戴卓睿 毛其芬

胃癌是發(fā)病率最高的消化道惡性腫瘤，手術(shù)是 治療胃癌最有效的治療手段[1]，化療是中晚期胃癌不可缺少的治療手段。5-氟尿嘧啶是目前治療胃癌的一線化療藥物，具有廣譜的抗腫瘤活性。大劑量5-氟尿嘧啶副反應(yīng)大，患者的順應(yīng)性較低[2-4]，因此聯(lián)用一些輔助治療藥物提高胃癌細(xì)胞對(duì)5-氟尿嘧啶的敏感性是提高化療效果并改善患者順應(yīng)性的有效方法。本文探討中藥活性成分二氫青蒿素與5-氟尿嘧啶協(xié)同抗胃癌效應(yīng)的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材 料 RPMI-1640培養(yǎng)基購(gòu)于美國(guó)Gibco（批號(hào)：11875093）。Annexin V-FITC 凋亡檢測(cè)試劑盒（批號(hào)：APOAF）、噻唑藍(lán)（MTT，批號(hào)：M2128）、二氫青蒿素（批號(hào)：D7439）和 5-氟尿嘧啶（批號(hào)：F6627）購(gòu)于美國(guó) Sigma-Aldrich。ATF2抗體（批號(hào)：9226）、磷酸化ATF2抗體（批號(hào)：9221）、Bcl-xl抗體（批號(hào)：2764）、細(xì)胞色素 c抗體（批號(hào)：4280）、caspase-3 抗體（貨號(hào)：9662）和 GAPDH 抗體（批號(hào)：5174）購(gòu)于美國(guó)Cell Signaling公司。增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光底物（ECL）試劑盒（批號(hào)：32106）購(gòu)于美國(guó) Pierce。脂質(zhì)體 2000（批號(hào)：11668019）購(gòu)于美國(guó)Invitrogen。線粒體分離試劑盒（批號(hào)：C3601）購(gòu)于江蘇碧云天。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 人胃癌細(xì)胞系BGC-823購(gòu)于美國(guó)模式培養(yǎng)物典藏所（ATCC）。細(xì)胞培養(yǎng)在含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中，培養(yǎng)環(huán)境為37°C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)并通入5%CO2。

1.3 ATF2質(zhì)粒構(gòu)建和轉(zhuǎn)染 人ATF2基因的開放閱讀框架序列經(jīng)PCR擴(kuò)增后以分子克隆的方法與pcDNA3.1連接后構(gòu)建成ATF2重組過(guò)表達(dá)質(zhì)粒。ATF2過(guò)表達(dá)質(zhì)粒用脂質(zhì)體2000按試劑操作說(shuō)明書步驟進(jìn)行轉(zhuǎn)染，簡(jiǎn)要步驟如下：將2μg/mL質(zhì)粒用脂質(zhì)體2000進(jìn)行包裹后加入到無(wú)血清培養(yǎng)基進(jìn)行混合。將貼壁的BGC-823細(xì)胞置于該無(wú)血清培養(yǎng)基孵育6h后棄去無(wú)血清培養(yǎng)基并加入新鮮的含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)24h。

1.4 細(xì)胞活力檢測(cè) 將質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后的BGC-823細(xì)胞按5×103/孔接種在96孔板上，分為對(duì)照組、二氫青蒿素組、5-氟尿嘧啶組、5-氟尿嘧啶+二氫青蒿素組和5-氟尿嘧啶+二氫青蒿素+ATF2質(zhì)粒組。對(duì)照組為空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的BGC-823細(xì)胞不加藥物培養(yǎng)48h，5-氟尿嘧啶組為在空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的BGC-823細(xì)胞中加入2μmol/L的5-氟尿嘧啶培養(yǎng)48h，二氫青蒿素組為在空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的BGC-823細(xì)胞中加入10μmol/L的二氫青蒿素培養(yǎng)48h，5-氟尿嘧啶+二氫青蒿素組為在空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的BGC-823細(xì)胞中加入2μmol/L的5-氟尿嘧啶和10μmol/L的二氫青蒿素培養(yǎng)48h，5-氟尿嘧啶+二氫青蒿素+ATF2質(zhì)粒組為在ATF2質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的BGC-823細(xì)胞中加入2μmol/L的5-氟尿嘧啶和10μmol/L的二氫青蒿素培養(yǎng)48h。藥物處理完畢后在BGC-823培養(yǎng)孔中加入20μL 5mg/mL MTT再培養(yǎng)4h，小心吸去上清液，往孔中加入150μL二甲亞砜，充分震蕩后在570nm波長(zhǎng)下用酶標(biāo)儀檢測(cè)OD值，BGC-823細(xì)胞活力抑制率用以下公式計(jì)算：抑制率=（OD對(duì)照組-OD藥物處理組）/OD對(duì)照組×100%。

1.5 細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn) 將質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后的BGC-823細(xì)胞按2×106/孔接種在6孔板上，按上述進(jìn)行分組處理。處理完畢后按照Annexin V-FITC凋亡檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書用Annexin-V對(duì)細(xì)胞進(jìn)行染色孵育20分鐘。之后采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)BGC-823細(xì)胞的凋亡，凋亡率用Annexin-V陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)占總細(xì)胞數(shù)的百分比表示。

1.6 線粒體分離 將質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后的BGC-823細(xì)胞按上述進(jìn)行分組處理，之后收集細(xì)胞，用線粒體分離試劑盒按照說(shuō)明書步驟分離出BGC-823細(xì)胞中的線粒體，留取無(wú)線粒體的細(xì)胞質(zhì)作為樣品進(jìn)行Western blot實(shí)驗(yàn)。

1.7 Western blot實(shí)驗(yàn) 將質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后的BGC-823細(xì)胞按2×106/孔接種在6孔板上，按上述進(jìn)行分組處理。藥物處理完畢后將細(xì)胞用蛋白提取液提取總蛋白質(zhì)。之后將提取的總蛋白質(zhì)用12%的聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行分離。分離完畢后通過(guò)電轉(zhuǎn)方法將蛋白質(zhì)從分離膠上轉(zhuǎn)到醋酸纖維素膜上，用ATF2抗體、磷酸化ATF2抗體、Bcl-xl抗體、細(xì)胞色素c抗體、Caspase-3抗體和GAPDH抗體孵育過(guò)夜，之后再用帶辣根過(guò)氧化物酶的二抗孵育2h，蛋白條帶用ECL試劑盒顯色發(fā)光。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s） 表示并用SPSS14.0統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行處理，組間均數(shù)的比較采用單因素方差分析（oneway ANOVA），P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 二氫青蒿素和5-氟尿嘧啶對(duì)BGC-823細(xì)胞的細(xì)胞活力抑制率和凋亡誘導(dǎo)率的影響 MTT和流式細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，5-氟尿嘧啶+二氫青蒿素組BGC-823細(xì)胞的細(xì)胞活力抑制率和凋亡誘導(dǎo)率均高于5-氟尿嘧啶組和二氫青蒿素組（P＜0.05），轉(zhuǎn)染ATF2質(zhì)粒能顯著降低二氫青蒿素+5-氟尿嘧啶聯(lián)合組的BGC-823細(xì)胞活力抑制率和凋亡誘導(dǎo)率（P＜0.05），見表 1。

2.2 二氫青蒿素和5-氟尿嘧啶對(duì)BGC-823細(xì)胞ATF2表達(dá)水平和磷酸化水平的影響 Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，5-氟尿嘧啶處理對(duì)BGC-823細(xì)胞ATF2的表達(dá)水平無(wú)影響，但能誘導(dǎo)ATF2的磷酸化，二氫青蒿素處理能明顯抑制BGC-823細(xì)胞中ATF2的表達(dá)水平，抑制5-氟尿嘧啶誘導(dǎo)的ATF2蛋白的磷酸化（見圖1）。

表1 二氫青蒿素和5-氟尿嘧啶對(duì)BGC-823細(xì)胞的細(xì)胞活力抑制率和凋亡誘導(dǎo)率的影響（%，x±s）

圖1 二氫青蒿素和5-氟尿嘧啶對(duì)BGC-823細(xì)胞ATF2表達(dá)水平和磷酸化水平的影響

2.3 5-氟尿嘧啶和二氫青蒿素對(duì)BGC-823細(xì)胞Bcl-xl表達(dá)水平及凋亡通路的影響 5-氟尿嘧啶處理能顯著誘導(dǎo)BGC-823細(xì)胞中Bcl-xl的表達(dá)水平，二氫青蒿素+5-氟尿嘧啶處理能明顯抑制5-氟尿嘧啶誘導(dǎo)的Bcl-xl的過(guò)表達(dá)。轉(zhuǎn)染ATF2表達(dá)質(zhì)粒后，二氫青蒿素對(duì)5-氟尿嘧啶依賴的Bcl-xl的抑制作用受到明顯抑制（圖2）。二氫青蒿素+5-氟尿嘧啶能顯著誘導(dǎo)BGC-823細(xì)胞中細(xì)胞色素c從線粒體中釋放到細(xì)胞質(zhì)中，誘導(dǎo)凋亡執(zhí)行分子Caspase-3的活化，轉(zhuǎn)染ATF2質(zhì)粒后，細(xì)胞色素c的釋放和Caspase-3的活化均受到顯著抑制（見圖3）。

3 討論

青蒿素是臨床上非常重要的抗瘧藥。近年研究發(fā)現(xiàn)，青蒿素及其衍生物還具有一定的抗腫瘤作用，其中，二氫青蒿素的生物活性最強(qiáng)。文獻(xiàn)報(bào)道二氫青蒿素能促進(jìn)食管癌細(xì)胞的自噬、凋亡和周期的阻滯[5]，還能抑制胰腺癌組織的血管生成[6]。本研究顯示，二氫青蒿素聯(lián)合處理能顯著提高胃癌細(xì)胞在5-氟尿嘧啶治療下的細(xì)胞活力抑制率和凋亡率（P＜0.05），表明二氫青蒿素能作為一種輔助治療藥物增強(qiáng)5-氟尿嘧啶對(duì)胃癌細(xì)胞的殺傷活性，發(fā)揮對(duì)5-氟尿嘧啶的協(xié)同作用，降低5-氟尿嘧啶的使用劑量。

ATF2是一種轉(zhuǎn)錄因子蛋白，有文獻(xiàn)[7]報(bào)道，腫瘤細(xì)胞在化療藥物的作用下，ATF2會(huì)發(fā)生磷酸化修飾，從而促進(jìn)DNA的修復(fù)并抑制腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡，因此ATF2的過(guò)度磷酸化是導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞發(fā)生化療藥物抵抗的重要機(jī)制。在本研究中，用5-氟尿嘧啶處理后，胃癌細(xì)胞中的ATF2蛋白會(huì)發(fā)生高度磷酸化以抵御5-氟尿嘧啶對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷活性。然而聯(lián)用二氫青蒿素時(shí)，胃癌細(xì)胞中的ATF2蛋白的表達(dá)水平明顯減少，并由此抑制了5-氟尿嘧啶依賴的ATF2的磷酸化，我們推測(cè)這可能是二氫青蒿素對(duì)5-氟尿嘧啶發(fā)揮協(xié)同抗胃癌作用的機(jī)制。為了證明這一結(jié)論，我們?cè)谖赴┘?xì)胞中轉(zhuǎn)染ATF2重組表達(dá)質(zhì)粒使ATF2在胃癌細(xì)胞中強(qiáng)制表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)胃癌細(xì)胞中的ATF2發(fā)生強(qiáng)制表達(dá)后，二氫青蒿素對(duì)5-氟尿嘧啶的協(xié)同作用明顯減弱，證明了ATF2是二氫青蒿素發(fā)揮協(xié)同作用的靶點(diǎn)。

圖2 5-氟尿嘧啶和二氫青蒿素對(duì)BGC-823細(xì)胞Bcl-xl表達(dá)水平的影響

圖3 5-氟尿嘧啶和二氫青蒿素對(duì)BGC-823細(xì)胞凋亡通路的影響

ATF2在發(fā)生磷酸化后，能與c-Jun等轉(zhuǎn)錄因子形成二聚體，該二聚體能誘導(dǎo)Bcl-xl抗凋亡蛋白的表達(dá)，從而抑制腫瘤細(xì)胞發(fā)生線粒體途徑的凋亡[8-9]。在本研究顯示，5-氟尿嘧啶處理的胃癌細(xì)胞高表達(dá)Bcl-xl抗凋亡蛋白，然而二氫青蒿素處理能通過(guò)ATF2途徑抑制5-氟尿嘧啶誘導(dǎo)的Bcl-xl抗凋亡蛋白的表達(dá)。隨后，二氫青蒿素促進(jìn)5-氟尿嘧啶對(duì)線粒體的損傷作用，使之釋放細(xì)胞色素c等凋亡活性物質(zhì)到細(xì)胞質(zhì)中，誘導(dǎo)Caspase-3發(fā)生活化，最終導(dǎo)致凋亡的發(fā)生。

綜上所述，本研究結(jié)果顯示二氫青蒿素能通過(guò)抑制ATF2的磷酸化提高胃癌細(xì)胞對(duì)5-氟尿嘧啶的敏感性。

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