楊穎，劉國(guó)，劉傳通，金瓊，朱飛

（溫州醫(yī)科大學(xué) 口腔醫(yī)學(xué)院，浙江 溫州 325027）

目前，臨床中用于解決頜面部缺損骨重建的方法是使用自體骨、同種異體骨或異種骨等骨替代物誘導(dǎo)新骨生成，但這幾種材料有其各自的不足。如作為骨替代材料“金標(biāo)準(zhǔn)”的自體骨在數(shù)量及大小上常不能滿足缺骨區(qū)的要求，還會(huì)增加骨供區(qū)的病理?yè)p害[1]，而同種異體骨和異種骨成骨作用較弱[2-3]，有再吸收及病毒傳播的風(fēng)險(xiǎn)[4]，因此有必要尋求一種更好的方法來(lái)解決骨量不足的問(wèn)題。

富血小板纖維蛋白（platelet-rich fibrin，PRF）是第二代血小板濃縮物，富含血小板及各種細(xì)胞因子，具有促進(jìn)組織愈合的能力，同時(shí)還含有抗炎因子和修復(fù)介質(zhì)，具有調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)和抗感染的能力。自體骨髓濃縮物（bone marrow aspirate concentrate，BMAC）是通過(guò)對(duì)骨髓抽吸物離心、分離后獲得的有核細(xì)胞的濃縮物，其內(nèi)富含骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（bone marrow stem cell，BMSC）、造血干細(xì)胞和淋巴細(xì)胞，被譽(yù)為骨替代材料的“鉑金標(biāo)準(zhǔn)”[5]。本研究將PRF與BMAC聯(lián)合應(yīng)用于兔顱骨缺損，觀察其成骨能力，為其在臨床中的應(yīng)用提供參考。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 12～16月齡健康日本大耳白兔6只，體質(zhì)量1.5～2.0 kg，雌雄不限，由溫州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供并飼養(yǎng)，動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK（浙）2014-0006。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 PRF的制備：采用CHOUKROUN等[6]提出的方法：兔心臟取血5 mL，放入不添加抗凝劑的離心管中，3 000 r/min的速度離心10 min。血液樣本分為3層（見(jiàn)圖1），中間層為乳白色的纖維蛋白凝膠（即PRF），上層和下層分別是貧血小板血漿層和紅細(xì)胞碎片層，取中間層，無(wú)菌紗布擠壓后剪成約1 mm×1 mm大小備用，另取一份壓成膜片行組織學(xué)分析。

圖1 PRF的制取

1.2.2 BMAC的制備：以含有0.2 mL肝素鈉（100 mg/L）的5 mL注射器，于兔雙側(cè)股骨處使用16號(hào)骨髓穿刺針各抽取骨髓2.5 mL，3 000 r/min離心10 min，可見(jiàn)骨髓分為3層（見(jiàn)圖2），上層為淡黃色漿液層，中間為黃褐色有核細(xì)胞層，下層為深紅色細(xì)胞層，用注射器抽取中間層（約1 mL）與PRF混合備用。

圖2 BMAC的制取

1.2.3 動(dòng)物模型制備：實(shí)驗(yàn)動(dòng)物稱重，3%戊巴比妥鈉注射液按1 mL/kg劑量耳緣靜脈麻醉適度后，顱頂備皮。2%鹽酸利多卡因局部麻醉下于顱頂正中縱行切開(kāi)皮膚并逐層分離，暴露顱中縫。0.9%氯化鈉溶液沖洗冷卻下使用環(huán)鋸于顱中縫兩側(cè)各制備2個(gè)直徑為5 mm的圓形骨缺損，隨機(jī)植入空白（A組）、自體骨沫（B組）、PRF+BMAC混合物（C組，見(jiàn)圖3），鈦膜覆蓋固定，分層縫合，10 d后拆線，術(shù)后肌注慶大霉素注射液1周（8×104U/d）。

圖3 骨缺損模型制備及骨移植材料填入

1.3 觀測(cè)指標(biāo) 術(shù)后6周處死實(shí)驗(yàn)兔，取顱骨標(biāo)本行影像學(xué)觀察。PRF制做冰凍切片，HE染色，行組織學(xué)評(píng)價(jià)。計(jì)算骨缺損區(qū)的新骨生成率：取經(jīng)過(guò)圓形骨缺損中心點(diǎn)的組織學(xué)切片進(jìn)行觀測(cè)，以骨缺損邊緣為外邊界，顱骨外板為上邊界，顱骨內(nèi)板為下邊界，40倍光鏡下，使用Image-Pro Plus 6.0軟件測(cè)量該區(qū)域的總面積以及該區(qū)域內(nèi)新生骨面積，各測(cè)量3次，取平均值，計(jì)算骨缺損區(qū)的新骨生成率。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法 使用SPSS17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以±s表示，采用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大體觀察 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物無(wú)一例死亡，術(shù)后2 d實(shí)驗(yàn)兔飲食及生活習(xí)性恢復(fù)正常，骨缺損區(qū)域均無(wú)感染，創(chuàng)口愈合良好，鈦膜無(wú)移位。

2.2 影像學(xué)觀察結(jié)果 A組：骨缺損區(qū)基本無(wú)變化，骨缺損邊緣可見(jiàn)散在不透射影。B組：可觀察到骨缺損形狀，骨缺損自邊緣至中央可見(jiàn)大量低灰度不透射影。C組：骨缺損邊緣及中央均為低灰度不透射影像，彼此連接成橋狀，尤其是邊緣與周圍基骨已無(wú)明顯區(qū)別。見(jiàn)圖4。

2.3 組織學(xué)觀察結(jié)果

2.3.1 PRF評(píng)價(jià)結(jié)果：PRF為乳白色膠凍樣團(tuán)塊，具有一定的彈性和韌性。光鏡觀察PRF膜片上端為染色均一的網(wǎng)狀纖維蛋白結(jié)構(gòu)，呈條索狀，疏松多孔，未見(jiàn)任何細(xì)胞；下端可觀察到少量細(xì)胞核藍(lán)染的白細(xì)胞鑲嵌在纖維蛋白網(wǎng)內(nèi)。見(jiàn)圖5。

圖4 影像學(xué)觀察結(jié)果

圖5 PRF膜片組織學(xué)觀察（HE染色）

2.3.2 骨缺損區(qū)組織學(xué)結(jié)果：6周時(shí)組織學(xué)切片示：A組骨缺損區(qū)以纖維結(jié)締組織為主，骨缺損邊緣可見(jiàn)少量成骨細(xì)胞和新骨生成。B組骨缺損區(qū)內(nèi)可見(jiàn)大量不規(guī)則形狀的自體骨顆粒，并以自體骨顆粒為中心有新骨形成。與A組相比，骨缺損邊緣新生骨量更多，骨質(zhì)更致密。C組骨缺損區(qū)可見(jiàn)大量新生骨，骨小梁排列規(guī)則緊密，且礦化程度較高，成骨細(xì)胞數(shù)量較A組和B組多，新生骨組織不僅局限于骨缺損邊緣，骨缺損中央也有大量新骨生成。見(jiàn)圖6。

2.3.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理結(jié)果：6周時(shí)A組新骨生成率為（7.64±1.02）%，B組為（12.94±0.81）%，C組為（37.19±1.26）%，C組與A、B組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

3 討論

PRF于2000年被成功制取并應(yīng)用于口腔頜面部組織再生治療，其制備過(guò)程簡(jiǎn)單易行，完全取自自體，且不添加抗凝劑及促凝劑，避免了交叉感染的風(fēng)險(xiǎn)，使用安全。有學(xué)者[7]提出，獲取PRF的技術(shù)關(guān)鍵在于血液的收集速度和放入離心機(jī)的速度。而兔模型因其動(dòng)靜脈血管細(xì)小，很難快速收集到足夠的血液，本研究摒棄常規(guī)耳緣靜脈取血的方法，采用心臟取血的方法，證實(shí)能夠快速獲取足量的血液并成功制取PRF。也有學(xué)者對(duì)PRF的生物學(xué)特性進(jìn)行了鑒定[8-10]，結(jié)果證明PRF的主體結(jié)構(gòu)為纖維蛋白構(gòu)成的三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，內(nèi)含血小板、各種生長(zhǎng)因子及少量免疫細(xì)胞。本研究將成功制取的PRF制作冰凍組織學(xué)切片，證實(shí)了PRF的三維網(wǎng)狀纖維蛋白結(jié)構(gòu)及含有少量白細(xì)胞的事實(shí)，但白細(xì)胞僅存于PRF層與紅細(xì)胞碎片層交界處，因此應(yīng)在制取PRF時(shí)將交界處組織一并取出。

圖6 術(shù)后6周組織學(xué)觀察（HE染色）

自體骨髓含有促進(jìn)骨再生的干細(xì)胞和骨祖細(xì)胞[11-13]，且其促進(jìn)骨組織再生的能力與骨髓細(xì)胞的濃度成正相關(guān)[14]。BMAC是將自體骨髓通過(guò)離心、分離后獲得的有核細(xì)胞的濃縮物，與人工培養(yǎng)增殖的BMAC相比避免了污染的風(fēng)險(xiǎn)，且未培養(yǎng)的骨髓來(lái)源的細(xì)胞在骨組織再生中也表現(xiàn)出了更大的優(yōu)勢(shì)[15-17]。在筆者之前的研究中，采用離心后人工分離制取BMAC的方法可獲得的細(xì)胞濃縮倍數(shù)為2～3倍，且細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)果表明BMAC內(nèi)的細(xì)胞具有干細(xì)胞的特性[18]，本研究采用該方法可成功獲取BMAC。

在以往的研究中，單獨(dú)應(yīng)用PRF促進(jìn)骨組織再生的效果有一定的局限，聯(lián)合其他骨替代材料往往可以獲得較理想的骨再生效果。OLIVEIRA等[19]將PRF單獨(dú)或聯(lián)合Bio-oss骨粉用于修復(fù)大鼠顱骨缺損，結(jié)果表明30 d時(shí)PRF聯(lián)合Bio-oss組獲得了遠(yuǎn)高于其他組的新骨生成率。然而，骨替代材料的添加同時(shí)也增加了免疫及病毒傳播的風(fēng)險(xiǎn)，本研究將PRF復(fù)合BMAC用于修復(fù)兔顱骨缺損，新骨生成率遠(yuǎn)大于自體骨組及空白對(duì)照組。該結(jié)論與WU等[20]的研究結(jié)果基本一致。PRF獨(dú)特的三維網(wǎng)格狀纖維蛋白結(jié)構(gòu)能將骨髓干細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)其中，并引導(dǎo)其遷移[21]；同時(shí)PRF較大的孔隙和良好的彈性，能夠促使?fàn)I養(yǎng)成分及氧氣彌散至細(xì)胞周圍，促進(jìn)干細(xì)胞的增殖分化，加速成骨過(guò)程[22]。

綜上，本研究探討了PRF聯(lián)合BMAC修復(fù)骨缺損的方法，二者能共同發(fā)揮作用，有效促進(jìn)骨缺損的早期愈合，為臨床中自體骨移植量不足或不能接受同種異體骨及異種骨移植的患者提供了新的選擇。

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