楊舟鑫 郭冬陽(yáng) 蔡國(guó)龍

據(jù)統(tǒng)計(jì)，每年全球新增數(shù)百萬(wàn)膿毒癥（sepsis）患者，其中超過(guò)1/4患者死亡[1]。膿毒癥發(fā)病與機(jī)體多系統(tǒng)、多器官病理生理改變密切相關(guān)，多種因素共同導(dǎo)致膿毒癥的發(fā)生發(fā)展。內(nèi)皮細(xì)胞是膿毒癥發(fā)展中的重要的效應(yīng)細(xì)胞。內(nèi)皮細(xì)胞本身的損傷以及內(nèi)皮細(xì)胞功能異常，如血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）的分泌和血管生成素（angiopoietin，Ang）的變化，是膿毒癥發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一[2-3]。中藥大黃具有攻積滯、清濕熱、瀉火、涼血、祛瘀、解毒等功效，能夠促進(jìn)胃腸蠕動(dòng)、保護(hù)腸道黏膜、促進(jìn)內(nèi)毒素排出、減少細(xì)菌及毒素移位及抗炎抑菌，在膿毒癥治療中可能有良好的應(yīng)用前景[4]。脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）是革蘭氏陰性菌表面的糖蛋白，可以被細(xì)胞表面模式識(shí)別受體識(shí)別，繼而引發(fā)多種細(xì)胞的炎癥反應(yīng)[5]，在膿毒癥的發(fā)病過(guò)程中起到了重要的作用。本研究以脂多糖誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞為細(xì)胞模型，研究大黃提取物（rhubarb extract）對(duì)膿毒癥內(nèi)皮細(xì)胞的保護(hù)作用，并初步探索其中的機(jī)制。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 細(xì)胞來(lái)源 臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞購(gòu)自江陰雨汐生物科技有限公司。

1.2 藥品及試劑 大黃提取物（批號(hào)E106692）購(gòu)自上海阿拉丁公司；DMEM培養(yǎng)基（批號(hào)1552510）和胎牛血清（批號(hào)10099-141）購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；脂多糖（批號(hào)L2630）為美國(guó)Sigma公司產(chǎn)品；CCK-8細(xì)胞增殖及細(xì)胞毒性檢測(cè)試劑（批號(hào)C0037）購(gòu)自中國(guó)碧云天公司，Trizol（批號(hào)H10318）和Real-time PCR試劑盒（批號(hào)AQ131-01）為中國(guó)全式金公司產(chǎn)品，Ang1（批號(hào) HM10638）和 Ang2（批號(hào) HM11076）的ELISA試劑盒為中國(guó)Bio-Swamp產(chǎn)品，VEGF ELISA試劑盒（批號(hào)EHC108.48）為欣博盛公司產(chǎn)品，p65（批號(hào) AF0874），p-p65（批號(hào) AF2006）和 ERK 抗體（批號(hào)AF0155）為美國(guó)Affinity公司產(chǎn)品，p-ERK（批號(hào)ab214362）和β-actin（批號(hào)ab8227）為美國(guó)Abcam公司產(chǎn)品。

1.3 儀 器 CO2培養(yǎng)箱購(gòu)自SANYO公司（型號(hào)XD-101），酶標(biāo)儀（型號(hào)RT-6000）購(gòu)自深圳雷杜生命科學(xué)股份有限公司，倒置相差顯微鏡（型號(hào)IX51）購(gòu)自日本OLYMPUS公司，定量PCR儀（型號(hào)X226488N） 購(gòu)自德國(guó) Eppendorf公司，Trans-Blot Turbo全能型蛋白轉(zhuǎn)印系統(tǒng)（型號(hào)170-4150）購(gòu)自美國(guó)Bio-rad公司，凝膠成像系統(tǒng)（型號(hào)G：BOXChemi XR5）購(gòu)自SYNGENE公司。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的傳代培養(yǎng) 臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVEC）達(dá)到80%以上時(shí)，棄去培養(yǎng)基，用PBS緩沖液沖洗，加入0.25%胰蛋白酶（含 EDTA）消化約1min（37℃）。當(dāng)?shù)怪蔑@微鏡觀察到細(xì)胞皺縮、彼此分離時(shí)，加入相當(dāng)于胰酶體積10%的胎牛血清終止消化，用吸管反復(fù)吹打瓶壁制成細(xì)胞懸液，1000rpm離心5min，棄上清。加入到含 10%胎牛血清、ECGS（30μg/mL）、EGF（10ng/mL）、青霉素（100U/mL）和鏈霉素（100U/mL）的DMEM培養(yǎng)基重懸細(xì)胞。HUVEC細(xì)胞按照1:3的比例傳代擴(kuò)增。

2.2 CCK-8法細(xì)胞增殖檢測(cè) 培養(yǎng)細(xì)胞達(dá)對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，細(xì)胞達(dá)到80%融合度時(shí)，用0.25%胰酶（含EDTA）消化細(xì)胞，收集細(xì)胞，1000rpm離心5min。離心后棄上層培養(yǎng)基，加入4mL新鮮培養(yǎng)基，吹打混勻。細(xì)胞計(jì)數(shù)，調(diào)節(jié)細(xì)胞密度至1000個(gè)/100μL。取96孔板，加入細(xì)胞懸液，每孔100μL。放入細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)過(guò)夜（16～24h）。LPS 處理組加入 LPS（1μg/mL），大黃提取物處理組加入LPS（1μg/mL）和大黃提取物（1、2.5、5、10、20、40μg/mL）。取出 96 孔板，棄去細(xì)胞上層培養(yǎng)基，每孔加入100μL新鮮培養(yǎng)基，再每孔加入 10μL CCK8，37℃孵育 4h。用酶標(biāo)儀測(cè)定在450nm處的吸光度。

2.3 RNA提取 HUVEC以1×105/孔的密度種于6孔板中，細(xì)胞貼壁24h后LPS處理組加入LPS（1μg/mL），大黃提取物處理組加入LPS（1μg/mL）和大黃提取物（5μg/mL）。LPS刺激的 24h后，收集細(xì)胞。加入1mL的Trizol，移入無(wú)RNA酶的EP管中，劇烈震蕩5min；加入氯仿（200μL），用力震蕩，室溫靜置 5min。12 000g 4℃離心15min，吸取無(wú)色上清液轉(zhuǎn)移至另一新的1.5mL離心管中。向上清中加入等體積的異丙醇，上下顛倒離心管充分混勻后，在室溫靜置10min。12 000g 4℃離心10min，小心徹底棄去上清，加入70%的乙醇1mL，輕輕上下顛倒洗滌離心管，至沉淀塊漂浮后，12 000g 4℃離心5min，小心棄去乙醇。室溫晾干沉淀2～5min，加入20μL RNA溶解液溶解沉淀，用移液槍輕輕吹打沉淀后，放冰上溶解30min左右。

2.4 RNA逆轉(zhuǎn)錄 按說(shuō)明書(shū)配置20μL逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系，反應(yīng)條件為42℃，30min。配置20μL熒光定量PCR反應(yīng)體系，使用55℃的退火溫度反應(yīng)40個(gè)循環(huán)。以β-actin為內(nèi)參，分析目的基因的相對(duì)表達(dá)量。擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性通過(guò)繪制融解曲線來(lái)進(jìn)行驗(yàn)證。用于實(shí)時(shí)定量PCR的引物如下：Ang1正向引物：5’-AGCTGACAGATGTTGAGACC-3’;Ang1 反向引物：5’-GTCCAACTCTTCCTTGTGTT-3’;Ang2 正向引物：5’-TAGACAAGCTGCGTAGAGAG-3’;Ang2反向引物：5’-GTCTGTGGCTGAGATGAACT-3’;β-actin 正向引物：5’-GATGAGATTGGCATGGCTTT-3’;β-actin 反向引物：5’-GTCACCTTCACCGTTCCAGT-3’。

2.5 蛋白質(zhì)免疫印跡（Western Blot，WB）檢測(cè)蛋白表達(dá) ERK、p-ERK、p65和p-p65蛋白的變化通過(guò)WB法檢測(cè)。主要步驟如下：細(xì)胞處理方法同2.3。使用細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞，4℃下12 000rpm離心15min，將離心后的上清加入上樣緩沖液，混合后于100℃處理5min，每孔上樣100μg細(xì)胞總蛋白，在電泳槽電泳。將膠小心地鋪在濾紙上，表面再覆蓋大小合適的聚偏二氟乙烯膜，后再覆蓋兩層濕潤(rùn)濾紙，在轉(zhuǎn)膜槽轉(zhuǎn)膜，轉(zhuǎn)膜過(guò)程在4℃進(jìn)行，采用100V/100mA。采用封閉液封閉；封閉時(shí)間為室溫下2h，在搖床上進(jìn)行。在一個(gè)5mL的EP管中加入2mL的封閉液，再加入適量的一抗，置于4℃冰箱中過(guò)夜。一抗比例1:5000。將過(guò)夜雜交的膜從塑料袋中取出，投入含有足量體積緩沖液的洗膜盒中，于搖床上清洗，每次10min，連續(xù)3次。處理步驟類似一抗雜交步驟，不同之處在于二抗雜交可在常溫下，1h內(nèi)完成。二抗比例1:5000。將過(guò)夜雜交的膜從塑料袋中取出，投入含有足量緩沖液的洗膜盒中，于搖床上清洗，每次10min，連續(xù)3次。將膜平放于干燥的平面上，將新鮮配置好的化學(xué)發(fā)光試劑滴加到有鉛筆記號(hào)標(biāo)注的膜面上，反應(yīng)5min后用濾紙?jiān)谀さ倪吘壉M量吸去多余的化學(xué)發(fā)光試劑，將膜放到暗盒中收集信號(hào)。

2.6 酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）檢測(cè)Ang1、Ang2和VEGF的濃度 吸取用于提取2.3或2.5的細(xì)胞培養(yǎng)上清，凍存于-80℃冰箱。簡(jiǎn)要操作步驟如下：在酶標(biāo)包被板上設(shè)標(biāo)準(zhǔn)品孔，依次加入說(shuō)明書(shū)中規(guī)定的濃度的標(biāo)準(zhǔn)品50μL。分別設(shè)空白孔和待測(cè)樣品孔。在酶標(biāo)包被板上待測(cè)樣品孔中先加入樣品40μL，然后再加生物素標(biāo)記的抗體10μL。用封板膜封板后置于37℃溫育30min。棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置30s后棄去,如此反復(fù)5次，拍干。每孔加酶標(biāo)試劑50μL，空白孔除外。溫育、洗滌，每孔先加入顯色劑A 50μL，然后加入顯色劑B 50μL，輕輕混勻，37℃避光顯色15min。每孔加入終止液50μL，終止反應(yīng)。以空白孔調(diào)零，450nm波長(zhǎng)依序測(cè)量各孔的吸光度值。

2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)為單次實(shí)驗(yàn)結(jié)果。數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s） 表示，應(yīng)用prism5.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 大黃素保護(hù)脂多糖誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞活力下降向臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的培養(yǎng)體系中加入1μg/mL的LPS可以降低臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的增殖（P＜0.01）。與LPS刺激組比較，5μg/mL以上的大黃提取物對(duì)HUVEC增殖的保護(hù)作用均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。當(dāng)大黃提取物濃度達(dá)到5μg/mL時(shí)，細(xì)胞的增殖率趨于平穩(wěn)。5、10、20、40μg/mL 大黃提取物組間吸光度值比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。據(jù)此確定本實(shí)驗(yàn)使用的大黃提取物濃度為5μg/mL。見(jiàn)表1。

表1 各組HUVEC細(xì)胞體外增殖比較

3.2 大黃提取物調(diào)節(jié)脂多糖誘導(dǎo)VEGF 脂多糖可上調(diào)HUVEC的VEGF分泌（P＜0.01）；加入大黃提取物（5μg/mL）后，VEGF分泌相對(duì)于LPS誘導(dǎo)后有明顯下降（P＜0.01），見(jiàn)表 2。

表2 各組HUVEC細(xì)胞VEGF、Ang1和Ang2分泌比較（pg/mL）

3.3 大黃提取物調(diào)節(jié)脂多糖誘導(dǎo)HUVEC分泌Ang1/2作用 脂多糖處理后，HUVEC的Ang1分泌減少，Ang2分泌增加（P＜0.01）；LPS誘導(dǎo)的 HUVEC經(jīng)大黃提取物（5μg/mL）處理后，Ang1分泌增加（P＜0.05），Ang2分泌減少（P＜0.05）。定量 PCR 結(jié)果也顯示，大黃提取物上調(diào)Ang1基因表達(dá)（P＜0.01），下調(diào)Ang2基因表達(dá)（P＜0.05）。見(jiàn)表 3。

表3 各組HUVEC細(xì)胞Ang1和Ang2 mRNA表達(dá)比較

3.4 大黃提取物對(duì)脂多糖誘導(dǎo)的HUVEC ERK和p65磷酸化調(diào)節(jié)作用 大黃提取物（5μg/mL）處理后未檢測(cè)到ERK明顯變化，但p-ERK明顯下降。同樣p65變化不大，而p-p65明顯下降。說(shuō)明大黃提取物明顯降低NF-κB信號(hào)通路和ERK信號(hào)通路的活化，見(jiàn)圖1。

4 討論

在脂多糖處理后，臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞增殖下降，分泌 VEGF 增加，下調(diào) Ang1 并上調(diào) Ang2（P＜0.01），這些變化與膿毒癥發(fā)病過(guò)程中類似。而使用大黃提取物處理后，HUVEC的增殖能力有所恢復(fù)，同時(shí)VEGF分泌下降，Ang1上升且 Ang2下降（P＜0.05，P＜0.01）。同時(shí)NF-κB信號(hào)通路和ERK信號(hào)通路的激活也可以被大黃提取物所抑制。這些結(jié)果提示，大黃提取物可以保護(hù)膿毒癥內(nèi)皮細(xì)胞。

大黃提取物對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞活力保護(hù)，提示其可以促進(jìn)膿毒癥中內(nèi)皮細(xì)胞的存活，保護(hù)膿毒癥內(nèi)皮的完整性。VEGF是內(nèi)皮細(xì)胞通透性的關(guān)鍵性的調(diào)節(jié)因子[6]，因此大黃提取物下調(diào)HUVEC分泌VEGF的作用，則與膿毒癥內(nèi)皮細(xì)胞通透性保護(hù)密切相關(guān)。因此大黃可以從促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞存活和維持內(nèi)皮通透性兩個(gè)方面保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞。

血管生成素平衡的破壞是膿毒癥內(nèi)皮損傷的重要因素[2]。Ang1可以和內(nèi)皮細(xì)胞膜上的Tie2受體特異性結(jié)合，引起其受體磷酸化和隨后的信號(hào)傳遞。Ang1可以抑制內(nèi)皮細(xì)胞凋亡、促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞生存，并可以穩(wěn)定血管，防止?jié)B漏；而Ang2的主要功能是競(jìng)爭(zhēng)性抑制Ang1形成不穩(wěn)定的血管[7]。因此大黃上調(diào)Ang1，抑制Ang2的作用可以保護(hù)血管，可能在膿毒癥內(nèi)皮保護(hù)中起到重要作用。

NF-κB和ERK信號(hào)通路對(duì)于膿毒癥發(fā)生發(fā)展具有重要意義。在LPS等刺激下，p65和ERK發(fā)生磷酸化，并從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)入細(xì)胞核，從而啟動(dòng)炎性細(xì)胞因子、炎性因子、趨化因子等基因轉(zhuǎn)錄[8-9]。NF-κB p65和ERK可以調(diào)控細(xì)胞活力、VEGF分泌和Ang1/2平衡[10-11]，因此大黃提取物對(duì)膿毒癥內(nèi)皮細(xì)胞的保護(hù)作用可能是作用于NF-κB和ERK信號(hào)通路實(shí)現(xiàn)。

總之，大黃提取物可以保護(hù)LPS誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞存活，抑制VEGF分泌，維持Ang1/2的平衡。這些保護(hù)作用可能是通過(guò)調(diào)節(jié)NF-κB和ERK信號(hào)通路實(shí)現(xiàn)。本項(xiàng)研究的結(jié)果提示，大黃可以保護(hù)膿毒癥內(nèi)皮穩(wěn)定性，為大黃提取物在膿毒癥的應(yīng)用提供進(jìn)一步的理論依據(jù)。

圖1 大黃提取物抑制脂多糖誘導(dǎo)的HUVEC的ERK和p65磷酸化（A：LPS+HUVEC；B：LPS+HUVEC+大黃提取物）

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