李德海，杜令娟，康 寧，顧嘉林，王占斌*

（東北林業(yè)大學林學院，黑龍江 哈爾濱 150040）

據(jù)統(tǒng)計，高血脂癥導致冠心病、動脈粥樣硬化等心腦血管疾病患者的死亡率大幅度升高[1]。目前臨床上治療高血脂癥主要以辛伐他汀為主，但長期服用會有損害肝腎等副作用[2]。因此，開發(fā)有效調節(jié)血脂的天然功能性成分成為關注熱點。研究表明三萜類化合物有較好的降血脂作用，是一類重要的天然產(chǎn)物化學成分，符合多種天然產(chǎn)物的特點，具有廣泛的開發(fā)和應用前景[3]。

粗毛纖孔菌（Inonotus hispidus）又名粗毛黃褐孔菌，屬于繡革孔菌科，纖毛孔菌屬，主要分布于遼寧、吉林、黑龍江、內蒙古、北京、山東、寧夏和新疆等北溫帶地區(qū)[4]。粗毛纖孔菌作為藥用真菌，在民間主要用于治療消化不良引起的胃病、高血壓、高血脂、各種癌癥、糖尿病、便秘、痛風和關節(jié)炎等疾病[5]。三萜類化合物是粗毛纖孔菌中一類重要的活性物質，具有抗病毒、抗炎、抗菌、抗癌、溶血、降低血糖血脂等多種生物學作用[6]，因此開發(fā)粗毛纖孔菌功能性成分尤其是三萜類化合物尤為重要。目前，關于粗毛纖孔菌三萜類化合物（triterpenoids from Inonotus hispidus，IHT）的提取技術主要以溶劑回流法為主，此提取方法的耗時長、效率低，超聲波、高剪切、半仿生和雙水相萃取是近年來備受關注的提取技術，不僅在一定程度上提高了IHT提取效率，還具有高效節(jié)能等優(yōu)點[7]?，F(xiàn)如今，對于不同提取技術與三萜類化合物提取及功能性之間關系研究還鮮有報道。本實驗以粗毛纖孔菌菌絲體為原料，體外模擬生物體內環(huán)境，研究不同提取技術對IHT提取效果和降血脂活性的影響，以探尋最大程度保留IHT降血脂活性的處理手段，為選擇IHT高效提取技術及開發(fā)新型降血脂藥物提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

粗毛纖孔菌由東北林業(yè)大學林學院森林保護實驗室提供。

牛磺膽酸鈉、甘氨膽酸鈉、膽酸鈉 上海金穗生物科技有限公司；胰蛋白酶、胃蛋白酶 美國Biotopped公司；鹽酸、硫酸、無水乙醇等試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設備

TGL-16G臺式離心機 上海安亭科學儀器廠；722s紫外分光光度計 上海第三分析儀器廠；JA2003分析天平 上海良平儀器儀表有限公司；DK-8D電熱恒溫水槽 上海森信實驗儀器有限責任公司；RE-52旋轉蒸發(fā)器 上海亞榮生化儀器公司；KQ-500DE型數(shù)控超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司；FLUKO高剪切乳化機 上海弗魯克流體機械制造有限公司；Nicolet 6700傅里葉變換紅外光譜儀 美國Thermo Fisher Scientific公司；JSM-7500F掃描電鏡 日本電子株式會社。

1.3 方法

1.3.1 原料的預處理

根據(jù)徐云紅等[8]的方法，將活化后的菌絲塊接種到液體培養(yǎng)基中發(fā)酵培養(yǎng)，發(fā)酵條件為3 塊菌絲塊，pH值為6，裝液量為100 mL/250 mL三角瓶，轉速為100 r/min，25 ℃條件下培養(yǎng)7 d，過濾培養(yǎng)液，菌絲體烘干，粉碎，過篩，得粗毛纖孔菌菌絲體粉末，低溫保藏備用。

1.3.2 IHT的制備

準確稱取粗毛纖孔菌菌絲體干粉，分別通過用95%乙醇溶液提取的溶劑回流技術[9]、超聲波輔助技術[10]、雙水相萃取技術[11]、半仿生技術[12]、高剪切輔助技術[13]，制備粗毛纖孔菌提取物，即為IHT粗提液，抽濾，減壓濃縮，50 ℃烘干，得IHT干粉，低溫保藏備用。

1.3.3 IHT提取率的測定

1.3.3.1 香草醛-冰乙酸法標準曲線的繪制

根據(jù)參考文獻[14]，略作修改。分別取100 μg/mL標準溶液0.10、0.20、0.40、0.60、0.80、1.00 mL，置于5 mL容量瓶中，100 ℃水浴蒸干，加入0.20 mL新制的5%香草醛-冰乙酸溶液和0.80 mL高氯酸，搖勻，70 ℃水浴反應15 min，常溫放置3 min，乙酸乙酯定容，551 nm波長處比色測定，繪制標準曲線，得回歸方程為Y=0.012 58X＋0.010 36（R2=0.999 2）。

1.3.3.2 提取率的測定

分別稱取1.3.2節(jié)中不同提取技術IHT干粉各50 mg，以體積分數(shù)95%乙醇溶液復溶于100 mL的容量瓶內，按標準曲線的制備方法測定吸光度，并以如下公式計算IHT的提取率：

式中：C為提取液中IHT質量濃度/（mg/mL）；V為提取液定容體積/mL；N為提取液的稀釋倍數(shù)；m為粗毛纖孔菌菌絲體質量/mg。

1.3.4 粗毛纖孔菌提取物中活性成分含量的測定

1.3.4.1 IHT含量的測定

參照1.3.3節(jié)方法測定。

1.3.4.2 多糖含量的測定

參照Dubois等[15]的苯酚-硫酸法，配制質量濃度為0.1 mg/mL的多糖溶液，60 ℃溶解待用。溶液中加入5%苯酚溶液后旋渦振蕩，加入濃硫酸溶液，充分旋渦振蕩，室溫反應20 min后在490 nm波長處測定吸光度。選擇葡萄糖為標準品，將樣品吸光度帶入標準曲線計算出樣品中多糖含量。

1.3.4.3 多酚含量的測定

參照董彩文等[16]福林-酚法，吸取1 mL樣液于10 mL容量瓶中，分別加入福林-酚試劑5 mL，充分振蕩后靜置4 min，加入75%碳酸鈉溶液4 mL，蒸餾水定容，搖勻，室溫避光放置1 h，測定765 nm處的吸光度，以沒食子酸為標準品對照，測定粗毛纖孔菌提取物中多酚成分的含量。

1.3.4.4 黃酮含量的測定

參照王宇等[17]硝酸鋁法，吸取0.5 mL樣液，加入2 mL離心管中，加5%亞硝酸鈉溶液0.1 mL，搖勻放置5 min，再加10%硝酸鋁溶液0.1 mL，搖勻放置6 min，加4%氫氧化鈉溶液1 mL，搖勻放置5 min，60%乙醇溶液定容，510 nm波長處比色測定。以蘆丁為標準品對照，測定粗毛纖孔菌提取物中黃酮成分的含量。

1.3.4.5 蛋白質含量的測定

參照Lowry法（福林-酚法）[18]，使用蛋白質定量試劑盒，樣液配制成質量濃度為0.1 mg/mL溶液，60 ℃溶解待用。溶液加入試劑A，充分旋渦振蕩，室溫反應10 min。加入試劑B，充分旋渦振蕩，室溫反應15 min后在750 nm波長處測定吸光度。選擇牛血清白蛋白為標準品，將樣品吸光度帶入標準曲線計算出樣品中蛋白質含量。

1.3.5 IHT體外降血脂作用的測定

降血脂藥物的降血脂原理之一是能夠與膽酸鹽和膽固醇結合，從而阻止膽酸或膽固醇被腸道吸收影響其肝腸循環(huán)，使膽酸鹽排出體外，促使肝臟中膽固醇不斷轉化為膽酸鹽，從而降低體內膽固醇含量，起到降血脂作用。因此體外降血脂作用原理是通過體外模擬人體內腸道環(huán)境，待測藥物與膽酸鹽相結合產(chǎn)生沉淀，根據(jù)結合量的多少初步衡量待測藥物的降血脂能力。

1.3.5.1 膽酸鹽標準曲線的繪制

參照文獻[19]方法測定，略作修改。分別取不同質量濃度標準樣液2 mL于具塞試管中，加入6 mL質量分數(shù)60%的硫酸溶液，70 ℃水浴20 min，冰浴5 min，在波長387 nm處測定吸光度，繪制標準曲線。

1.3.5.2 膽酸鹽結合能力的測定

參照文獻[20]，略作修改。分別移取1 mL不同提取技術IHT提取液于100 mL具塞三角瓶中，加入1 mL 10 mg/mL胃蛋白酶（以pH 6.3的0.1 mol/L磷酸緩沖液配制）、3 mL 0.01 mol/L的HCl溶液，模擬胃環(huán)境，在37 ℃恒溫振蕩消化1 h；以0.1 mol/L的氫氧化鈉溶液調節(jié)pH值至6.3，隨后加入4 mL 10 mg/mL胰蛋白酶（以pH 6.3的0.1 mol/L磷酸緩沖液配制），在37 ℃恒溫振蕩消化1 h，模擬腸道環(huán)境進行消化。每個樣品分別加入4 mL 1 mmol/L甘氨膽酸鈉、?；悄懰徕c和膽酸鈉（以pH 6.3的0.1 mol/L磷酸緩沖液配制），在37 ℃恒溫振蕩1 h后混合物移至離心管中，4 000 r/min離心20 min，對上清液中的膽酸鹽進行分析。

1.3.6 不同提取技術IHT的紅外光譜分析

采用KBr壓片法。取100 mg干燥KBr粉末研細，加入三萜樣品混合研細，壓成透明薄片。Vector22型紅外光譜儀在4 000～400 cm－1波數(shù)范圍內進行測定。紅外光譜儀測定參數(shù)：分辨率4.0 cm－1；背景掃描次數(shù)32 次；檢測器為氖化硫三肽。

1.4 數(shù)據(jù)分析

實驗中的數(shù)據(jù)均平行測定3 次，以 ±s表示。數(shù)據(jù)均用Excel 2010、Origin 8.0和SPSS 17.0等軟件處理完成。

2 結果與分析

2.1 粗毛纖孔菌提取物中活性成分分析

為明確粗毛纖孔菌提取物中活性成分種類和含量的差異，本實驗測定不同提取技術粗毛纖孔菌提取物中活性成分含量，結果見表1。

表1 不同提取技術粗毛纖孔菌提取物中活性成分含量分析Table 1 Effect of different extraction techniques on the contents of bioactive compounds from I. hispidus%

由表1可知，不同提取技術得到粗毛纖孔菌提取物中各活性成分含量存在顯著性差異（P＜0.05），5種提取技術粗毛纖孔菌提取物中IHT含量均最高，其次是多糖、蛋白質含量，而黃酮和多酚含量較低。其中高剪切技術IHT質量分數(shù)高達（37.78±0.57）%，溶劑回流提取IHT含量最低，質量分數(shù)為（24.42±0.34）%。高剪切技術由于轉子和定子之間的高速運轉，形成強烈的高剪切力使粗毛纖孔菌菌絲體組織細胞發(fā)生裂解，加速細胞內IHT等活性成分的溶出[21]。由此可以看出，5種提取技術粗毛纖孔菌提取物中三萜、多糖及蛋白質是主要的活性成分，為后續(xù)活性成分的降血脂作用的相關性分析提供依據(jù)。

2.2 不同提取技術IHT紅外光譜分析

圖1 不同提取技術下IHT紅外光譜分析Fig. 1 Infrared spectroscopic analysis of triterpenoids from I. hispidus obtained by different extraction techniques

對比白樺酯醇三萜標準品分析高剪切、雙水相、超聲波、半仿生、溶劑回流5 種方法提取IHT紅外圖譜，如圖1所示，不同技術提取的IHT在化學結構上存在一定差異，對比三萜標準品紅外圖譜進行對比分析，5 種不同方法提取的IHT在3 500～3 300 cm－1之間有較寬的吸收峰（3 374.87、3 415.37、3 415.37、3 409.58、3 415.37 cm－1），說明5種IHT有O—H鍵伸縮振動且可能是分子內締合，其中以雙水相提取的IHT峰形最寬，締合程度最強；在1 655～1 590 cm－1之間（1627.65、1 635.36、1 635.36、1 619.94、1 608.01 cm－1）存在吸收峰，且雙水相提取的IHT的吸收峰最強，這是由于發(fā)生N－H變形振動相當于CH2的剪式振動，說明雙水相提取的IHT含有更多的N－H基團；在1 465～1 340 cm－1之間（1 409.73、1 403.94、1 411.66、1 413.59、1 456.01 cm－1）吸收峰較密集，為C－H基團的彎曲振動；5種IHT在1 300～1 000 cm－1之間（1 049.10、991.24、1 078.03、1 033.67、1 049.10 cm－1），也出現(xiàn)特征吸收峰，為C—O的伸縮振動，其中高剪切的吸收峰最強；在3 000～2 800 cm－1之間存在C—H伸縮振動，且以高剪切IHT的吸收峰最強，以上C—O、C—H、O—H及N—H基團與三萜標準品所含官能團相一致。說明5種提取技術提取的IHT初步符合三萜類物質的結構特征。

2.3 活性成分對膽酸鹽降血脂作用的相關性分析

表2 不同活性成分降血脂作用的相關系數(shù)Table 2 Correlation analysis between IHT as well as other bioactive compounds and cholate binding capacity

采用統(tǒng)計學手段，對不同活性成分的降血脂效果進行相關性分析。由表2可知，粗毛纖孔菌提取物中不同活性成分與降血脂作用相關性各不相同，不存在顯著性差異（P＞0.05）。IHT與降血脂作用之間的相關性相對較好（r=0.910，P=0.254），其次是多酚、黃酮及多糖，而蛋白質相關性較差（r=0.218，P=0.426）。此統(tǒng)計學結果進一步證明三萜類化合物、多酚、黃酮及多糖都對膽酸鹽有結合能力，具有降血脂效果，而蛋白質的降血脂效果不明顯，粗毛纖孔菌提取物中IHT起主要降血脂效果。Yuan等[22]研究表明三萜類物質與降血脂作用具有相關性，因此本研究選用IHT為研究對象，討論不同提取技術的制備及對其降血脂作用的影響。

2.4 不同提取技術對IHT提取率的影響

圖2 不同提取技術對IHT提取率的影響Fig. 2 Effect of different extraction techniques on the extraction efficiency of triterpenoids

由圖2可見，5 種提取技術對IHT化合物提取率影響顯著（P＜0.05），其中高剪切提取技術提取率最大，其值為（3.33±0.02）%，其次是雙水相技術、超聲波技術和半仿生技術，而溶劑回流技術提取率最低，其值僅為（1.26±0.05）%。可以看出不同提取技術對IHT的提取因原理不同效果存在顯著性差異（P＜0.05），高剪切技術由于轉子高速旋轉產(chǎn)生強烈的剪切力和離心擠壓力等機械作用，使粗毛纖孔菌菌絲體組織細胞發(fā)生變形，細胞壁破裂，加速細胞內IHT溶出，顯著提高了提取效果[23]。而雙水相萃取技術也因菌絲體受分子間氫鍵、電荷相互作用、界面性質等多種作用的影響下，使IHT能快速從濃度差異較大的兩相間分離出來，實現(xiàn)增大提取率的目的[24]。

2.5 提取技術對IHT與苷氨膽酸鈉結合能力的影響

人體肝臟會合成膽酸類物質，若其在腸道內被其他成分相結合，會加快膽固醇轉化膽酸，降低體內膽固醇含量，在體外通過模擬人體胃腸環(huán)境進行膽酸結合實驗可以初步分析有效成分的降血脂效果。由圖3可見，5 種技術提取的IHT結合苷氨膽酸鈉的能力呈質量濃度依賴性且具有顯著差異性（P＜0.05），在質量濃度低于40 mg/mL時，其結合苷氨膽酸鈉的能力隨著質量濃度的增加而不斷增強，在質量濃度為40 mg/mL時，其對甘氨膽酸鈉的結合量均達到最高值，后期結合能力變化不顯著。當質量濃度為40 mg/mL時，高剪切技術提取的IHT結合苷氨膽酸鈉的能力最強（結合量為（0.668±0.03）μmol/100 mg），降血脂功能最顯著，其次分別為雙水相、超聲波、半仿生、溶劑回流技術。說明高剪切技術能促進IHT的溶出，增強在腸道內與苷氨膽酸鈉結合效率，促進苷氨膽酸鈉在腸肝中的循環(huán)，使肝臟中膽固醇快速轉化為苷氨膽酸鈉，降低體內膽固醇含量，降血脂效果快速顯著[25]。

圖3 不同提取技術IHT與苷氨膽酸鈉結合能力分析Fig. 3 Sodium glycocholate binding ability of triterpenoids obtained by different extraction techniques

2.6 提取技術對IHT與牛磺膽酸鈉結合能力的影響

圖4 不同提取技術IHT結合?；悄懰徕c能力分析Fig. 4 Sodium taurocholate binding ability of triterpenoids obtained by different extraction techniques

?；悄懰徕c是肝內膽固醇衍生而來的物質，其生物合成在保持膽固醇體內平衡的過程中起著重要的作用，同時可在盲腸末端被重吸收從而進入腸肝循環(huán)，導致肝臟大量降解膽固醇，起到降血脂作用。由圖4可見，5 種技術提取的IHT對?；悄懰徕c具有一定的結合能力，其結合量和質量濃度之間呈明顯的劑量效應關系，隨著質量濃度的增加其結合量逐漸上升。不同提取技術IHT對?；悄懰徕c結合量的影響具有顯著性差異（P＜0.05），高剪切技術明顯優(yōu)于其他幾種提取技術，其對?；悄懰徕c的結合量在IHT粗提液質量濃度為50 mg/mL時達到最高，為（0.994±0.02）μmol/100 mg，主要是因為?；悄懰徕c中磺酸基的酸性比膽酸鈉和甘氨膽酸鈉的羧基更強，在高濃度下更容易離子化，且由于高剪切技術使細胞被迅速破碎，大大減小了有效成分的擴散阻力，IHT被快速釋放，結合量明顯增強，降血脂效果明顯[26]。而溶劑回流技術是利用有機溶劑通過加熱回流使菌絲體中的IHT被釋放，提取時間越長，IHT含量損失越大，大大降低提取效率，與?；悄懰徕c的結合量明顯降低，降血脂功能明顯低于其他幾種技術[27]。

2.7 提取技術對IHT與膽酸鈉結合能力的影響

圖5 不同提取技術IHT結合膽酸鈉能力分析Fig. 5 Sodium cholate binding ability of triterpenoids obtained by different extraction techniques

膽酸鈉具有較強的界面活性,能降低油水兩相間的表面張力,促進脂類乳化,同時擴大脂肪和脂肪酶的接觸面,加速脂類的消化，起到降血脂作用。由圖5可見，隨著IHT粗提液質量濃度的不同其對膽酸鈉的結合能力亦不同，結合量隨著IHT粗提液質量濃度增加先增加后下降。5 種技術提取的IHT在質量濃度為40 mg/mL時，均達到最大結合量，當IHT粗提液質量濃度繼續(xù)升高至50 mg/mL時，結合量呈下降趨勢，說明雖然提取方法原理各不相同，但當IHT粗提液質量濃度過高時，都會抑制自身降血脂活性[28]。由圖5還可以看出，不同提取技術下提取IHT對膽酸鈉結合量的影響具有顯著性差異（P＜0.05）。其中高剪切技術提取的IHT對膽酸鈉的結合量最大，達（0.899±0.02）μmol/100 mg?？赡苁怯捎诟呒羟凶饔么龠M了IHT內部結構側鏈的斷裂和官能團的釋放，增大結合效果，有利于膽酸鈉結合，降血脂效果明顯[29]。而超聲波技術由于強烈震動和粉碎作用增強了細胞膜的通透性，使菌絲體中的IHT更易釋放到溶劑中，增大與膽酸鈉的結合量，降血脂作用有一定的提升效果[30]。

2.8 不同提取技術IHT對降血脂作用的影響

以辛伐他汀片為陽性對照，調整經(jīng)過樹脂初步純化的IHT質量濃度均為40 mg/mL時，對不同提取技術IHT的降血脂活性進行評價，結果見表3。

從表3可以看出，在相同干物質含量的基礎上，作為一種降血脂藥物的主要成分，辛伐他汀結合牛磺膽酸鈉、膽酸鈉、甘氨膽酸鈉的能力顯著高于其他5 種技術提取的IHT（P＜0.05）。

表3 不同提取技術IHT降血脂作用Table 3 Effects of different extraction techniques on the hypolipidemic activity of triterpenoids

高剪切、雙水相、超聲波技術提取的IHT對膽酸鈉結合能力無顯著性差異（P＞0.05），但是顯著高于半仿生和溶劑回流法（P＜0.05），其中高剪切提取的IHT結合膽酸鈉能力相對辛伐他汀的吸附率為（27.92±2.47）%。但與其他兩種膽酸鹽的結合量相比，此法結合量僅為（0.47±0.04）μmol/100 mg。Kim等[31]認為這是由于在羥基含量相同時，膽酸鈉比其他兩種鈉鹽疏水性要弱，從而不能更好地通過疏水作用力吸附于其他羥基中，導致5 種提取技術IHT降血脂作用均不明顯。

半仿生、溶劑回流、超聲波技術提取的IHT對苷氨膽酸鈉的結合能力無顯著性差異（P＞0.05），但是顯著低于高剪切、雙水相技術提取的IHT對苷氨膽酸鈉的結合能力（P＜0.05），其中高剪切提取的IHT結合苷氨膽酸鈉能力相對辛伐他汀的吸附率為（36.53±4.93）%。結合量越高，說明其降膽固醇效果越好，降血脂活性越強，因為結合膽酸鹽結合能力越強，膽固醇在肝臟中轉化膽汁酸越快，從而達到降低膽固醇、降脂的目的[32]。 這也證明了高剪切提取技術提取的IHT可以通過結合苷氨膽酸鈉達到降血脂的作用。

超聲波、雙水相、溶劑回流技術提取的IH-TR結合?；悄懰徕c的能力無顯著性差異（P＞0.05）。高剪切提取的IHT結合?；悄懰徕c的能力又顯著的高于其他提取技術（P＜0.05），其相對辛伐他汀的吸附率為（46.33±3.74）%。這可能是由于高剪切力的作用導致IHT結合?；悄懰徕c的官能團充分暴露出來，增大與?；悄懰徕c結合機會，從而使結合速度加快，結合能力增強[33]，降血脂作用明顯。這也初步明了高剪切提取技術提取的IHT結合?；悄懰徕c能力最強，降血脂的作用最好。

3 結 論

本研究結果表明IHT提取及降血脂效果與不同提取技術有關。5 種技術提取IHT均具有體外降血脂作用，但存在顯著性差異，這與IHT含量和結構有關。高剪切技術提取的IHT體外降血脂效果最好，其次是雙水相、超聲波、溶劑回流、半仿生技術。其中高剪切技術IHT提取率最高，為（3.33±0.02）%；粗毛纖孔菌提取物中IHT質量分數(shù)最高，為（37.78±0.57）%。當IHT質量濃度為40 mg/mL時，與?；悄懰徕c的結合量最高，為（1.31±0.09）μmol/100 mg。高剪切技術提取的IHT特征吸收峰最強，使IHT對降血脂活性相關性高，降血脂效果好?？梢姼呒羟屑夹g可以用于IHT的制備及天然新型降血藥物的開發(fā)。但關于不同提取技術對三萜類化合物結構的影響而導致其體外降血脂效果不同的具體機制還需要進一步研究。

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