涂明，胡少博，鄭偉明

（溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 神經(jīng)外科，浙江 溫州 325015）

希佩爾-林道（von Hippel-Lindau，VHL）病是一種常染色體顯性遺傳的多器官腫瘤綜合征。VHL病的表現(xiàn)包括中樞神經(jīng)系統(tǒng)和視網(wǎng)膜的血管母細(xì)胞瘤、腎癌及腎囊腫、胰腺神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤和胰腺囊腫、內(nèi)淋巴囊腫瘤、嗜鉻細(xì)胞瘤、附睪腫瘤、闊韌帶腫瘤[1]。VHL病的發(fā)病率為萬分之二至萬分之三，中樞神經(jīng)系統(tǒng)血管母細(xì)胞瘤往往是最常見以及最早出現(xiàn)的臨床表現(xiàn)[2]。

中樞神經(jīng)系統(tǒng)血管母細(xì)胞瘤是一種由毛細(xì)血管和腫瘤細(xì)胞組成的良性腫瘤，通常位于后顱窩，尤其是小腦。腦內(nèi)血管母細(xì)胞瘤通常表現(xiàn)為囊性或?qū)嵭阅[瘤，其中有20%～30%是由VHL病引起的[3]。小腦血管母細(xì)胞瘤占所有中樞神經(jīng)系統(tǒng)血管母細(xì)胞瘤病例的16%～69%[4]。由于VHL病所致的血管母細(xì)胞瘤高復(fù)發(fā)率和多系統(tǒng)并發(fā)癥，對(duì)VHL相關(guān)小腦血管母細(xì)胞瘤患者的長(zhǎng)期治療與管理相當(dāng)困難。本研究通過對(duì)比散發(fā)性血管母細(xì)胞瘤與VHL相關(guān)小腦血管母細(xì)胞瘤手術(shù)的預(yù)后情況，探討兩者長(zhǎng)期預(yù)后差異。

1 資料和方法

1.1 一般資料 收集1990年2月至2013年6月于溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院進(jìn)行手術(shù)切除的VHL相關(guān)小腦血管母細(xì)胞瘤患者31例（VHL組）。VHL病的診斷參考LONSER等[1]公布的標(biāo)準(zhǔn)。血管母細(xì)胞瘤的確診基于術(shù)前MRI和手術(shù)切除后病理報(bào)告。從同期在我院接受手術(shù)切除的散發(fā)性小腦血管母細(xì)胞瘤96例患者中，收集31例散發(fā)性小腦血管母細(xì)胞瘤的患者（散發(fā)組）進(jìn)行配對(duì)。本研究經(jīng)由醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有患者均已簽署知情同意書。

1.2 配對(duì)方法 配對(duì)標(biāo)準(zhǔn)根據(jù)血管母細(xì)胞瘤患者小腦最大腫瘤的最大直徑（即差異≤2 mm）來定義；如果有兩名或以上的散發(fā)性患者達(dá)到匹配標(biāo)準(zhǔn)，則在其他臨床資料未知的情況下隨機(jī)進(jìn)行配對(duì)。然后采集所有患者的臨床資料：發(fā)病年齡、腫瘤數(shù)目和分布、最大腫瘤的體積和手術(shù)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

1.3 手術(shù)方法 62例患者均接受了腫瘤全切術(shù)。手術(shù)采用俯臥位和三點(diǎn)固定顱骨，對(duì)繼發(fā)梗阻性腦積水的患者進(jìn)行腦室引流，然后于枕骨中線進(jìn)行顱骨切除術(shù)，隨后依次切開硬腦膜及蛛網(wǎng)膜，在顯微鏡的幫助下找到腫瘤，充分暴露后進(jìn)行全部切除?；颊咔谐g(shù)后的影像學(xué)顯示無殘留腫瘤。術(shù)后血壓嚴(yán)格控制，特別是在術(shù)后24 h內(nèi)。所有患者在住院期間未發(fā)生明顯術(shù)后出血。

1.4 基因突變分析方法 利用DNA提取試劑盒（北京天根生物科技有限公司）直接從患者外周血中提取基因組DNA。使用Taq PCR MasterMix試劑盒（北京天根生物科技有限公司）以PCR法擴(kuò)增VHL基因的3個(gè)外顯子。VHL基因外顯子3對(duì)引物序列見表1。擴(kuò)增后的基因DNA序列測(cè)定采用ABI 3700 DNA遺傳分析儀。結(jié)果與人類VHL基因參考序列（nm_000551.3）及一致性編碼序列數(shù)據(jù)庫(kù)（ccds2597.1）進(jìn)行比較，從而確定是否有VHL基因的致病性突變發(fā)生。

表1 VHL基因擴(kuò)增引物序列

1.5 術(shù)后隨訪 術(shù)后持續(xù)隨訪時(shí)間從初次手術(shù)開始計(jì)算，定期隨訪內(nèi)容包括每年1次顱腦和腹部影像檢查（CT、超聲圖像或MRI）。收集隨訪期間每個(gè)復(fù)發(fā)患者的臨床資料。以本研究結(jié)束（2016年12月）或患者死亡時(shí)截止。至此次研究結(jié)束沒有其他原因?qū)е禄颊呤гL?？偵鏁r(shí)間以從手術(shù)切除的時(shí)間到小腦血管母細(xì)胞瘤復(fù)發(fā)或其他VHL病相關(guān)性疾病導(dǎo)致死亡的時(shí)間來衡量。無復(fù)發(fā)生存（recurrencefree survival，RFS）時(shí)間以從手術(shù)切除的時(shí)間到小腦血管母細(xì)胞瘤復(fù)發(fā)或其他VHL病相關(guān)性疾病發(fā)生的時(shí)間來衡量。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法 采用SPSS19.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。計(jì)數(shù)資料用百分比表示，非正態(tài)分布計(jì)量資料以M（P25，P75）表示。2組間率的比較用χ2或秩和檢驗(yàn)；2組研究對(duì)象的總生存率和RFS率分別采用Kaplan Meier曲線描述，以Log-rank檢驗(yàn)進(jìn)行比較。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 2組患者的臨床特征 VHL組患者比散發(fā)組患者發(fā)病年齡明顯提早，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）。VHL組的術(shù)前病史與散發(fā)組比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.144）。2組患者的腫瘤體積差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。VHL組患者的術(shù)中腫瘤切除個(gè)數(shù)與散發(fā)組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）。見表2。

2.2 VHL相關(guān)血管母細(xì)胞瘤患者基因突變分布情況 本研究的31例VHL相關(guān)小腦血管母細(xì)胞瘤患者來自中國(guó)5個(gè)家族，發(fā)現(xiàn)了4種不同的VHL基因突變位點(diǎn)，見表3。突變包括第559位堿基鳥嘌呤取代胞嘧啶，第697位堿基胸腺嘧啶取代胞嘧啶，第716位堿基胞嘧啶取代鳥嘌呤，以及第746位堿基胸腺嘧啶和747位堿基鳥嘌呤缺失。這4種突變的位點(diǎn)均可以導(dǎo)致密碼子的改變，從而進(jìn)一步造成錯(cuò)義VHL蛋白（pVHL）產(chǎn)生。

表2 2組患者的臨床特征[ n=31，M（P25，P75）]

表3 VHL相關(guān)小腦血管母細(xì)胞瘤患者基因突變分布

2.3 2組術(shù)后預(yù)后情況 VHL組患者RFS率明顯小于散發(fā)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001），見圖1。VHL組患者的總生存（overall survival，OS）率明顯小于散發(fā)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.037），見圖2。

圖1 VHL組患者與散發(fā)組患者RFS率的Kaplan Meier曲線

圖2 VHL組患者與散發(fā)組患者OS率的Kaplan Meier曲線

2.4 VHL組患者全身腫瘤分布情況 VHL組共有13例（占41.9%）患者表現(xiàn)為多發(fā)小腦血管母細(xì)胞瘤，其中10例（占32.3%）表現(xiàn)為2個(gè)腫瘤病灶，3例（占9.7%）表現(xiàn)為3個(gè)腫瘤病灶。在散發(fā)組沒有患者有多發(fā)小腦血管母細(xì)胞瘤的臨床表現(xiàn)。見表4。有2例患者被診斷為腎細(xì)胞癌，并最后導(dǎo)致死亡，2例患者在隨訪中發(fā)現(xiàn)胰腺神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤，其中1例死亡。VHL組有6例患者死于小腦血管母細(xì)胞瘤復(fù)發(fā)，而在散發(fā)組中只有2例死于小腦血管母細(xì)胞瘤復(fù)發(fā)。

表4 VHL組患者的全身腫瘤分布情況[ n（%）]

3 討論

散發(fā)性小腦血管母細(xì)胞瘤患者在接受腫瘤全切術(shù)后通常具有良好的預(yù)后。盡管VHL相關(guān)血管母細(xì)胞瘤有著類似于散發(fā)性血管母細(xì)胞瘤的良性組織學(xué)表現(xiàn)，卻有著快速生長(zhǎng)及多灶性的特點(diǎn)。外科手術(shù)切除仍然是目前公認(rèn)的小腦血管母細(xì)胞瘤的治療方式。然而在特定情況下，血管內(nèi)栓塞治療和立體定向放射治療是安全和有效的[5-6]。隨著醫(yī)學(xué)界對(duì)VHL病研究的深入，一些分析VHL相關(guān)中樞神經(jīng)系統(tǒng)血管母細(xì)胞瘤的預(yù)后方面的研究已經(jīng)有所報(bào)道，然而，這些研究并沒有對(duì)VHL相關(guān)性和散發(fā)性小腦血管母細(xì)胞瘤進(jìn)行直接的比較[7]。小腦血管母細(xì)胞瘤在VHL病的病死率中所占的比例需要進(jìn)一步的證實(shí)。同時(shí)這一比例應(yīng)與其他VHL相關(guān)腫瘤如腎細(xì)胞癌、嗜鉻細(xì)胞瘤和胰腺神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤進(jìn)行比較。在評(píng)估手術(shù)對(duì)預(yù)后的影響時(shí)，需要考慮多次切除手術(shù)所引起的小腦損傷。

VHL基因位于染色體3p25-26區(qū)，其中的3個(gè)外顯子發(fā)生致病性的突變導(dǎo)致了VHL病的發(fā)生[8]。VHL基因具有腫瘤抑制功能，VHL基因的抑制是導(dǎo)致VHL病發(fā)生的重要機(jī)制。VHL基因編碼2種VHL蛋白：分子量為30 kDa的完整形式以及1個(gè)19 kDa的形式。這2個(gè)蛋白異構(gòu)體都具有抑瘤作用，當(dāng)VHL基因存在致病性突變時(shí)則無法合成正常的VHL蛋白（pVHLs）。

86%～100%的家族性中樞神經(jīng)系統(tǒng)血管母細(xì)胞瘤患者具有一定程度的VHL基因突變。最常見的突變類型是錯(cuò)義突變（占27%～38%）和無義突變（占13%～27%）。大片段缺失為9%～20%；微小片段缺失為10%；基因重排的比例達(dá)到了25%[9]。VHL基因的胚系突變主要發(fā)生在外顯子1的尾部，外顯子2與外顯子3的頭部。然而VHL基因的突變位點(diǎn)具有多樣性，通常只有1到2個(gè)家庭被發(fā)現(xiàn)具有相同的突變。本研究的31例VHL相關(guān)小腦血管母細(xì)胞瘤患者來自中國(guó)的5個(gè)家族，檢測(cè)到25例（占80.6%）患者具有基因突變，有一個(gè)家族未發(fā)現(xiàn)VHL基因突變。此次發(fā)現(xiàn)的突變（559C→G）位于外顯子2，另外3種突變（716G→C，697C→T，746TGDel）則均位于外顯子3的頭部，這與過去的研究報(bào)道[9]相吻合。同時(shí)外顯子3的頭部的突變?cè)诒敬窝芯恐姓剂撕艽蟮谋壤?。另?個(gè)家族的VHL基因突變位點(diǎn)分別不同。此次研究的家族數(shù)量及患者數(shù)量相對(duì)較少，為更好地描述中國(guó)VHL病患者的基因突變位點(diǎn)分布仍需要擴(kuò)充更多的樣本。

中樞神經(jīng)系統(tǒng)血管母細(xì)胞瘤是VHL病患者最常見的臨床表現(xiàn)，約有72%的VHL病患者有中樞神經(jīng)系統(tǒng)血管母細(xì)胞瘤，其中65%的中樞神經(jīng)系統(tǒng)血管母細(xì)胞瘤位于小腦[4]。本研究中VHL相關(guān)血管母細(xì)胞瘤患者的中位發(fā)病年齡為32（27，37）歲。已有的一些研究同樣表明VHL病患者的中樞神經(jīng)系統(tǒng)血管母細(xì)胞瘤相比散發(fā)性患者具有早期形成的特點(diǎn)[10]。相較于正常VHL基因，突變的VHL基因?yàn)檠苣讣?xì)胞瘤的形成減少了阻礙。由于本研究中的VHL病患者大部分具有VHL基因的胚系突變，這也解釋了VHL病患者傾向多發(fā)腫瘤灶和具有高復(fù)發(fā)率的原因。血管母細(xì)胞瘤在小腦的多發(fā)特點(diǎn)也是區(qū)分VHL病與散發(fā)性小腦血管母細(xì)胞瘤的重要診斷依據(jù)之一。術(shù)后出血過去一直被認(rèn)為是小腦血管母細(xì)胞瘤患者死亡的一大原因。術(shù)后出血通常在手術(shù)后早期發(fā)生，并且經(jīng)常是由于腫瘤切除不完全導(dǎo)致。本研究中的31例患者均成功進(jìn)行了全切手術(shù)，其中部分患者接受了術(shù)前栓塞。所有患者在住院期間均未發(fā)生明顯的術(shù)后出血。嚴(yán)密監(jiān)測(cè)和控制血壓尤其是在腫瘤部分切除術(shù)后24 h內(nèi)是非常必要的，以避免血壓突然升高引起的術(shù)后出血。

本研究重在比較VHL相關(guān)小腦血管母細(xì)胞瘤患者與散發(fā)性患者術(shù)后預(yù)后情況。VHL相關(guān)小腦血管母細(xì)胞瘤患者的長(zhǎng)期預(yù)后明顯差于散發(fā)性小腦血管母細(xì)胞瘤患者。VHL組在OS率和RFS率上都顯著小于散發(fā)組。散發(fā)組中只有2例患者出現(xiàn)復(fù)發(fā)，而VHL組中有19例復(fù)發(fā)，這也表明了VHL相關(guān)小腦血管母細(xì)胞瘤患者需要更進(jìn)一步的術(shù)后管理，更加嚴(yán)格的定期隨訪。

截至隨訪結(jié)束，VHL組的病死率也明顯高于散發(fā)組。VHL組總共有9例死亡，其中3例死于VHL相關(guān)的其他系統(tǒng)的腫瘤，6例死于復(fù)發(fā)的小腦血管母細(xì)胞瘤。由于VHL基因胚系突變導(dǎo)致的表型特征的多樣性，使得VHL相關(guān)小腦母細(xì)胞瘤患者在術(shù)后遭受血管母細(xì)胞瘤復(fù)發(fā)和其他器官腫瘤生成的多重威脅。因此，VHL相關(guān)小腦母細(xì)胞瘤患者的長(zhǎng)期隨訪中很有必要對(duì)多器官進(jìn)行檢查。頭顱影像檢查是首要的，因?yàn)樾∧X血管母細(xì)胞瘤的復(fù)發(fā)依舊是威脅VHL病患者生命的最大因素。

在VHL病中，小腦血管母細(xì)胞瘤的多發(fā)及復(fù)發(fā)特性使得治療管理變得困難。一項(xiàng)最近的研究表明約一半的VHL病患者在4年就可以新生成小腦血管母細(xì)胞瘤[11-12]。也有其他研究指出血管母細(xì)胞瘤的結(jié)構(gòu)對(duì)其預(yù)后結(jié)果具有一定預(yù)測(cè)價(jià)值，小腦血管母細(xì)胞瘤的術(shù)前影像結(jié)果顯示為實(shí)性，則不論VHL相關(guān)還是散發(fā)性都對(duì)患者的預(yù)后有不利影響[13-14]。另有一項(xiàng)日本的研究顯示，小于20歲發(fā)病的VHL相關(guān)中樞神經(jīng)系統(tǒng)血管母細(xì)胞瘤患者相比大年齡發(fā)病患者的預(yù)后結(jié)果更差[7]。這與本研究結(jié)果相吻合，發(fā)病年齡是一個(gè)影響VHL相關(guān)小腦血管母細(xì)胞瘤預(yù)后的重要因素。

盡管VHL相關(guān)小腦血管母細(xì)胞瘤的患者與散發(fā)性患者有著相似的臨床表現(xiàn)及影像學(xué)特點(diǎn)，但VHL病患者有著更年輕的發(fā)病年齡，更高的復(fù)發(fā)率和欠佳的預(yù)后。VHL基因測(cè)序結(jié)合家族史調(diào)查可以更好地早期診斷和治療VHL病。對(duì)于有VHL病家族史的年輕家族成員進(jìn)行基因測(cè)序是非常必要的，同時(shí)對(duì)于VHL病患者的術(shù)后隨訪需要制訂更加嚴(yán)密的計(jì)劃并結(jié)合多器官的定期檢查。

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