸菌和酵母菌復合制劑(飼糧中乳酸菌活菌數(shù)實測值為2.3×106CFU/g、酵母菌活菌數(shù)實測值為1.3×106CFU/g，VM+LS組)、0.1%乳酸菌和酵母菌復合制劑(飼糧中乳酸菌活菌數(shù)實測值為2.3×106CFU/g、酵母菌活菌數(shù)實測值為1.3×106CFU/g，LS組)，每組5個重復，每個重復20只雞。采用4層立體網(wǎng)上籠養(yǎng)，試驗期42 d，分為前期(1～21日齡)和后期(22～42日齡)。基礎飼糧參照NRC(1994)和我國《雞飼養(yǎng)標準》(NY/T 33—2004)，結(jié)合《AA肉仔雞飼養(yǎng)手冊》配制，其組成及營養(yǎng)水平見表1。各組飼糧經(jīng)冷壓制粒(制粒過程中最高溫度65 ℃)，迅速冷卻。

試驗期間，自然光照加人工補光，試驗前7天每天24 h光照，之后每天23 h光照，全期自由采食、飲水。試驗前3天室溫維持在33 ℃，此后每周降低2 ℃，直至將至24 ℃后維持不變。按照《AA肉仔雞飼養(yǎng)管理手冊》操作，對雛雞常規(guī)免疫、消毒。試驗期內(nèi)，每天24 h記錄雞舍溫度和濕度，清掃衛(wèi)生，記錄死淘雞數(shù)。

表1 基礎飼糧組成及營養(yǎng)水平(風干基礎)

1)維生素預混料為每千克飼糧提供Vitamin premix provided the following per kg of diets:VA 12 500 IU，VD32 500 IU，VE 15 mg，VK32.65 mg，VB12 mg，VB26 mg，VB120.025 mg，生物素 biotin 0.35 mg，葉酸 folic acid 1.25 mg，泛酸 pantothenic acid 12 mg，煙酸 nicotinic acid 50 mg。

2)礦物質(zhì)預混料為每千克飼糧提供Mineral premix provided the following per kg of diets:Cu (as copper sulfate) 8 mg，Zn (as zinc sulfate) 75 mg，F(xiàn)e (as ferrous sulfate) 80 mg，Mn (as manganese sulfate) 80 mg，Se (as sodium selenite) 0.15 mg，I (as potassium iodide) 0.35 mg。

3)代謝能和有效磷為計算值，其余為實測值。ME and AP were calculated values, while the others were measured values.

1.3 測定指標與方法

1.3.1 免疫器官指數(shù)

分別于試驗第21天(21日齡)和第42天(42日齡)，每個重復選取2只體重與該重復平均值接近的試驗雞，頸靜脈放血致死，分離完整的脾臟、法氏囊和胸腺，稱重并計算器官指數(shù)。免疫器官指數(shù)計算公式如下：

免疫器官指數(shù)(g/kg)=免疫器官重量(g)/
活體重(kg)。

1.3.2 血清樣品制備

分別于試驗第21天(21日齡)和第42天(42日齡)，每個重復選取2只與該重復平均體重接近的試驗雞，翅靜脈采血5 mL，抗凝管存放，3 000 r/min離心10 min，取上清液分裝于1.5 mL Eppendorf管中，-20 ℃保存，待分析血清生化指標、抗氧化指標和免疫球蛋白含量。

1.3.2.1 血清生化指標

血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、堿性磷酸酶(ALP)活性及總蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、尿酸(UA)、肌酐(CRE)、總膽紅素(TBILI)、葡萄糖(GLU)含量采用試劑盒通過半自動生化分析儀(CHEM-5型)測定，所用試劑盒均購自上?？迫A生物技術有限公司。

1.3.2.2 血清抗氧化指標

血清中總抗氧化能力(T-AOC)和谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)活性采用比色法測定，血清中丙二醛(MDA)含量采用硫代巴比妥酸法測定，血清中總超氧化物歧化酶(T-SOD)活性采用黃嘌呤氧化酶法測定，上述指標測定所用試劑盒均購自南京建成生物工程研究所。

1.3.2.3 血清免疫球蛋白含量

血清中IgG、IgA和IgM含量采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)法測定，所用試劑盒均購自南京建成生物工程研究所。

1.4 統(tǒng)計分析

數(shù)據(jù)用SPSS 16.0軟件的one-way ANOVA程序進行方差分析，當方差分析具顯著性差異時進行Duncan氏法多重比較，P<0.05為差異顯著性標準。結(jié)果以“平均值±標準差”表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 乳酸菌和酵母菌復合制劑及其與維吉尼亞霉素聯(lián)合使用對肉仔雞血清抗氧化指標的影響

乳酸菌和酵母菌復合制劑及其與維吉尼亞霉素聯(lián)合使用對肉仔雞血清抗氧化指標的影響見表2。21日齡時，飼糧添加乳酸菌和酵母菌復合制劑及其與維吉尼亞霉素聯(lián)合使用顯著影響了血清MDA含量(P<0.001)和GSH-Px活性(P=0.049)；與對照組相比，VM組、VM+LS組和LS組的血清MDA含量顯著降低(P<0.05)；VM+LS組和LS組的血清GSH-Px活性顯著高于對照組和VM組(P<0.05)，VM+LS組與LS組之間無顯著差異(P>0.05)。

42日齡時，飼糧添加乳酸菌和酵母菌復合制劑及其與維吉尼亞霉素聯(lián)合使用顯著影響了血清T-AOC(P=0.035)、MDA含量(P=0.004)以及T-SOD(P<0.001)和GSH-Px活性(P=0.004)；與對照組相比，VM+LS組的血清T-AOC顯著提高(P<0.05)，LS組與VM+LS組之間無顯著差異(P>0.05)；VM+LS組和LS組的血清MDA含量顯著低于對照組(P<0.05)，VM組與其他3組無顯著差異(P>0.05)；VM+LS組和LS組的血清T-SOD和GSH-Px活性顯著高于對照組和VM組(P<0.05)，且LS組的血清T-SOD活性顯著高于VM+LS組(P<0.05)。

上述結(jié)果表明，0.1%的乳酸菌和酵母菌復合制劑及其與15 mg/kg的維吉尼亞霉素聯(lián)用均能提高肉仔雞血清T-SOD和GSH-Px活性，降低血清MDA含量，改善機體的氧化還原狀態(tài)。

2.2 乳酸菌和酵母菌復合制劑及其與維吉尼亞霉素聯(lián)合使用對肉仔雞免疫器官指數(shù)的影響

乳酸菌和酵母菌復合制劑及其與維吉尼亞霉素聯(lián)合使用對肉仔雞免疫器官指數(shù)的影響見表3。飼糧添加乳酸菌和酵母菌復合制劑及其與維吉尼亞霉素聯(lián)合使用對21和42日齡肉仔雞的免疫器官指數(shù)均未產(chǎn)生顯著影響(P>0.05)，但是在數(shù)值上VM+LS組和LS組均高于對照組和VM組，且42日齡脾臟指數(shù)有提高的趨勢(P=0.062)。

上述結(jié)果表明，0.1%的乳酸菌和酵母菌復合制劑及其與15 mg/kg的維吉尼亞霉素聯(lián)合使用有提高脾臟指數(shù)的趨勢。

表2 乳酸菌和酵母菌復合制劑及其與維吉尼亞霉素聯(lián)合使用對肉仔雞血清抗氧化指標的影響

同行數(shù)據(jù)肩標無字母或相同小寫字母表示差異不顯著(P>0.05)，不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。下表同。

In the same row, values with no letter or the same small letter superscripts mean no significant difference (P>0.05), while with different small letter superscripts mean significant difference (P<0.05). The same as below.

表3 乳酸菌和酵母菌復合制劑及其與維吉尼亞霉素聯(lián)合使用對肉仔雞免疫器官指數(shù)的影響

2.3 乳酸菌和酵母菌復合制劑及其與維吉尼亞霉素聯(lián)合使用對肉仔雞血清免疫球蛋白含量的影響

乳酸菌和酵母菌復合制劑及其與維吉尼亞霉素聯(lián)合使用對肉仔雞血清免疫球蛋白含量的影響見表4。飼糧添加乳酸菌和酵母菌復合制劑及其與維吉尼亞霉素聯(lián)合使用顯著影響21日齡肉仔雞的血清IgG(P<0.001)和IgA含量(P=0.001)。與對照組相比，VM+LS組和LS組21日齡肉仔雞的血清IgG含量顯著高于對照組和VM組(P<0.05)，且LS組顯著高于VM+LS組(P<0.05)；LS組21日齡肉仔雞的血清IgA含量顯著高于其他各組(P<0.05)。

飼糧添加乳酸菌和酵母菌復合制劑及其與維吉尼亞霉素聯(lián)合使用顯著影響42日齡肉仔雞的血清IgG(P<0.001)、IgA(P=0.038)和IgM含量(P=0.011)。VM+LS組和LS組21日齡肉仔雞的血清IgG含量顯著高于對照組和VM組(P<0.05)，且LS組顯著高于VM+LS組(P<0.05)；LS組21日齡肉仔雞的血清IgA和IgM含量顯著高于對照組和VM組(P<0.05)，對照組和VM組之間無顯著差異(P>0.05)。

上述結(jié)果表明，0.1%的乳酸菌和酵母菌復合制劑及其與15 mg/kg的維吉尼亞霉素聯(lián)合使用均能提高肉仔雞的血清免疫球蛋白含量，且以單獨添加乳酸菌和酵母菌復合制劑時作用效果更明顯。

表4 乳酸菌和酵母菌復合制劑及其與維吉尼亞霉素聯(lián)合使用對肉仔雞血清免疫球蛋白含量的影響

2.4 乳酸菌和酵母菌復合制劑及其與維吉尼亞霉素聯(lián)合使用對肉仔雞血清生化指標的影響

乳酸菌和酵母菌復合制劑及其與維吉尼亞霉素聯(lián)合使用對肉仔雞血清生化指標的影響見表5。21日齡時，飼糧添加乳酸菌和酵母菌復合制劑及其與維吉尼亞霉素聯(lián)合使用對肉仔雞血清AST、ALT和ALP活性以及TBILI、ALB、UA、GLU、TP和CRE含量均未產(chǎn)生顯著影響(P>0.05)。42日齡時，血清AST、ALT和ALP活性以及TBILI、UA、GLU、ALB和CRE含量各組間均無顯著差異(P>0.05)；相對于對照組，VM+LS組和LS組的血清TP含量分別提高11.07%和5.91%，差異均達到顯著水平(P<0.05)。

上述結(jié)果表明，0.1%的乳酸菌和酵母菌復合制劑及其與15 mg/kg的維吉尼亞霉素聯(lián)合使用均能提高肉仔雞的血清TP含量，提示乳酸菌和酵母菌復合制劑促進了肉仔雞的機體蛋白質(zhì)合成。

3 討 論

3.1 乳酸菌和酵母菌復合制劑及其與維吉尼亞霉素聯(lián)合使用對肉仔雞血清生化指標的影響

血清AST、ALT和ALP等酶類的活性能反映肝臟細胞受損情況及嚴重程度[12]。血清TP包括ALB和球蛋白，TP和ALB的含量反映機體蛋白質(zhì)的吸收和代謝狀況，TP含量升高不僅表明氨基酸、蛋白質(zhì)的吸收利用率提高，也是維持機體體液免疫的重要基礎[13]。研究發(fā)現(xiàn)，飼糧中添加0.1%～0.2%的乳酸菌未見顯著影響肉仔雞血清中ALP的活性[14]；飼糧中添加乳酸菌、酵母菌、芽孢桿菌復合微生態(tài)制劑后肉雞血清TP含量顯著增加[15]；飼糧中添加0.2%的植物乳桿菌顯著提高了肉仔雞血清中TP的含量[16]。本研究結(jié)果與上述報道相似，與對照組和30 mg/kg維吉尼亞霉素組相比，0.1%乳酸菌和酵母菌復合制劑提高了42日齡肉仔雞血清中TP含量，但血清中ALB含量變化不顯著，可能TP含量的升高與免疫球蛋白含量的升高有關，這與本試驗中添加0.1%乳酸菌和酵母菌復合制劑后肉仔雞血清免疫球蛋白含量升高的測定結(jié)果相一致。此外，當前關于乳酸菌或酵母菌與抗生素聯(lián)合使用的研究較少，本研究中用乳酸菌和酵母菌復合制劑替代部分維吉尼亞霉素，結(jié)果表明0.1%的乳酸菌和酵母菌復合制劑與15 mg/kg的維吉尼亞霉素聯(lián)合使用組肉仔雞42日齡的血清TP含量顯著高于30 mg/kg維吉尼亞霉素組，且與0.1%乳酸菌和酵母菌復合制劑組無顯著差異。這與本課題組前期發(fā)現(xiàn)的0.1%乳酸菌和酵母菌復合制劑與15 mg/kg維吉尼亞霉素聯(lián)合使用具有更好的促生長效果[11]是一致的，說明0.1%的乳酸菌和酵母菌復合制劑與15 mg/kg的維吉尼亞霉素聯(lián)合使用提高機體蛋白質(zhì)代謝的效果更明顯，二者之間可能存在協(xié)同作用。

表5 乳酸菌和酵母菌復合制劑及其與維吉尼亞霉素聯(lián)合使用對肉仔雞血清生化指標的影響

3.2 乳酸菌和酵母菌復合制劑及其與維吉尼亞霉素聯(lián)合使用對肉仔雞抗氧化能力的影響

正常狀態(tài)下，機體的自由基生成和消除處于動態(tài)平衡之中，但當動物遭受應激時，體內(nèi)自由基產(chǎn)生過量而致氧化損傷。T-AOC是用于衡量動物機體抗氧化能力的重要指標，可反映機體非酶系統(tǒng)和氧化酶系統(tǒng)對機體內(nèi)自由基代謝的狀況，以及對外來刺激的代償能力。MDA是脂質(zhì)過氧化終產(chǎn)物，反映氧自由基介導的脂質(zhì)過氧化程度；T-SOD和GSH-Px是生物機體內(nèi)重要的抗氧化酶，影響機體線粒體內(nèi)關鍵酶活性及線粒體呼吸鏈復合物活性。研究發(fā)現(xiàn)，飲水中添加乳桿菌和屎腸球菌可顯著提高肉仔雞的抗氧化水平[17]；飼糧中添加0.2%的植物乳酸菌顯著提高了肉仔雞血清T-AOC，可保護肉仔雞免受氧化損傷，維持機體的健康狀態(tài)[8]；飼糧中添加0.20%酵母培養(yǎng)物能顯著降低肉仔雞血清中MDA含量，維持機體健康狀況[18]。本試驗結(jié)果表明，飼糧中添加0.1%的乳酸菌和酵母菌復合制劑顯著提高了肉仔雞的血清T-AOC，增強了機體防御體系的抗氧化能力；0.1%的乳酸菌和酵母菌復合制劑顯著提高了肉仔雞的血清T-SOD活性，通過提高機體清除超氧陰離子自由基的能力，保護細胞免損傷；0.1%乳酸菌和酵母菌復合制劑顯著提高了肉仔雞血清GSH-Px活性，能夠保護細胞膜的結(jié)構(gòu)完整性，有效抵抗過氧化物的干擾及損害；0.1%的乳酸菌和酵母菌復合制劑顯著降低了血清MDA含量，說明機體內(nèi)脂質(zhì)過氧化程度降低；且隨肉仔雞日齡的增加，乳酸菌和酵母菌復合制劑的作用效果明顯優(yōu)于抗生素。由此表明，乳酸菌和酵母菌復合制劑通過改善肉仔雞的氧化還原狀態(tài)，維持更好的健康狀況，從而改善生長性能[11]。

維吉尼亞霉素能不可逆地抑制細菌蛋白質(zhì)的合成，導致細菌死亡，通常用于預防和治療革蘭氏陽性菌的感染。飼料中添加抗生素可提高24日齡肉仔雞的血清T-AOC[8]，表明抗生素可能通過提高動物抗氧化能力，改善動物健康狀況，這與本試驗結(jié)果一致。本試驗中，30 mg/kg維吉尼亞霉素組肉仔雞的21日齡血清T-SOD活性高于對照組，且血清MDA含量較對照組顯著降低，表明抗生素可提高機體清除超氧自由基的能力，提高抗氧化能力。此外，與對照組相比，LS組和VM+LS組肉仔雞血清T-AOC以及SOD和GSH-Px活性均顯著提高，血清MDA含量顯著降低，體內(nèi)脂質(zhì)過氧化程度降低，且前期LS組效果明顯，后期LS組和VM+LS組的效果相當，表明乳酸菌和酵母菌復合制劑及其與維吉尼亞霉素聯(lián)合使用可通過增強機體防御抗氧化能力體系，提高機體清除超氧陰離子自由基的能力，提高血清中GSH-Px活性來保護細胞膜的結(jié)構(gòu)完整性，提高肉仔雞的抗氧化能力，改善機體健康狀況。

3.3 乳酸菌和酵母菌復合制劑及其與維吉尼亞霉素聯(lián)合使用對肉仔雞免疫功能的影響

胸腺和法氏囊是動物的中樞免疫器官，是禽類體液免疫的主要場所；脾臟是外周免疫器官，參與全身免疫，其相對重量增加說明機體免疫水平提高[19]。研究發(fā)現(xiàn)，與抗生素相比，0.2%的植物乳酸菌可使肉仔雞脾臟指數(shù)和法氏囊指數(shù)分別提高40.6%和47.7%[8]，表明乳酸菌通過提高免疫器官指數(shù)增強外周和體液免疫力。本試驗中，飼糧中添加0.1%的乳酸菌和酵母菌復合制劑及其與15 mg/kg的維吉尼亞霉素聯(lián)合使用后，肉仔雞的脾臟指數(shù)均有升高趨勢，說明乳酸菌和酵母菌復合制劑及其與維吉尼亞霉素聯(lián)合使用有促進肉仔雞免疫器官發(fā)育的作用。同時，本研究結(jié)果還顯示，雖然免疫器官指數(shù)各組間差異不顯著，但VM+LS組肉仔雞的脾臟指數(shù)和法氏囊指數(shù)均有最大值，說明0.1%的乳酸菌和酵母菌復合劑與15 mg/kg的維吉尼亞霉素可能具有協(xié)同作用，需進一步試驗證明。

免疫球蛋白是具抗體活性的動物蛋白質(zhì)，具有抗菌、抗病毒和抗外毒素等多種功能，家禽體內(nèi)主要有3種：IgA、IgG和IgM。IgG能激活補體、中和毒素；IgA進入黏膜表面、中和感染因子[6]，其含量直接反映了機體免疫力。研究發(fā)現(xiàn)，微生態(tài)制劑可促進機體產(chǎn)生非特異性免疫的分泌型免疫球蛋白A(sIgA)[6]；飼糧中添加0.2%的植物乳酸菌后肉仔雞血清IgG含量比抗生素組和對照組分別提高24.3%和16.2%[8]；飼糧中添加1%的草乳桿菌和格氏乳桿菌復合制劑能顯著提高肉仔雞血清IgA和IgG含量[20]；通過飲水攝入雞源乳酸菌液后肉仔雞血清IgG和IgA含量顯著提高[21]。上述研究表明，乳酸菌無論是單獨添加還是與其他菌復合添加，均可顯著提高肉仔雞機體的免疫功能。本試驗中，與對照組相比，飼糧中添加0.1%的乳酸菌和酵母菌復合制劑顯著提高了肉仔雞42日齡時血清IgG、IgA和IgM含量，說明乳酸菌和酵母菌復合制劑可顯著提高肉仔雞機體的免疫功能。

研究表明，飼糧中添加50 mg/kg的維吉尼亞霉素可顯著提高肉雞21日齡時血清中IgG的含量[22]，與本試驗結(jié)果并不一致，產(chǎn)生差異的原因可能是2個試驗中維吉尼亞霉素的添加劑量不同所致。此外，0.1%的乳酸菌和酵母菌復合制劑與15 mg/kg的維吉尼亞霉素聯(lián)合使用可使肉仔雞42日齡時血清IgG含量高于顯著對照組，說明乳酸菌和酵母菌復合制劑與維吉尼亞霉素可協(xié)同提高機體的免疫力。0.1%乳酸菌和酵母菌復合劑組肉仔雞42日齡時血清IgG和IgM含量顯著高于0.1%的乳酸菌和酵母菌復合劑與15 mg/kg的維吉尼亞霉素聯(lián)合使用組，說明單獨使用0.1%的乳酸菌和酵母菌復合劑比其與15 mg/kg維吉尼亞霉素聯(lián)合使用有更好地提高機體免疫力的作用，從而改善肉仔雞的健康狀況，進而提高生長性能，這本課題組前期得出的生長性能的結(jié)果[11]是相一致的。

4 結(jié) 論

飼糧中單獨添加0.1%的乳酸菌和酵母菌復合制劑及其與15 mg/kg的維吉尼亞霉素聯(lián)合使用均能提高肉仔雞的抗氧化能力和免疫功能，改善健康狀況，且以單獨添加0.1%的乳酸菌和酵母菌復合制劑效果更明顯。

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