龔小花，周琦，吳文俊，王芳，陳肖俊

（溫州醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院，浙江 溫州 325015，1.內(nèi)分泌科；2.病理科）

甲狀腺癌是內(nèi)分泌科較為常見的惡性腫瘤，約占人體所有惡性腫瘤的1%，其中以甲狀腺乳頭狀癌最為多見。盡管甲狀腺乳頭狀癌絕大多數(shù)臨床進程緩慢，手術(shù)、藥物及放射性核素治療效果理想，但仍有一部分表現(xiàn)出高侵襲性特征，如局部外侵嚴重、容易復發(fā)和轉(zhuǎn)移，預(yù)后差。目前這部分高侵襲性的甲狀腺乳頭狀癌在術(shù)前依然缺乏有效的甄別手段，需要尋找更多敏感而特異的分子標志物以評估預(yù)后并制定治療方案。

PI3Kp85α是磷脂酰肌醇3激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）家族中表達量最多的調(diào)節(jié)亞基，由PIK3R1基因編碼。PI3Kp85α的活性增加與多種人類腫瘤的發(fā)生相關(guān)，但PI3Kp85α在甲狀腺乳頭狀癌中的作用鮮有報道，因此，本研究分別檢測甲狀腺乳頭狀癌組織、甲狀腺乳頭狀增生組織中PI3Kp85α蛋白的表達情況，并分析其與患者臨床病理特征的相關(guān)性，利用ROC曲線評價PI3Kp85α在甲狀腺乳頭狀癌診斷中的價值。

1 資料和方法

1.1 一般資料 收集2011年9月至2014年9月間在溫州醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院就診且行外科手術(shù)治療，術(shù)后經(jīng)常規(guī)病理檢查確診為甲狀腺乳頭狀癌的116例患者的臨床資料。其中男43例，女73例；年齡18～56歲，平均（42.6±12.0）歲；腫瘤直徑≥2 cm者35例，＜2 cm者81例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者75例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者41例。選擇同期住院手術(shù)甲狀腺乳頭狀增生患者90例。其中結(jié)節(jié)性甲狀腺腫84例，甲狀腺腺瘤4例，慢性淋巴細胞性甲狀腺炎2例；男26例，女64例；年齡15～60歲，平均（42.0±12.2）歲。2組性別、年齡具有可比性（均P＞0.05）。納入標準：患者的病例資料完善；無其他基礎(chǔ)疾病或是慢性疾病或合并其他全身惡性腫瘤。排除標準：病例資料不完整；術(shù)前進行過放療、化療、內(nèi)分泌治療及激素治療；合并其他全身惡性腫瘤。本研究經(jīng)本院學術(shù)倫理委員會審批同意。

1.2 免疫組織化學染色評分 采用免疫組織化學SP法檢測PI3Kp85α在甲狀腺組織中的表達。所有病例標本均經(jīng)4%中性甲醛溶液固定，乙醇脫水，常規(guī)石蠟包埋，4 μm厚連續(xù)切片備用，脫蠟，3%過氧化氫封閉內(nèi)源性過氧化物酶，在0.01 mol/L枸櫞酸緩沖液（pH 6.0）中微波加熱30 min進行抗原修復，冷卻至室溫，用PBS洗滌后，分別加入鼠抗人PI3Kp85α單克隆抗體（美國Labvision公司，使用時按1:50稀釋），37 ℃孵育1 h，再加生物素化的兔抗鼠二抗即用型，37 ℃孵育30 min后，滴加新鮮配置的DAB顯色液，顯色1～2 min，PBS緩沖液浸洗3次，每次2 min。蘇木素復染1 min，脫水透明，中性樹膠封片。采用已知陽性片作為陽性對照，分別用PBS液和小鼠血清代替一抗作為陰性對照。每例組織檢測獨立重復3次。

免疫組織化學染色結(jié)果由2名不知道患者臨床資料的病理學專家獨立判定。光鏡下PI3Kp85α蛋白表達陽性表現(xiàn)為細胞膜或細胞質(zhì)棕黃色著色。隨機選擇10個高倍視野，每個視野計數(shù)100個細胞，計算陽性細胞數(shù)占總細胞數(shù)的百分比，取10個視野的算術(shù)平均值。根據(jù)顯色細胞的比例計分：顯色細胞5% 0分，6%～25% 1分，26%～50% 2分，51%～75% 3分，＞75% 4分；根據(jù)細胞染色強度計分：0分細胞無顯色，1分淺黃色，2分黃色，3分棕黃色。每例積分按顯色細胞比例計分和細胞染色強度計分的乘積計算。積分0分為陰性，1～4分為弱陽性（1+），5～8分為中等陽性（2+），9～12分為強陽性（3+）。

1.3 Western blot檢測 在冰凍的甲狀腺乳頭狀癌組織中加蛋白裂解液100 mg/500 μL提取總蛋白，采用考馬斯亮藍法進行蛋白定量。取50 μg總蛋白進行12% SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳；轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉37 ℃搖床封閉1 h后，加入PI3Kp85α單克隆抗體（美國Chemicon公司，使用時1:1 000稀釋），4 ℃孵育過夜；辣根過氧化物酶標記二抗（1:4 000稀釋）室溫下孵育1 h；洗膜，DAB法顯色。GAPDH為內(nèi)對照。判斷標準：膜上出現(xiàn)清晰特異性條帶為陽性。圖像掃描儀掃描（北京清華紫光公司），定量軟件分析系統(tǒng)（Image）測定每一樣本條帶的D值，目的條帶與內(nèi)對照GAPDH條帶D值之比為該樣本中蛋白的相對含量。每例組織檢測重復3次，取平均值。

1.4 ELISA法檢測 ELISA法檢測組織勻漿上清液中蛋白的濃度。在100 mg剪碎組織中加入1 mL蛋白提取液，液氮研磨，冰上孵育30 min后離心取上清，采用BCA（bicinchoninic acid，美國Thermo公司）蛋白檢測試劑盒檢測蛋白濃度。采用美國Uscn公司人ELISA試劑盒依次將標準品、待測樣品100 μL加入到酶標板中，在待測樣品孔中先加樣品稀釋液80 μL，再加待測樣品20 μL置于孔底部（以不加樣品及酶標試劑為空白孔）。蓋上覆膜，37 ℃溫育2 h，棄去液體，每孔加入酶標試劑100 μL（空白孔除外），蓋上覆膜后置于37 ℃溫育30 min，棄去液體，用洗滌液洗滌，加入100 μL顯色劑，37 ℃避光顯色15 min，每孔加入終止液50 μL終止反應(yīng)（此時藍色立刻轉(zhuǎn)為黃色）。加終止液后15 min內(nèi)，以空白孔為調(diào)零孔，用酶標儀（美國Bio-Rad公司）在450 nm波長處依序測量各孔的吸光度（OD值）。實驗設(shè)6個重復孔，取平均值，以標準品濃度為橫坐標，OD值為縱坐標，繪制標準曲線，由樣品的OD值查出相應(yīng)的濃度，再乘以稀釋倍數(shù)即樣品的實際濃度。

1.5 統(tǒng)計學處理方法 采用SPSS19.0軟件進行統(tǒng)計學分析。計量資料采用±s表示，2組間的比較采用獨立樣本t檢驗；計數(shù)資料采用百分比或率表示，采用χ2檢驗分析；診斷敏感性和特異性采用ROC曲線分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 免疫組織化學法檢測PI3Kp85α蛋白在甲狀腺組織中的表達 PI3Kp85α蛋白表達陽性表現(xiàn)為細胞質(zhì)呈明顯棕黃色（見圖1）。PI3Kp85α在癌組織中均呈不同程度的陽性表達，在甲狀腺乳頭狀增生組織中呈現(xiàn)弱表達；PI3Kp85α蛋白的陽性表達率在甲狀腺乳頭狀癌組織中顯著高于甲狀腺良性病變組織，差異有統(tǒng)計學意義（χ2=68.322，P＜0.01），見表1。

圖1 PI3Kp85α蛋白在甲狀腺組織中的表達（SP，×200）

表1 免疫組織化學檢測PI3Kp85α蛋白在2組中的表達

2.2 Western blot檢測PI3Kp85α蛋白表達 結(jié)果顯示，在甲狀腺乳頭狀癌組織中PI3Kp85α蛋白表達水平（0.83±0.12）高于甲狀腺乳頭狀增生組織（0.37±0.05），差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。

2.3 ELISA檢測組織勻漿上清液中PI3Kp85α蛋白濃度 結(jié)果顯示，甲狀腺乳頭狀癌組織勻漿上清液中PI3Kp85α的蛋白濃度為（2.74±0.46）ng/mL，甲狀腺乳頭狀增生組織細胞PI3Kp85α的蛋白濃度為（1.39±0.55）ng/mL，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

2.4 PI3Kp85α蛋白表達與甲狀腺乳頭狀癌臨床病理參數(shù)間的關(guān)系 PI3Kp85α蛋白表達與患者性別、年齡、腫瘤大小無關(guān)（P＞0.05），與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期相關(guān)（P＜0.05），見表2。

2.5 PI3Kp85α診斷甲狀腺乳頭狀癌的ROC曲線分析 組織勻漿上清液中PI3Kp85α濃度診斷甲狀腺乳頭狀癌的曲線下面積為0.966（95%CI=0.942～0.989，P＜0.001），當cut-off值取2.100時，診斷靈敏度（92.2%）和特異度（91.1%）最高（見圖2）。

3 討論

PI3K是一種與細胞信號轉(zhuǎn)導有關(guān)的蛋白激酶，可被多種細胞因子激活?；罨腜I3K使下游信號蛋白絲氨酸/蘇氨酸（Ser/Thr）蛋白激酶B（Akt）等磷酸化，進而通過信號轉(zhuǎn)導通路，傳遞生長因子等胞外刺激信號，參與調(diào)節(jié)細胞增生、分化、代謝和凋亡等生理活動[1-3]。目前，PI3K家族中研究最廣泛的是能被細胞表面受體所激活的I型PI3K。IA型PI3K由一個調(diào)節(jié)亞基P85α和一個催化亞基p110組成，PI3Kp85α對于p110催化亞基的穩(wěn)定、聚集以及IA型PI3K的激活是必需的[4-5]。PI3Kp85α是PI3K家族中表達量最多的調(diào)節(jié)亞基，有研究表明PI3Kp85α突變可以引起PI3K/Akt通路的激活[6-7]。已有研究報道PI3Kp85α的活性增加與乳腺癌、肺癌、腎癌、腸癌和淋巴瘤等多種人類腫瘤的發(fā)生相關(guān)[8-10]。

表2 甲狀腺乳頭狀癌中PI3Kp85α蛋白表達的臨床病理意義（±s）

表2 甲狀腺乳頭狀癌中PI3Kp85α蛋白表達的臨床病理意義（±s）

臨床病理因素 n PI3Kp85α P性別 0.266男43 0.83±0.12女73 0.86±0.15年齡（歲） 0.489≥45 54 0.84±0.16＜45 62 0.86±0.15腫瘤大?。╟m） 0.400≥2 35 0.83±0.11＜2 81 0.85±0.12淋巴轉(zhuǎn)移0.042有75 0.86±0.08無41 0.82±0.13 TNM分期0.004 I～II期 34 0.82±0.11 III～IV期 82 0.88±0.07

圖2 PI3Kp85α診斷甲狀腺乳頭狀癌的ROC曲線

本研究免疫組織化學檢測結(jié)果顯示，PI3Kp85α在甲狀腺乳頭狀癌組織中的陽性表達率（為69.8%）顯著高于甲狀腺良性病變組織（為31.1%）；Western blot檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在甲狀腺乳頭狀癌組織中，PI3Kp85α蛋白表達水平高于甲狀腺乳頭狀增生組織，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）；ELISA檢測結(jié)果亦顯示，甲狀腺乳頭狀癌組織勻漿上清液中PI3Kp85α蛋白濃度顯著高于甲狀腺甲狀腺乳頭狀增生組織（P＜0.05）。上述結(jié)果提示PI3Kp85α蛋白表達情況可作為甲狀腺乳頭狀癌和甲狀腺良性病變的鑒別診斷依據(jù)之一。PI3Kp85α診斷甲狀腺乳頭狀癌的ROC曲線分析顯示，曲線下面積為0.966（95%CI=0.942～0.989，P＜0.001），當cut-off值取2.100時，診斷靈敏度可達92.2%，特異度可達91.1%。

本研究顯示，PI3Kp85α蛋白表達與患者性別、年齡、腫瘤大小無關(guān)，但與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和TNM分期相關(guān)，提示PI3Kp85α與甲狀腺乳頭狀癌的侵襲發(fā)展及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移過程密切相關(guān)。PETRULEA等[11]也發(fā)現(xiàn)PI3Kp85α過表達有強烈致癌變作用，是高侵襲性甲狀腺乳頭狀癌潛在的治療靶點。DUMAN等[12]研究發(fā)現(xiàn)PI3Kp85α的異?；罨c正常甲狀腺組織的被膜侵犯有一定的相關(guān)性。因此，PI3Kp85α可能與少部分甲狀腺乳頭狀癌出現(xiàn)高侵襲性變異，甚至在早期就出現(xiàn)局部侵犯或淋巴結(jié)及遠處轉(zhuǎn)移有關(guān)。有研究發(fā)現(xiàn)，PI3Kp85α的突變是導致腫瘤組織中PI3K/AKT異常激活的重要原因[13-14]，PI3Kp85α的磷酸化修飾也改變了PI3K/AKT通路的活性[15-16]，此外PI3K調(diào)節(jié)亞基和催化亞基之間的平衡也影響著PI3K/AKT活性和生物學效應(yīng)[17]?？梢?，PI3Kp85α對PI3K/AKT信號通路的調(diào)節(jié)是非常復雜的，具體機制有待進一步明確。

綜上所述，PI3Kp85α在甲狀腺乳頭狀癌中高表達，且與其淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期相關(guān)，提示PI3Kp85α可能促進了甲狀腺乳頭狀癌的增殖、浸潤及轉(zhuǎn)移。早期聯(lián)合檢測PI3Kp85α的表達可能可以作為評估甲狀腺乳頭狀癌侵襲性及預(yù)后的指標之一。

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