連優(yōu)優(yōu) 葉菲菲 呂偉旗 蘭海娟

槐花系豆科植物槐Sophora japonica L.的干燥花，味苦，微寒，歸肝、大腸經(jīng)，具有涼血止血，清肝瀉火等功效，用于便血、痔血、血痢、崩漏、吐血、衄血、肝熱目赤、頭痛眩暈等癥[1-3]?；瘜W(xué)與藥理學(xué)研究[4-9]表明，槐花含有黃酮苷、脂肪酸、揮發(fā)油、氨基酸、糖類等多種藥效成分，具有降血壓[10]、擴張冠狀動脈[11]、抗氧化[12]、抗菌[13]、抗病毒[14]、止血[15]等多種作用?；被ㄔ谖覈媳备鞯貐^(qū)廣泛栽培，分布較廣，其中以華北和黃土高原地區(qū)尤為多見，因栽培地南北跨度大，不同地區(qū)栽培的槐花在物候期、農(nóng)藝性狀、藥效成分含量等方面存在差異?？傸S酮、蘆丁是2015年版《中國藥典》規(guī)定的槐花藥材含量測定指標，筆者收集了陜西、河南、甘肅、浙江等9省24個產(chǎn)地槐花藥材，采用紫外分光光度法與HPLC法測定樣品總黃酮、蘆丁、槲皮素、山柰酚含量，并分析了經(jīng)緯度、海拔與藥效成分間的相關(guān)性，以期為槐花藥材高效優(yōu)質(zhì)栽培與優(yōu)良品種選育提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 UV-9000S型紫外可見分光光度計（上海元析儀器有限公司）；600-2998型高效液相色譜儀（美國Waters公司）；Milli-Q Academic超純水儀（美國Millipore公司）；DGG-9070電熱恒溫鼓風(fēng)干燥器（上海森信試驗儀器有限公司）；FA2004型電子分析天平（上海恒平精密電子儀器有限公司）；JKWB-2A數(shù)顯恒溫水浴鍋（上海精學(xué)科學(xué)儀器有限公司）；RE-2000E旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）；KQ5200DE型數(shù)控超聲清洗儀(昆山超聲儀器有限公司)；FW135型中藥粉碎機（上海隆拓儀器設(shè)備有限公司）。

蘆丁對照品（Rutin，純度>98%，上海源葉生物科技有限公司，批號：B20771）；槲皮素對照品（Quercetin：純度>98%，上海源葉生物科技有限公司，批號B20527）；山柰酚（Kaempferol：純度>98%，上海源葉生物科技有限公司，批號B21126）；甲醇（色譜級，純度>99.9%，國藥集團化學(xué)試劑有限公司，批號400642922）；甲醇、乙醚（國藥集團化學(xué)試劑有限公司）；水為去離子水，其它試劑均為分析純。供試藥材2016年7月—2016年9月采自陜西、安徽、河南、浙江、湖北等不同產(chǎn)地，經(jīng)麗水市人民醫(yī)院蘭海娟副主任藥師鑒定為豆科植物槐Sophora japonica L.的花，見表1。

表1 供試不同產(chǎn)地槐花藥材統(tǒng)計

1.2 總黃酮含量測定

1.2.1 標準曲線的繪制 精密稱取蘆丁對照品25mg，置25mL容量瓶中，甲醇定容至刻度。精密量取20mL，置100mL容量瓶中，加水至刻度，搖勻，即得濃度為0.20mg/mL的對照品溶液。精密量取對照品溶液 0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0mL，置 25mL 容量瓶中，加水補足至6mL，加5%亞硝酸鈉溶液1mL，混勻，靜置6min，加10%硝酸鋁溶液1mL，混勻，靜置6min，加氫氧化鈉溶液10mL，加水至刻度，搖勻，靜置15min，以相應(yīng)甲醇試劑為空白，在500nm波長下測定吸光度，以吸光度為縱坐標，濃度為橫坐標，繪制標準曲線，見表2。

1.2.2 總黃酮含量測定 按照2015年版《中國藥典》方法[1]提取樣品總黃酮，按照“1.2.1”項“加水補足至6mL”起，測定吸光度，按照標準曲線方程計算樣品中總黃酮含量。

1.3 蘆丁、槲皮素、山柰酚含量測定

1.3.1 色譜條件與系統(tǒng)適應(yīng)性試驗 色譜柱Waters Xbridge C18（4.6mm×250mm，5μm）；流動相為甲醇A:0.1%乙酸水 B，梯度洗脫（V/V：0～10min，20:80；10～13.5min，45:55；13.5 ～30min，45:55；30 ～32min，60:40；32～45min，20:80）；流速：1.0mL/min；檢測波長：360 nm；柱溫：30℃；進樣量：20μL。

1.3.2 混合對照品溶液的制備 分別精密稱取蘆丁、槲皮素、山柰酚對照品溶液32.6mg、10.6mg、8.0mg置50mL容量瓶，配制成蘆丁、槲皮素、山柰酚濃度為 652μg/mL、212μg/mL、160μg/mL 的單一對照品溶液，取蘆丁對照品溶液25mL、槲皮素對照品溶液5mL、山柰酚對照品溶液2mL于50mL容量瓶，甲醇定容至刻度，配制成每1mL含蘆丁326μg/mL、槲皮素21.2μg/mL、山柰酚6.4μg/mL的混合對照品溶液。

1.3.3 供試品溶液的制備 精密稱取樣品粉末0.1g，置帶塞錐形瓶中，精密加入95%甲醇50mL，稱定重量，25℃下超聲提?。üβ?50W，頻率25kHz）30min，放冷，補足差重，搖勻過濾。精密吸取濾液2mL于10mL容量瓶中，95%甲醇定容至刻度，即得供試品溶液。

1.3.4 線性關(guān)系考察 精密吸取混合對照品溶液0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0mL 于 10mL 容量瓶中，甲醇定容至刻度，在“1.3.1”色譜條件下測定蘆丁、槲皮素、山柰酚峰面積，以峰面積Y為縱坐標，質(zhì)量濃度X為橫坐標，繪制標準曲線，本試驗蘆丁、槲皮素、山柰酚標準曲線方程見表2。

1.3.5 樣品含量測定 取適量供試品溶液，過0.45μm微孔濾膜，在“1.3.1”色譜條件下測定蘆丁、槲皮素、山柰酚峰面積，按“1.3.4”標準曲線換算含量，試驗重復(fù)3次。

1.3.6 穩(wěn)定性試驗 隨機取S14樣品，室溫條件下按“1.3.3”方法制備供試品溶液，按“1.3.1”色譜條件下分別于 0、2、4、6、8、10、12、24h 進樣，測得 S14 樣品蘆丁、槲皮素、山柰酚峰面積RSD值分別為0.68%、1.44%、0.92%，表明供試品溶液在室溫下24h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

1.3.7 精密度試驗 取混合對照品溶液，按“1.3.1”色譜條件下連續(xù)進樣6次，測得混合對照品溶液蘆丁、槲皮素、山柰酚峰面積RSD值分別為0.24%、0.32%、0.55%，表明儀器精密度良好。

1.3.8 重復(fù)性試驗 隨機取S7樣品6份，室溫條件下按“1.3.3”方法制備供試品溶液，按“1.3.1”色譜條件下測定蘆丁、槲皮素、山柰酚含量，得該樣品蘆丁、槲皮素、山柰酚平均含量為6.58%、1.24%、0.1647%，RSD值分別為1.10%、1.39%、1.65%，表明本試驗方法重復(fù)性良好。

1.3.9 加樣回收率試驗 取已知含量的S3樣品，加入適量蘆丁、槲皮素、山柰酚對照品，按“1.3.3”方法制備供試品溶液，按“1.3.1”色譜條件測定蘆丁、槲皮素、山柰酚含量，計算加樣回收率（%）=（C-A）/B×100%，A為該樣品中待測成分含量，B為待測成分加入對照品含量，C為實際測得量，6次重復(fù)，蘆丁、槲皮素、山柰酚平均加樣回收率與RSD值詳見表3。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS17.0、DPS7.05軟件處理數(shù)據(jù)，采用單因素ANOVA分析，聚類分析采用加權(quán)配對算術(shù)平均法（WPGMA）。

表2 槐花主要藥效成分標準曲線方程

2 結(jié)果與分析

2.1 槐花藥效成分含量HPLC法優(yōu)化 分別對蘆丁、槲皮素、山柰酚色譜峰進行吸收光譜全波長掃描，結(jié)果發(fā)現(xiàn)蘆丁在257nm與356nm處，槲皮素在254nm與370nm處，山柰酚在265nm與367nm處有較強吸收值，綜合選擇360nm作為槐花蘆丁、槲皮素、山柰酚含量檢測波長。在現(xiàn)有研究[1，4，16-18]基礎(chǔ)上，對槐花蘆丁、槲皮素、山柰酚提取工藝進行了優(yōu)化，分別考察了甲醇濃度為85%、90%、95%、100%，提取時間為 20、30、40min，提取溫度 20、25、30、35℃對蘆丁、槲皮素、山柰酚提取含量的影響，結(jié)果表明，用95%甲醇，25℃超聲（功率 250W，頻率 25kHz）提取30min即可提取完全，本方法操作簡便、快捷，所得供試品溶液中雜質(zhì)含量低，不干擾藥效成分的檢測。同時，比較了HPLC流動相甲醇——水、甲醇——0.1%乙酸水、甲醇——0.3%磷酸水及流動相比例，發(fā)現(xiàn)在色譜柱Waters Xbridge C18（4.6mm×250mm，5μm），流動相為甲醇A:0.1%乙酸水B，梯度洗脫（V/V：0～10min，20:80；10 ～13.5min，45:55；13.5 ～30min，45:55；30～32min，60:40；32～45min，20:80），流速為 1.0mL/min，柱溫為30℃，進樣量為20μL的色譜條件下洗脫效果較好，蘆丁、槲皮素、山柰酚理論塔板數(shù)均大于2500，分離度大于1.5，色譜圖見圖1。

2.2 不同產(chǎn)地槐花藥效成分含量比較 供試24個產(chǎn)地間槐花總黃酮、蘆丁、槲皮素、山柰酚含量差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），見表4。供試樣品平均總黃酮、蘆丁、槲皮素、山柰酚含量分別為10.50%、7.92%、1.33%、0.1385%，其中甘肅渭源樣品總黃酮、蘆丁、槲皮素、山柰酚含量均最高，分別為13.24%、9.84%、1.68%、0.1658%，浙江臨安總黃酮與山柰酚含量、安徽岳西蘆丁含量、河南鞏義槲皮素含量最低，分別為8.31%、0.1047%、6.25%、1.04%。供試槐花樣品總黃酮、蘆丁含量均滿足2015年版《中國藥典》不低于8.0%、6.0%的標準。從藥效成分含量看，供試9省24個產(chǎn)地槐花藥材品質(zhì)較好，遺傳多樣性豐富，為槐花良種選育奠定了基礎(chǔ)。

2.3 相關(guān)性分析 產(chǎn)地的環(huán)境因子對中藥材藥效成分含量積累具有一定的影響，包括海拔、溫度、經(jīng)緯度、光照等[19]。本試驗分析顯示，槐花產(chǎn)地海拔、經(jīng)緯度與藥效成分含量存在相關(guān)性，經(jīng)度與槐花藥效成分含量呈負相關(guān)關(guān)系，海拔、緯度與槐花藥效成分含量呈正相關(guān)關(guān)系；其中緯度與總黃酮、蘆丁含量間相關(guān)性較大，相關(guān)系數(shù)分別達到0.7432、0.6769，海拔與槲皮素、山柰酚含量間相關(guān)性較大，相關(guān)系數(shù)分別達0.6583、0.4295，詳見表5。槐花藥效成分相關(guān)性分析顯示，高海拔、低經(jīng)度、高緯度地區(qū)栽培槐花有利于總黃酮、蘆丁、槲皮素、山柰酚含量積累。

表3 蘆丁、槲皮素、山柰酚加樣回收率試驗（n=6）

圖1 高效液相色譜圖

表4 不同產(chǎn)地槐花藥效成分比較（%）

表5 槐花藥效成分含量相關(guān)性分析

2.4 聚類分析 以總黃酮、蘆丁、槲皮素、山柰酚含量為參考指標，對24個產(chǎn)地槐花樣品進行聚類分析，根據(jù)歐式距離D2=2.24將供試樣品分成3大類（圖2）。第Ⅰ大類共9個樣品，分別為陜西周至、陜西藍田、河南滎陽、河南登封、湖北恩施、江西玉山、江西婺源、湖北孝昌、寧夏同心，該類群槐花以陜西、河南、江西、湖北樣品為主，藥效成分含量較高；第Ⅱ大類共5個樣品，分別為陜西柞水、甘肅會寧、甘肅景泰、寧夏靖遠、甘肅渭源，該類群槐花以甘肅樣品為代表，樣品藥效成分含量最高；第Ⅲ大類10個樣品，分別為河南鞏義、浙江三門、安徽潛山、浙江武義、浙江縉云、浙江余姚、浙江遂昌、安徽岳西、浙江臨安、福建浦城，該類群槐花以浙江、安徽樣品為代表，樣品藥效成分較低。

圖2 槐花聚類分析圖

3 討論

槐花是我國傳統(tǒng)民間用藥，具有顯著的清肝瀉火、清熱涼血功效，已被廣泛應(yīng)用于臨床實踐。同時，槐花含有蛋白質(zhì)、氨基酸、微量元素等多種營養(yǎng)成分，具有重要的食療應(yīng)用價值。但是由于槐花資源分布廣，藥材質(zhì)量差異大，導(dǎo)致市場上槐花藥材良莠不齊，行業(yè)缺乏藥材統(tǒng)一質(zhì)量評價標準，影響槐花產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展。本試驗收集我國槐花主分布區(qū)藥材資源，對其進行質(zhì)量評價，并分析經(jīng)緯度、海拔與藥效成分間相關(guān)性，對篩選槐花優(yōu)良種質(zhì)，高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)栽培等研究均有重要意義。本試驗考察了溶劑濃度、提取時間、提取溫度、檢測波長、流動相比例等槐花藥效成分提取與檢測工藝，優(yōu)化了槐花蘆丁、槲皮素、山柰酚含量測定HPLC方法，該方法操作簡便、檢測準確、重復(fù)性好，可用于槐花藥材質(zhì)量評價。

藥用植物在長期適應(yīng)環(huán)境的過程中，通過調(diào)控次生代謝產(chǎn)物的積累，抵抗害蟲、物理、化學(xué)等生物性與非生物性環(huán)境因子脅迫，其生物學(xué)性狀、生態(tài)適應(yīng)性、農(nóng)藝性狀、藥效成分等受自身遺傳與環(huán)境因子雙重影響，種源、經(jīng)緯度、海拔、氣候條件等環(huán)境因子是影響中藥材生長與藥效成分含量積累的重要因素[20-21]。本試驗結(jié)果表明，我國槐花產(chǎn)區(qū)栽培槐花藥材中藥效成分含量均符合2015年版《中國藥典》中總黃酮、蘆丁含量不低于8.0%、6.0%的標準；24個產(chǎn)地槐花中總黃酮、蘆丁、槲皮素、山柰酚含量均存在顯著差異（P＜0.01），甘肅、陜西、寧夏產(chǎn)槐花中藥效成分含量較高，浙江、安徽產(chǎn)槐花中藥效成分含量較低；經(jīng)度與槐花藥效成分含量呈負相關(guān)關(guān)系，海拔、緯度與槐花藥效成分含量呈正相關(guān)關(guān)系；槐花分布地域廣，本試驗收集了24個產(chǎn)地種質(zhì)資源，其中如福建種質(zhì)，僅收集到1個樣品，代表性弱，后續(xù)工作將加強對福建、河北、重慶等地槐花的種質(zhì)資源收集。從本試驗收集的24個產(chǎn)地槐花藥效成分含量看，高海拔、低經(jīng)度、高緯度地區(qū)種植槐花有利于藥效成分含量積累，槐花優(yōu)良種質(zhì)篩選可優(yōu)先考慮甘肅、陜西與寧夏種質(zhì)。

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