楊華 龔明福 徐建眾 鄒利光 張松

(1.重慶市中醫(yī)院放射科，重慶400021；2. 第三軍醫(yī)大學(xué)新橋醫(yī)院放射科，重慶400037)

腫瘤的發(fā)生、發(fā)展呈血管依賴性，腫瘤血管的生成在腫瘤生長(zhǎng)、侵襲和轉(zhuǎn)移過(guò)程中起著重要作用，抗腫瘤血管生成一直是腫瘤治療的研究熱點(diǎn)。體外腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞(vascular endothelial cells，VECs)試驗(yàn)是目前研究腫瘤血管生成及抗腫瘤血管生成治療主要的研究手段。由于腫瘤血管的內(nèi)皮細(xì)胞(tumor-derived vascular endothelial cells，Td-VECs)與正常血管的內(nèi)皮細(xì)胞在結(jié)構(gòu)、分子表達(dá)和功能上有質(zhì)的不同[1]，因而研究腫瘤血管生成不能以正常VECs替代。然而，直接分離、培養(yǎng)腫瘤Td-VECs技術(shù)要求高，尤其是腫瘤新生血管的內(nèi)皮細(xì)胞更是難以獲得。研究表明[2,3]：通過(guò)模擬腫瘤環(huán)境，可以通過(guò)腫瘤因子誘導(dǎo)正常VECs向Td-VECs分化，然而，目前國(guó)內(nèi)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道較少，尤其是針對(duì)細(xì)胞標(biāo)記簡(jiǎn)單有效的Td-VECs培養(yǎng)方法更是鮮有報(bào)道。因而，本研究描述了一種簡(jiǎn)易、方便、可靠的Td-VECs培養(yǎng)方法，并對(duì)Td-VECs的分子表達(dá)及靶向結(jié)合能力進(jìn)行分析，以期為靶向抗腫瘤血管生成提供細(xì)胞基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要的細(xì)胞、試劑與儀器 MDA-MB-231乳腺癌細(xì)胞由第三軍醫(yī)大學(xué)生物化學(xué)及分子生物學(xué)教研室惠贈(zèng)；內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)及染色試劑均購(gòu)自美國(guó)sigma公司、Hyclone公司及Abcam公司；M199細(xì)胞培養(yǎng)液購(gòu)自Hyclone公司；DAPI染色液購(gòu)自美國(guó)Roche公司；內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)支持物(ECGS)購(gòu)自美國(guó)Sciencecell公司；Millicell小室購(gòu)自美國(guó)Millipore公司；總RNA提取試劑、TriZOL試劑及DEPC水購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。超凈臺(tái)為蘇州潔凈化設(shè)備公司，核算儀為美國(guó)Bio-Rad公司生產(chǎn)，倒置顯微鏡和TCSSP5激光共聚焦顯微鏡為德國(guó)徠卡公司。

1.2 方法

1.2.1 人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs)的分離、培養(yǎng) 超凈臺(tái)常規(guī)消毒、滅菌。原代內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基由1 mL谷氨酰胺、20mL胎牛血清、1mL肝素及1mL ECGS加入到80mL M199培養(yǎng)基中制成。取長(zhǎng)約20cm新鮮嬰兒臍帶，剪去機(jī)械損傷的部分。在臍靜脈兩頭套上三通管，手術(shù)縫線固定，預(yù)冷的PBS液反復(fù)沖洗管腔以去除其內(nèi)殘留血液，氣體排凈PBS液。將0.1% I型膠原酶10mL注入管腔內(nèi)，關(guān)閉三通管后將臍帶置入廣口瓶中，37℃細(xì)胞孵箱內(nèi)消化。15min后取出臍帶，收集消化液1000轉(zhuǎn)/分離心5min，棄上清，新鮮培養(yǎng)液重懸細(xì)胞于50mL一次性培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)。倒置顯微鏡每天觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況，兩天更換一次培養(yǎng)液，細(xì)胞鋪滿瓶底約90%時(shí)進(jìn)行1:2傳代。

1.2.2 HUVECs的鑒定 取第3代HUVECs以1×105/孔的密度接種于鋪有多聚賴氨酸(PLL)溶液包被的蓋玻片的6孔板中培養(yǎng)，待細(xì)胞爬片后以預(yù)冷的丙酮酸溶液固定，3%牛血清蛋白(BSA)封閉。將抗CD34抗體按梯度稀釋為1:50、1:100、1:150和1:200四個(gè)濃度，分別滴加到蓋玻片上，以PBS為對(duì)照，置于載玻片上4 ℃孵育過(guò)夜。將帶有FITC標(biāo)記的2抗稀釋1500倍,滴加到蓋玻片上，37℃避光濕盒中孵育1h。DAPI顯色15min，防淬滅封片液封片，激光共聚焦顯微鏡下觀察。

1.2.3 MDA-MB-231乳腺癌細(xì)胞與HUVECs共培養(yǎng) 將人HUVECs按細(xì)胞密度5×104/孔接種于六孔板，在培養(yǎng)箱中孵育12h使細(xì)胞貼壁，然后將接種有5×104/孔密度人乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231的Millicell小室放入六孔板中，繼續(xù)培養(yǎng)3d后收獲六孔板內(nèi)的目標(biāo)細(xì)胞。

1.2.4 Td-VECs的鑒定 ①PCR引物的設(shè)計(jì)，美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心(National Center for Biotechnology Information，NCBI)檢索人腫瘤血管內(nèi)皮標(biāo)志物Tem1、Tem8和人actin蛋白的基因序列，設(shè)計(jì)PCR引物如下：Tem1: LEFT PRIMER:983 21 61.11 52.38 4.00 1.00 actacgttggtggcttcgagt，RIGHT PRIMER:1271 23 59.79 52.17 2.00 1.00 tagggtatctgtggctctctgtc；Tem8: LEFT PRIMER:1183 21 62.20 52.38 3.00 0.00 gaggttcgttggggagaaaag，RIGHT PRIMER:950 21 61.70 52.38 4.00 2.00 atctccttctgcatcctgtcg；actin: LEFT PRIMER:357 22 60.76 50.00 4.00 2.00 gacccagatcatgtttgagacc，RIGHT PRIMER:950 21 61.70 52.38 4.00 2.00 atctccttctgcatcctgtcg。交由Takara(大連)生物工程有限公司合成。②Td-VECs總RNA提取，取六孔板中生長(zhǎng)良好的細(xì)胞，加入1 mL Trizol溶液，機(jī)械吹打，充分裂解，離心管內(nèi)室溫放置5min。加入0.2 mL氯仿，劇烈搖動(dòng)15s，室溫放置3min。4℃下，12000轉(zhuǎn)/分離心15min，吸取上層無(wú)色水相至新的離心管中，加入0.5 mL異丙醇，混勻后室溫沉淀10min。4℃下，12000轉(zhuǎn)/分離心10min，棄上清。加入1 mL DEPC水配制的75%乙醇，顛倒混勻，4℃下，7500轉(zhuǎn)/分離心5min，棄上清。加入20uL DEPC水溶解后取少許在核酸儀上測(cè)量核酸的含量。③Td-VECs的聚合酶鏈反應(yīng)，雙蒸水溶解合成的Tem1、Tem8和actin引物，根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction，RT-PCR)試劑盒的操作說(shuō)明配制成25uL的反應(yīng)體系。設(shè)置程序，將Tem1、Tem8和actin的退火溫度分別設(shè)為53 ℃、51 ℃和52 ℃，循環(huán)數(shù)定為30個(gè)。將合成的DNA產(chǎn)物置于1%瓊脂糖凝膠加樣孔中電泳，1h后置于紫外燈下看結(jié)果。

1.2.5 Td-VECs免疫熒光染色 誘導(dǎo)后的VECs經(jīng)預(yù)冷丙酮溶液固定15min后BSA封閉30min，將抗CD105抗體按梯度稀釋為1:50、1:100、1:150和1:200四個(gè)濃度，分別滴加到蓋玻片上，以PBS為對(duì)照，4℃濕盒內(nèi)孵育過(guò)夜。將帶FITC標(biāo)記的二抗稀釋1500倍滴加到蓋玻片上，避光濕盒中37℃孵育1h，DAPI顯色15min， PBS清洗后防淬滅封片液封片，激光共聚焦顯微鏡下觀察，以未誘導(dǎo)的VECs對(duì)比，了解CD105表達(dá)的程度是否有差異。

1.2.6 靶向CD105納米粒細(xì)胞標(biāo)記 取經(jīng)MDA-MB-231細(xì)胞誘導(dǎo)后處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的VECs。以1x105/孔的密度接種于鋪有PLL溶液包被的蓋玻片的6孔板中，常規(guī)培養(yǎng)待細(xì)胞爬片。分別以鐵濃度為0、0.5、1、2、5 、10ug/mL向誘導(dǎo)后的VECs內(nèi)加入靶向CD105的CL-PEG-MnFe2O4納米粒(為靶向CD105結(jié)合肽的磁性納米粒，已在另文中詳述[4])，每個(gè)濃度設(shè)3個(gè)復(fù)孔。孵育24h后固定，常規(guī)普魯士藍(lán)染色，倒置顯微鏡下觀察、攝片，任意取30個(gè)視野行陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)，計(jì)算細(xì)胞標(biāo)記陽(yáng)性率：標(biāo)記陽(yáng)性率=視野內(nèi)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)/視野內(nèi)細(xì)胞總數(shù) ×100%。以未誘導(dǎo)VECs為對(duì)照。實(shí)驗(yàn)中注意避光操作。

2 結(jié)果

2.1 HUVECs的分離、培養(yǎng)和鑒定 從臍帶取材到完成細(xì)胞分離整個(gè)過(guò)程大致需要2h。原代細(xì)胞培養(yǎng)12h后可見(jiàn)細(xì)胞貼壁；48h細(xì)胞鋪滿瓶底約30%，呈梭形或小圓形，細(xì)胞漿、細(xì)胞核顯示清晰；4d后觀察，細(xì)胞呈梭形，貼壁生長(zhǎng)，鋪滿瓶底約60～70%，呈“鋪路石”樣改變；6d后，細(xì)胞鋪滿瓶底約90%，部分區(qū)域呈簇狀生長(zhǎng)，出現(xiàn)細(xì)胞重疊，進(jìn)行第一次傳代(見(jiàn)圖1)。此后3d進(jìn)行一次細(xì)胞傳代。細(xì)胞CD34免疫熒光染色(見(jiàn)圖2)，可見(jiàn)細(xì)胞呈CD34陽(yáng)性，胞膜呈綠色熒光，胞核呈藍(lán)色熒光，而PBS對(duì)照只見(jiàn)藍(lán)色胞核，未見(jiàn)綠色熒光的細(xì)胞膜。

圖1 不同時(shí)段分離細(xì)胞的培養(yǎng)(×200)Figure 1 Culture of isolated cells at different time periods

圖2 分離細(xì)胞的CD34免疫熒光染色Figure 2 CD34 immunofluorescence staining of isolated cells注： a、b. 為CD34標(biāo)記細(xì)胞; c. 為PBS對(duì)照

2.2 Td-VECs的培養(yǎng)和CD105靶向能力鑒定 誘導(dǎo)后VECs總RNA的RT-PCR反應(yīng)顯示，所獲得的DNA產(chǎn)物大小分別為594 bp、289 bp和321 bp，符合actin、Tem1和Tem8的DNA鏈長(zhǎng)，電泳結(jié)果顯示誘導(dǎo)細(xì)胞的Tem1和Tem8表達(dá)量明顯增高(見(jiàn)圖3)，具有Td-VECs的特性。Td-VECs的CD105免疫熒光染色(見(jiàn)圖4)，呈CD105陽(yáng)性，細(xì)胞膜見(jiàn)紅色熒光，胞核呈藍(lán)色熒光，而PBS對(duì)照組只見(jiàn)胞核藍(lán)色熒光，未見(jiàn)紅色熒光的細(xì)胞膜，且誘導(dǎo)后的VECs熒光強(qiáng)度強(qiáng)于未誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞。在鐵濃度為0、0.5、1、2、5 、10ug/mL時(shí)，共同孵育24h后，誘導(dǎo)后和未誘導(dǎo)的VECs的標(biāo)記率分別為0%、(25.35±4.23)%、(58.07±4.12)%、(86.68±3.42)%、100%、100%和0%、(10.58±2.62)%、(16.31±4.32)%、(46.33±3.42)%、(77.62±4.13)%、100%，誘導(dǎo)后細(xì)胞與靶向CD105納米粒的結(jié)合力明顯強(qiáng)于未誘導(dǎo)細(xì)胞，見(jiàn)圖5。

3 討論

血管內(nèi)皮細(xì)胞為內(nèi)襯在血管腔面的單層細(xì)胞。除在肺部幫助進(jìn)行氣體交換外，血管內(nèi)皮細(xì)胞更多的是在受體的存在下調(diào)節(jié)血細(xì)胞及多種生物活性分子(如：凝血蛋白、生長(zhǎng)因子、脂蛋白和激素等)的量。此外，內(nèi)皮細(xì)胞在很多生理過(guò)程中也起著重要作用：通過(guò)促血栓形成因子和抗血栓形成因子的表達(dá)調(diào)節(jié)止血；與內(nèi)皮下細(xì)胞外基質(zhì)和平滑肌的協(xié)同來(lái)調(diào)節(jié)血管緊張素酶-I的轉(zhuǎn)化、血管活性胺的代謝及緩激肽的降解；內(nèi)皮細(xì)胞還借助表面抗原、細(xì)胞因子和粘附分子的合成參與炎癥及免疫應(yīng)答的過(guò)程[5,6]。

盡管臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞并不能確切代表人體各個(gè)器官、不同類型內(nèi)皮細(xì)胞的生理、代謝及毒性反應(yīng)過(guò)程，但由于取材方便，分離、培養(yǎng)方法簡(jiǎn)單，且一次性獲取細(xì)胞量大，依然是目前應(yīng)用最廣泛的內(nèi)皮細(xì)胞模型。參考Jaffe等[7]的內(nèi)皮細(xì)胞分離方法，我們將取材到內(nèi)皮細(xì)胞分離完成的整個(gè)過(guò)程縮短到2h，不僅提高效率，同時(shí)也最大限度的保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞不受損傷。諸如CD31、CD34、CD54、CD106、血管緊張素、細(xì)胞內(nèi)粘附分子-1(ICAM-1)、血管粘附分子-1(VCAM-1)、Ⅷ因子等均為內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志物，其中，CD31、CD34的是目前最常用的內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志物[8]。我們的結(jié)果顯示：第3代細(xì)胞CD34免疫熒光染色呈CD34陽(yáng)性，說(shuō)明所獲得的細(xì)胞為HUVECs。

圖3 誘導(dǎo)后VECs的PCRFigure 3 PCR after induction of VECs

圖4 血管內(nèi)皮細(xì)胞的免疫熒光染色Figure 4 Immunofluorescence staining of vascular endothelial cells 注：a、b. 誘導(dǎo)后VECs的CD105染色; c. 未誘導(dǎo)的VECs的CD105染色; d.誘導(dǎo)后VECs的PBS對(duì)照

圖5 鐵濃度為5ug/mL的CL-PEG-MnFe2O4標(biāo)記細(xì)胞的普魯士藍(lán)染色(×200)Figure 5 Prussian blue staining of CL PEG MnFe 2O4 labeled cells with iron concentration of 5ug/mL注： a、b. 分別為誘導(dǎo)后及未誘導(dǎo)VECs; c.為誘導(dǎo)后VECs的PBS對(duì)照

細(xì)胞數(shù)量的擴(kuò)增可以通過(guò)傳代培養(yǎng)來(lái)實(shí)現(xiàn)，但細(xì)胞會(huì)隨著傳代次數(shù)的增加而加速衰老和自發(fā)性的凋亡，從而使很多蛋白(如：前列環(huán)素和血管緊張素I等)的表達(dá)逐漸減少，通常，應(yīng)選擇第3-4代細(xì)胞進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)[9]。同時(shí)，在細(xì)胞培養(yǎng)的過(guò)程中所添加的外源性生長(zhǎng)因子及其代謝產(chǎn)物也可能會(huì)改變細(xì)胞蛋白的合成和轉(zhuǎn)運(yùn)[10]。因而，為最大限度的模擬內(nèi)皮細(xì)胞特性，在細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中，應(yīng)盡可能選用內(nèi)皮細(xì)胞專用培養(yǎng)基，且在培養(yǎng)過(guò)程中盡量避免添加任何促細(xì)胞生長(zhǎng)因子。

由于從腫瘤組織中分離Td-VECs操作難度大，且分離細(xì)胞數(shù)量少、培養(yǎng)困難，因而學(xué)者們多采用HUVECs替代以解決Td-VECs難以獲得的問(wèn)題。研究表明[11]：由腫瘤細(xì)胞自分泌和(或)旁分泌的血管因子，可刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞向Td-VECs分化，誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移和管腔生成。Khodarev[12]利用transwell小室將HUVECs和U87MG人神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞進(jìn)行共培養(yǎng)，結(jié)果顯示：HUVECs在形態(tài)、表型及功能變化等方面具有了Td-VECs的特性。同樣，Mikhaylova等采用millicell小室成功誘導(dǎo)人真皮淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞(HDLECs)向乳腺癌淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞分化[13]。因而，為了模擬Td-VECs生長(zhǎng)的內(nèi)環(huán)境，我們采用了膜孔徑為0.4微米的millicell小室建立了內(nèi)皮細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞共培養(yǎng)模型，小室內(nèi)的內(nèi)皮細(xì)胞不能透過(guò)微孔膜，而下室腫瘤細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子能夠通過(guò)微孔膜進(jìn)入上層Millicell小室內(nèi)，從而模擬形成腫瘤內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)環(huán)境。經(jīng)誘導(dǎo)后內(nèi)皮細(xì)胞總RNA的RT-PCR反應(yīng)及DNA電泳結(jié)果顯示：誘導(dǎo)后內(nèi)皮細(xì)胞的Tem1和Tem8表達(dá)量明顯增高，由于Tem1和Tem8僅在腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞上表達(dá)，說(shuō)明誘導(dǎo)后的血管內(nèi)皮細(xì)胞具有Td-VECs的特性。

CD105是內(nèi)皮細(xì)胞膜上的一種糖蛋白，在處于增殖狀態(tài)的腫瘤新生血管內(nèi)皮細(xì)胞過(guò)表達(dá)，且CD105的表達(dá)水平與內(nèi)皮細(xì)胞的增殖程度密切相關(guān)，基于CD105染色的腫瘤微血管密度與腫瘤的預(yù)后高度相關(guān)[14]。因而，可以將CD105作為分子靶標(biāo)用于檢測(cè)所誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞的Td-VECs特性。結(jié)果顯示誘導(dǎo)后的VECs熒光強(qiáng)度強(qiáng)于未誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞。并且靶向CD105納米粒與誘導(dǎo)后細(xì)胞標(biāo)記率也明顯高于未誘導(dǎo)細(xì)胞，表明所獲得的細(xì)胞不僅具有Td-VECs的分子特性，并且具有很好的CD105靶向結(jié)合力。

4 結(jié)論

腫瘤細(xì)胞共培養(yǎng)法可誘導(dǎo)VECs向Td-VECs分化，是獲取基于CD105分子靶向研究的Td-VECs可靠方法，可為進(jìn)一步靶向抗腫瘤血管生成治療研究提供可靠的細(xì)胞基礎(chǔ)。

【參考文獻(xiàn)】

[1]Zhang WJ, Wu LQ, Ye LY,etal. Immunologic characteristics of tumor-derived vascular endothelial cells [J]. Ai Zheng, 2005, 24(5):634-638.

[2]Rape A, Ananthanarayanan B, Kumar S. Engineering strategies to mimic the glioblastoma microenvironment [J]. Adv Drug Deliv Rev, 2014, 79(80):172-183.

[3]Avci NG, Fan Y, Dragomir A,etal. Investigating the Influence of HUVECs in the Formation of Glioblastoma Spheroids in High-Throughput Three-Dimensional Microwells [J]. IEEE Trans Nanobioscience, 2015, 14(7):790-796.

[4]楊華,龔明福,鄒利光,等.靶向Endoglin的CL-PEG-MnFe2O4探針構(gòu)建及體外實(shí)驗(yàn) [J].中國(guó)醫(yī)學(xué)物理學(xué)雜志, 2016, 33(7):751-756.

[5]Mou Y, Yue Z, Zhang H,etal. High quality in vitro expansion of human endothelial progenitor cells of human umbilical veinorigin [J]. Int J Med Sci, 2017, 14(3):294-301.

[6]Baudin B, Bruneel A, Bosselut N,etal. A protocol for isolation and culture of human umbilical vein endothelial cells [J]. Nature protocols, 2007, 2(3): 481-485.

[7]Jaffe EA, Nachman RL, Becker CG,etal. Culture of human endothelial cells derived from umbilical veins. Identification by morphologic and immunologic criteria [J]. Journal of Clinical Investigation, 1973, 52(11): 2745.

[8]Liu X, Wang J, Dong F,etal. Human gingival fibroblasts induced and differentiated into vascular endothelial-like cells [J]. Dev Growth Differ, 2016, 58(9):702-713.

[9]Johnson A, Dipietro LA. Apoptosis and angiogenesis: an evolving mechanism for fibrosis [J]. FASEB J, 2013, 27(10):3893-3901.

[10] Siow RC. Culture of human endothelial cells from umbilical veins [J]. Methods Mol Biol, 2012, 806:265-274.

[11] Morin KT, Dries-Devlin JL, Tranquillo RT. Engineered microvessels with strong alignment and high lumen density via cell-induced fibrin gel compaction and interstitial flow [J]. Tissue Eng Part A, 2014, 20(3-4):553-565.

[12] Khodarev NN, Yu J, Labay E,etal. Tumour-endothelium interactions in co-culture: coordinated changes of gene expression profiles and phenotypic properties of endothelial cells [J]. Journal of cell science, 2003, 116(6): 1013-1022.

[13] Mikhaylova M, Mori N, Wildes FB,etal. Hypoxia increases breast cancer cell-induced lymphatic endothelial cell migration [J]. Neoplasia, 2008, 10(4): 380-389.

[14] 楊華,鄒利光. Endoglin (CD105) 在腫瘤新生血管靶向診斷及治療中的應(yīng)用[J]. 臨床腫瘤學(xué)雜志, 2011, 16(12): 1130-1132.