折瀟 王林 張世俊 張蓓 李亞軍
西安醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科(西安710077)
癲癇是一組由腦部神經(jīng)元高度同步化異常放電所導(dǎo)致的慢性腦部疾病,在神經(jīng)系統(tǒng)疾病中發(fā)病率僅次于腦血管病。流行病學(xué)研究顯示,癲癇的患病率為3.6‰ ~7.0‰,其中約25%為難治性癲病[1]。顳葉癲癇(temporal lobe epilepsy,TLE)是最常見的難治性癲癇,反復(fù)發(fā)作嚴(yán)重影響患者的生存質(zhì)量和生命安全,其發(fā)病機制尚不完全清楚[2]。
多個研究表明,免疫介導(dǎo)的血腦屏障的破壞可能參與了TLE的反復(fù)發(fā)作[3]?;|(zhì)金屬蛋白酶9(MMP-9)激活后能降解血管基底膜,包括膠原、纖維連接蛋白和基膜,損傷血腦屏障增加通透性,可能導(dǎo)致慢性癲癇病灶形成[4]。但是,目前MMP-9參與TLE的機制過程并不清楚。已有研究顯示,在中樞血管內(nèi)皮細(xì)胞中,MMP-9的活性受凋亡信號調(diào)節(jié)激酶1(ASK1)的調(diào)控[5]。本研究應(yīng)用鋰-匹羅卡品癲癇模型,觀察癲癇大鼠海馬ASK1和MMP-9表達(dá)變化,并探討其在TLE發(fā)生中的作用與機制。
1.1 實驗動物和分組 健康雄性SD大鼠(西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院動物中心)100只,8~10周齡,體質(zhì)量200~220 g,SPF級。實驗動物置于清潔級動物實驗室飼養(yǎng),溫度20~25℃,相對濕度40%~70%,光暗周期為12 h/12 h,自由進(jìn)食常規(guī)飼料和清潔飲水,正常營養(yǎng)狀態(tài)。動物隨機分為對照組、癲癇組、ASK1抑制劑組和MMP-9抑制劑組,其中癲癇組按造模時間點分為:1 d組、3 d組及7 d組,每組10只大鼠。所有動物實驗依據(jù)本單位實驗動物操作規(guī)程執(zhí)行,符合本單位動物實驗倫理道德規(guī)范。
1.2 動物模型制備及處理 癲癇組大鼠經(jīng)腹腔注射氯化鋰(120 mg/kg,Sigma-Aldrich,美國),20 h后經(jīng)腹腔注射硫酸阿托品10 mg/kg,30 min后腹腔注射匹羅卡品30 mg/kg(Sigma-Aldrich)。當(dāng)大鼠癲癇發(fā)作按Racine評分達(dá)4級或以上時為造模成功,出現(xiàn)癲癇持續(xù)狀態(tài)1 h以上或抽搐致瀕危時給予腹腔注射安定10 mg/kg,終止癲癇發(fā)作。對照組大鼠接受等體積生理鹽水注射,癲癇組進(jìn)行鋰-匹羅卡品造模,ASK1抑制劑組和MMP-9抑制劑組接受鋰-匹羅卡品造模3 d,同時分別接受10 mg/(kg·d)的ML365(MCE,美國)和5 mg/(kg·d)的GM6001(MCE)腹腔注射。
1.3 改良Racine評分 無癲癇發(fā)作為0分;有凝視癥狀發(fā)作為1分;濕狗樣抖動和規(guī)律性點頭,不伴有或伴有面部抽動為2分;單側(cè)前肢陣攣為3分;后肢站立,前肢抖動,持續(xù)性點頭為4分;肢體顫動,失平衡跌倒,全身強直陣攣為5分;發(fā)作衰竭死亡記為6分。
1.4 動物取材 4%水合氯醛麻醉后打開胸腔,由心尖經(jīng)二尖瓣至主動脈,0.9%氯化鈉快速灌注。然后4%多聚甲醛先快后慢灌注20 min。斷頭取腦,4%多聚甲醛固定24 h進(jìn)行石蠟包埋。另外的實驗大鼠則給予4%水合氯醛麻醉后,斷頭直接取腦,并剝離海馬保存在液氮中,用于后期檢測。
1.5 Western blot檢測 凍存的海馬組織加入RIPA裂解液(碧云天,中國)研磨裂解,4℃離心,取上清。8%SDS-PAGE凝膠電泳,250 mA、80 min轉(zhuǎn)至PVDF膜。MMP-9一抗(1∶1 000,CST,美國)和ASK1一抗(1∶1 000,CST)4℃孵育過夜。辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗小鼠、羊抗兔二抗(1∶1 000,碧云天)37℃孵育1 h?;瘜W(xué)發(fā)光后凝膠成像系統(tǒng)(Bio-Rad,美國)中曝光檢測。
1.6 免疫熒光組織化學(xué)染色 海馬組織冰凍切片,厚度6 μm,室溫固定,蒸餾水沖洗,3%H2O2室溫孵育30 s,蒸餾水沖洗。羊血清室溫封閉1 h,滴加MMP-9抗體(1:100),4℃孵育過夜。PBS沖洗后,滴加熒光山羊抗兔二抗(1:1 000,Invitrogen,美國),37℃孵育1 h。PBS沖洗后,激光共聚焦顯微鏡下觀察結(jié)果。紅色標(biāo)記的為MMP-9免疫反應(yīng)陽性細(xì)胞。
1.7 統(tǒng)計學(xué)方法 數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。多組樣本比較采用單因素方差分析,同時采用Newman-Keuls分析檢測兩兩差異。所有數(shù)據(jù)使用GraphPad Prism 5.0軟件分析。
2.1 動物行為學(xué)觀察 Racine評分結(jié)果顯示,對照組均未出現(xiàn)癲癇發(fā)作癥狀,而癲癇組大鼠在造模后1、3、7 d均出現(xiàn)不同程度的癲癇發(fā)作,發(fā)作次數(shù)和評分均顯著高于對照組(P<0.05,表1)。在癲癇組之間,造模后3 d癲癇發(fā)作程度達(dá)到高峰,發(fā)作次數(shù)和評分均相對較高,其發(fā)作次數(shù)顯著高于癲癇1 d組(P<0.05,表1)。7 d組發(fā)作次數(shù)和Racine評分有輕微降低,但與3 d組差異無顯著性。
表1 各組大鼠癲癇發(fā)作次數(shù)和Racine評分Tab.1 The epileptic seizure frequency and Racine score in different groups ±s
表1 各組大鼠癲癇發(fā)作次數(shù)和Racine評分Tab.1 The epileptic seizure frequency and Racine score in different groups ±s
注:與對照組比較,*P<0.05;與癲癇1 d組比較,#P<0.05
1 d 3 d 7 d組別對照組癲癇組次數(shù)0 12.7±1.9*評分0.8±0.42 4.2±0.41*次數(shù)0 19.5±2.4*#評分0.7±0.48 4.9±0.56*次數(shù)0 16.3±3.3*評分0.9±0.31 4.6±0.51*
2.2 癲癇后大鼠海馬MMP-9蛋白表達(dá)升高 海馬組織免疫熒光顯示,與對照組比較,癲癇造模后1、3、7 d海馬區(qū)神經(jīng)細(xì)胞MMP-9均呈強陽性表達(dá),其中造模后3 d海馬MMP-9免疫熒光陽性反應(yīng)最強(圖1A、B)。免疫陽性細(xì)胞數(shù)統(tǒng)計結(jié)果顯示,癲癇組顯著高于對照組,并且癲癇3 d組MMP-9陽性(圖1C)。這些結(jié)果表明,海馬區(qū)MMP-9蛋白表達(dá)與造模后癲癇發(fā)作程度變化一致,并呈時間相關(guān)性。細(xì)胞數(shù)顯著高于1、7 d組(圖1B)。Western blot結(jié)果也顯示,癲癇1、3、7 d海馬MMP-9蛋白表達(dá)均高于對照組,并且造模后3 d顯著高于造模后1和7 d
圖1 癲癇造模后大鼠海馬內(nèi)MMP-9蛋白表達(dá)Fig.1 MMP-9 protein expression in hippocampus after epilepsy molding
圖2 癲癇造模后大鼠海馬ASK1蛋白表達(dá)及其磷酸化Fig.2 The expression and phosphorylation of ASK1 in hippocampus after epilepsy molding
2.3 癲癇后大鼠海馬ASK1蛋白磷酸化水平升高Western blot檢測癲癇造模后不同時間大鼠海馬ASK1蛋白磷酸化水平(P-ASK1)變化。結(jié)果顯示,癲癇造模后1、3和7 d后,大鼠海馬ASK1蛋白表達(dá)無顯著增加,但其磷酸化水平與對照組相比呈不同水平的升高(P<0.05,圖2)。其中,造模后3 d其ASK1的磷酸化水平的增加最為顯著,與1和7 d組相比差異具有顯著性(P<0.05,圖2)。
2.4 癲癇后ASK1磷酸化調(diào)控海馬MMP-9表達(dá)為研究明確ASK1激活對MMP-9表達(dá)的影響,分別采用ASK1特異抑制劑ML365和MMP-9特異抑制劑GM6001處理癲癇模型動物3 d。結(jié)果顯示,ML365顯著抑制了大鼠海馬中ASK1的磷酸化(PASK1),并顯著抑制了MMP-9在海馬的表達(dá)(P<0.05,圖3)。另一方便,GM6001雖然顯著抑制了MMP-9的表達(dá),但對ASK1的磷酸化無明顯影響(P>0.05,圖 3)。
2.5 抑制ASK1和MMP-9對癲癇發(fā)作的影響 應(yīng)用ASK1和MMP-9特異抑制劑ML365和GM6001處理癲癇模型動物3 d,觀察對動物癲癇發(fā)作的影響。改良Racine評分結(jié)果顯示,抑制ASK1顯著降低了大鼠癲癇發(fā)作次數(shù)和Racine評分(P<0.05,圖4A)。同ASK1抑制劑相似,與癲癇組相比,MMP-9抑制劑GM6001也顯著降低了動物的癲癇發(fā)作次數(shù)和Racine評分(P<0.05,圖4B)。這些結(jié)果表明,ASK1磷酸化及其引起的海馬MMP-9表達(dá)和活性升高,在TLE發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮了重要作用。
圖3 癲癇造模中抑制ASK1磷酸化對海馬MMP-9表達(dá)的影響Fig.3 The effect of ASK1 inhibition on MMP-9 expression in hippocampus in epilepsy rats
圖4 抑制ASK1和MMP-9對癲癇發(fā)作的影響Fig.4 Effects of ASK1 and MMP-9 inhibition on epileptic seizure
鋰-匹羅卡品癲癇模型中,全身炎癥反應(yīng)和血腦屏障的破壞參與了慢性癲癇病灶的形成[3-4]?;|(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)是一類鋅依賴性內(nèi)肽酶,以酶原形式存在于細(xì)胞外基質(zhì)中。先前的研究表明,MMP-9表達(dá)上調(diào)參與了多種中樞神經(jīng)系統(tǒng)病理和損失過程,如腦缺血、缺血再灌注損傷、腦梗死后出血性轉(zhuǎn)化、肌萎縮側(cè)索硬化、多發(fā)性硬化、中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染性疾病、帕金森病和阿爾茨海默?。?-9]。MMP-9可能通過多種途徑參與了癲癇的發(fā)病過程。急性期中性粒細(xì)胞分泌MMP-9激活后能降解血管基底膜,增加血腦屏障通透性,促進(jìn)外周炎癥因子進(jìn)入腦內(nèi),激活腦內(nèi)免疫反應(yīng)[10-11]。此外,在鋰-匹羅卡品癲癇模型中,急性期增高的MMP-9可能誘導(dǎo)了海馬神經(jīng)元細(xì)胞的凋亡參與癲癇病灶的形成[12]。本實驗結(jié)果顯示,MMP-9在癲癇發(fā)作后表達(dá)上調(diào),其動態(tài)表達(dá)變化過程與癲癇發(fā)作程度一致,并呈時間相關(guān)性,進(jìn)一步提示MMP-9參與了癲癇慢性病灶的形成。
癲癇急性發(fā)作期全身炎癥反應(yīng),中性粒細(xì)胞分泌MMP-9攻擊基底膜蛋白破壞了血腦屏障[3,10]。但是有研究表明癲癇發(fā)作急性期血腦屏障的破壞是短暫的,急性發(fā)作后30 min血腦屏障的破壞增加,到發(fā)作后4 h血腦屏障恢復(fù)[13]。也有研究認(rèn)為,鋰-匹羅卡品癲癇模型中血腦屏障的損害與神經(jīng)損害無明顯關(guān)系[3]。筆者推測急性發(fā)作期后雖然血腦屏障有一定程度的恢復(fù),但是由于腦內(nèi)免疫反應(yīng)激活,在炎性因子,如IL-1β、TNF-α等的作用下MMP-9表達(dá)仍持續(xù)增多,導(dǎo)致繼發(fā)性損害,包括影響突觸重塑功能,誘導(dǎo)神經(jīng)元變性壞死,參與膠質(zhì)瘢痕形成。本研究同時發(fā)現(xiàn)在海馬區(qū)MMP-9表達(dá)3 d達(dá)高峰后逐漸降低,可能是與癲癇發(fā)作后該區(qū)域錐體細(xì)胞變性死亡有關(guān)。
ASK1是腦損傷后立即激活的一種主要的細(xì)胞內(nèi)信號分子。在多種中樞損傷和病理進(jìn)程中,ASK1可被細(xì)胞內(nèi)的氧化應(yīng)激激活,包括腦缺血性中風(fēng)、亨廷頓病和阿爾茲海默?。?4]。先前的研究顯示,腦損傷時ASK1的激活可導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞的凋亡,而干擾抑制ASK1的表達(dá)可減輕腦損傷[15]。此外,ASK1被證明參與調(diào)節(jié)多種血管功能。例如,ASK1可調(diào)控血管內(nèi)皮生長因子和aquaporin-1的表達(dá),參與血管通透性和水平衡的調(diào)節(jié)?;蛐酒难芯拷Y(jié)果也顯示,ASK1表達(dá)沉默可降低多種腦血管細(xì)胞相關(guān)基因的表達(dá),包括Cdh1、Icam1、Gjb3和Sele,分別為鈣黏素1、細(xì)胞間黏附分子1和縫隙連接蛋白β1的表達(dá)基因[16]。最新的研究顯示,在腦血管內(nèi)皮細(xì)胞中,抑制ASK1激活可直接降低MMP-9的蛋白表達(dá)和活性[5]。本研究結(jié)果顯示,海馬ASK1磷酸化水平在癲癇造模后顯著升高,其磷酸化水平變化趨勢與MMP-9和癲癇發(fā)作程度變化一致。并且ASK1特異抑制劑顯著降低了癲癇后海馬MMP-9的表達(dá)水平,表明癲癇狀態(tài)下,ASK1信號的激活引起了MMP-9的表達(dá)上調(diào)。此外,ASK1抑制劑和MMP-9抑制劑都可有效的減輕動物的癲癇發(fā)作程度,表明ASK1信號的激活及其導(dǎo)致的MMP-9表達(dá)上調(diào)在癲癇發(fā)病進(jìn)程中發(fā)揮了重要作用。
綜上所述,本研究探討了鋰-匹羅卡品癲癇模型中海馬MMP-9的動態(tài)表達(dá)變化,以及ASK1激活及其對MMP-9表達(dá)和活性的調(diào)控作用,揭示了癲癇病灶中MMP-9表達(dá)上調(diào)的分子機制。并且通過應(yīng)用抑制劑,證明ASK1-MMP-9信號通路在TLE發(fā)生過程中可能發(fā)揮了重要作用,為進(jìn)一步闡明TLE發(fā)生的機制和癲癇的臨床治療提供了實驗依據(jù)。
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