李 妍， 李春華， 梁 文， 許 麗， 劉 剛

(上海市計(jì)量測(cè)試技術(shù)研究院 化學(xué)與電離輻射所, 上海 201203)

0 引 言

與傳統(tǒng)化學(xué)樣品相比，目前基因檢測(cè)的量值溯源水平有待提高，可溯源的DNA準(zhǔn)確定量方法非常缺乏，無法滿足相關(guān)檢測(cè)過程中工作標(biāo)準(zhǔn)賦值、方法驗(yàn)證、質(zhì)量控制等的需求，影響了相關(guān)分析儀器的計(jì)量校準(zhǔn)規(guī)程的建立。常用的定量DNA方法主要有紫外分光光度法(UV)、熒光染料法、qPCR(Quantitative PCR)、dPCR(Digital PCR)，前兩種方法在靈敏度和穩(wěn)定性方面還有待提高[1]；后兩種方法存在假陽性的風(fēng)險(xiǎn)較大，而且對(duì)于以上DNA定量方法，量值溯源性問題仍然是很大挑戰(zhàn)。

隨著元素分析方法的發(fā)展，定磷法成為一種可行的DNA定量檢測(cè)方法，由于對(duì)于特定的DNA分子來說，其磷含量是一個(gè)固定參數(shù)，通過檢測(cè)DNA分子中的磷含量，就可以計(jì)算DNA分子的含量，該方法的靈敏度較高，可以溯源到國際單位，而且檢測(cè)成本較低。電感耦合等離子體發(fā)射光譜技術(shù)(ICP-OES)是一種溯源清晰的DNA定量方法[2], 韓國標(biāo)準(zhǔn)與科學(xué)研究院(KRISS)及美國標(biāo)準(zhǔn)與技術(shù)研究院(NIST)[3]等, 將該方法用于基因組核酸[4]、質(zhì)粒DNA[5-7]和寡聚核酸[8-9]等核酸純品物質(zhì)的定量測(cè)量。中國計(jì)量科學(xué)研究院也在核酸ICP-OES 定量分析方面做了大量的嘗試[10]。高分辨電感耦合等離子體質(zhì)譜(HR-ICP-MS)定量的質(zhì)量數(shù)能精確到0.000 1，其對(duì)痕量和超痕量元素良好的檢測(cè)能力以及譜圖的簡(jiǎn)單易識(shí)，使其成為分析痕量和超痕量元素的常規(guī)方法[11-14]。

本文研究HR-ICP-MS定量檢測(cè)DNA中磷含量從而定量DNA的方法，考察純化和微波消解等樣品前處理步驟，考察生物實(shí)驗(yàn)中常用的TE溶液對(duì)該方法的影響，對(duì)標(biāo)準(zhǔn)曲線的配制進(jìn)行優(yōu)化，保證檢測(cè)結(jié)果量值可溯源，且提高該方法與其它DNA定量方法的可比性。本方法具有良好的最低檢出限和精密度，可以應(yīng)用于較低濃度質(zhì)粒DNA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的定值，符合相關(guān)技術(shù)文件要求[15-16]，有助于提高基因檢測(cè)領(lǐng)域的量值溯源水平，保證相關(guān)檢測(cè)項(xiàng)目的結(jié)果準(zhǔn)確可靠。

1 材料與方法

1.1 試劑及儀器

試劑：高純度硝酸(HNO3，10 mg/L，日本多摩化學(xué))，磷酸二氫銨標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(GBW06502，中國計(jì)量科學(xué)研究院)，釔標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(GBW08657，中國計(jì)量科學(xué)研究院)，HR-ICP-MS測(cè)試試驗(yàn)所用試劑均為分析純以上，實(shí)驗(yàn)用水經(jīng)超純水系統(tǒng)制備，所用器皿均經(jīng)30%的硝酸浸泡，超純水清洗。Tris(生工生物公司)，EDTA(生工生物公司)，優(yōu)級(jí)純鹽酸(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)，脫氧核糖核酸酶I(寶生物公司)，異丙醇(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)，無水乙醇(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)，質(zhì)粒提取試劑盒(OMEGA)、質(zhì)粒純化試劑盒(德國MN公司)，NIST P標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(SRM3139a)，小牛胸腺DNA含量標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(中國計(jì)量院 GBW09801)，鮭魚精DNA成分標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(中國計(jì)量院BW2701-1)，轉(zhuǎn)基因大豆質(zhì)粒DNA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(上海計(jì)量院GBW(E)100274)。

儀器：Element2 高分辨電感耦合等離子發(fā)射光譜儀(美國Thermo公司)，MARS 微波消解儀(MILESTONE微波消解儀公司)，Millipore Q 超純水系統(tǒng)(美國Millipore 公司)，分析天平(瑞士梅特勒公司)，eppendorf高速冷凍離心機(jī)(德國eppendorf 公司)， nanodrop2000紫外分光光度計(jì)(美國Thermo公司)，電泳儀和電泳槽(美國伯樂公司)，凝膠成像分析系統(tǒng)(美國伯樂公司)，冷藏冰箱(海爾公司)，冷凍冰箱(海爾公司)，超低溫冷凍冰箱(美國Thermo公司)，立式壓力蒸汽滅菌器(上海申安醫(yī)療器械廠)，恒溫混勻儀(德國eppendorf 公司)，渦旋振蕩器(德國IKA公司)，pH計(jì)(上海精科公司)，移液槍(德國eppendorf公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1TE溶液的配制

1 mol/L Tris-HCl(pH7.4)：稱量121.1 g Tris置于1 L燒杯中，加入800 mL去離子水，充分?jǐn)嚢枞芙猓{(diào)節(jié)pH值，定容至1 L，高溫高壓滅菌后，室溫保存。

10×TE Buffer (pH7.4)：量取100 mL 1 mol/L Tris-HCl Buffer(pH7.4)，20 mL 500 mmol/L EDTA(pH8.0)置于1 L燒杯中，加入800 mL去離子水，混合均勻，定容至1 L，高溫高壓滅菌后，室溫保存。

1.2.2瓊脂糖凝膠電泳鑒定DNA純度

吸取2 μL質(zhì)粒pXL02于1.5 mL EP管中，加入1 μL EcoRI核酸內(nèi)切酶， 2 μL酶解緩沖液和15 μL無菌水，置于37 ℃水浴酶解2 h。取10 μL酶切液上樣0.8%瓊脂糖凝膠，電泳條件為電壓80～100 V、30 min，電泳后凝膠成像分析DNA條帶。

1.2.3樣品的微波消解

天平稱重空微波消解管質(zhì)量記為mo，加適量的樣品于微波消解管中稱重記為mp，再加入適量2%硝酸溶液，微波消解條件為200 ℃，1 500 W，4 h；將消解后的微波消解管稱重質(zhì)量記為mp；根據(jù)公式計(jì)算樣品的稀釋倍數(shù)

1.2.4計(jì)算樣品中磷元素的含量

根據(jù)基因測(cè)序測(cè)得DNA樣品的堿基數(shù)和相對(duì)分子質(zhì)量，計(jì)算DNA樣品中P元素含量百分比：

wP%=堿基數(shù)×磷的原子量÷

DNA相對(duì)分子質(zhì)量×100%

1.2.5HR-ICP-MS定磷法計(jì)算模型

根據(jù)定磷法原理，建立HR-ICP-MS檢測(cè)核酸濃度的計(jì)算模型：

式中：c為核酸樣品濃度；cs為由標(biāo)準(zhǔn)曲線求得樣品中P含量；Vs為檢測(cè)時(shí)樣品最終體積；V為吸取核酸樣品原液的體積；wP%為核酸樣品中P元素含量百分比。

將高濃度DNA樣品稀釋后用HR-ICP-MS檢測(cè)DNA樣品中磷元素的質(zhì)譜信號(hào)豐度，再根據(jù)HR-ICP-MS檢測(cè)核酸濃度的計(jì)算模型得出DNA濃度。

1.2.6HR-ICP-MS定磷法和UV法的最低檢出限(LOD)

利用小牛胸腺DNA含量標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)配制標(biāo)準(zhǔn)溶液，P濃度分別為1、2、3、4、5 ng/mL，用HR-ICP-MS對(duì)上述5種P標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率k。以DNA儲(chǔ)存液TE buffer為空白樣品，用HR-ICP-MS連續(xù)測(cè)量6次超純水和空白樣品的信號(hào)，計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)偏差SD和 SDICP；根據(jù)公式計(jì)算：HR-ICP-MS定磷法檢測(cè)磷元素的最低檢出限

LODP=3SDICP/k

以wP%的DNA樣品為例，換算成HR-ICP-MS定磷法檢測(cè)DNA的最低檢出限

LODDNA=3SDICP/(0.1k)

核酸分子含有嘌呤環(huán)和嘧啶環(huán)的共軛雙鍵，其紫外可見吸收光譜在260 nm附近有一強(qiáng)的吸收峰，針對(duì)雙鏈DNA，樣品濃度和吸光值之間有以下關(guān)系：

雙鏈DNA濃度=A260×50，其中A260為核酸在260 nm處的吸光值，單位為ng/μL。本項(xiàng)目中用TE buffer做空白樣品，用紫外分光光度計(jì)測(cè)量6次空白樣品在260 nm處的吸光值，計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)偏差SDUV。UV法檢測(cè)DNA的最低檢出限

LODUV=3SDUV×50

1.2.7HR-ICP-MS定磷法的精密度

HR-ICP-MS定磷法測(cè)量轉(zhuǎn)基因大豆質(zhì)粒DNA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，連續(xù)測(cè)量8次，計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，考察HR-ICP-MS定磷法的精密度。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品處理

以人工設(shè)計(jì)并合成的質(zhì)粒DNA樣品(編號(hào)pXL02)為目標(biāo)，開展HR-ICP-MS定量分析，并考察了前處理?xiàng)l件優(yōu)化的必要性。質(zhì)粒DNA樣品基因測(cè)序得到的基本信息如下：質(zhì)粒名稱pXL02，堿基數(shù)4 266 bp，相對(duì)分子質(zhì)量2 593 133 D，磷元素含量(質(zhì)量分?jǐn)?shù))10.19%。

(1) DNA樣品的純度。用堿裂解法提取的質(zhì)粒DNA樣品中?；煊屑?xì)菌基因組DNA和RNA雜質(zhì)，而HR-ICP-MS定磷法根據(jù)核酸中的磷定量，不能區(qū)分DNA和RNA。因此，保證樣品中不含有目標(biāo)DNA外的核酸雜質(zhì)，才能進(jìn)行定磷法檢測(cè)。

將質(zhì)粒DNA 樣品PXL02用限制性內(nèi)切酶EcoRI 單酶切消化成線性片段，然后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳分析。由于質(zhì)粒DNA 序列上有且僅有一個(gè)EcoRI酶切位點(diǎn)，環(huán)裝質(zhì)粒DNA經(jīng)過酶切消化后變成一條線性DNA(分子大小不變，仍為4 266 bp)。從圖1中可以看出清晰的DNA條帶，沒有細(xì)菌基因組DNA和RNA、蛋白質(zhì)等雜質(zhì)污染，滿足瓊脂糖凝膠電泳鑒定標(biāo)準(zhǔn)。理論上，高純度DNA樣品的A260/A280檢測(cè)結(jié)果應(yīng)為1.8～2.0，而A260/A230檢測(cè)結(jié)果應(yīng)達(dá)到2.0；本實(shí)驗(yàn)中，經(jīng)過純化后的樣品pXL02用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)，A260/A280=1.9，A260/A230=2.0，滿足紫外分光光度法鑒定標(biāo)準(zhǔn)。表明，實(shí)驗(yàn)室制備的質(zhì)粒DNA樣品純度已經(jīng)足夠高，沒有RNA污染，因此無需進(jìn)一步增加純化步驟。

M-核酸標(biāo)準(zhǔn)片段DL 5 000 Marker; 1-PXL02 經(jīng)限制性內(nèi)切酶EcoRI 酶切后的產(chǎn)物

圖1 PXL02 電泳分析結(jié)果

(2) 微波消解的必要性。由于微波消解是HR-ICP-MS檢測(cè)樣品常用的前處理方法，因此，設(shè)計(jì)試驗(yàn)考察質(zhì)粒DNA樣品是否需要微波消解的前處理方法及其對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響。同樣的DNA樣品分成兩組，一組經(jīng)過微波消解；另一組不經(jīng)過微波消解，分別開展HR-ICP-MS檢測(cè)，數(shù)據(jù)如表1所示。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，微波消解后的樣品HR-ICP-MS檢測(cè)信號(hào)降低9%，標(biāo)準(zhǔn)偏差增加32%。原因可能是低濃度的DNA在長(zhǎng)時(shí)間的高溫微波消解過程中容易吸附在管壁上，導(dǎo)致部分DNA樣品損失，使樣品間檢測(cè)結(jié)果標(biāo)準(zhǔn)偏差增大。

表1 微波消解質(zhì)粒樣品對(duì)HR-ICP-MS影響的統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)

t-test統(tǒng)計(jì)分析微波消解和未微波消解質(zhì)粒樣品濃度的檢測(cè)結(jié)果(表1)t(t-crit，說明兩種方法的實(shí)驗(yàn)結(jié)果不存在顯著性差異。因此，微波消解DNA樣品的方法會(huì)降低質(zhì)譜信號(hào)，并引入更多的質(zhì)譜檢測(cè)信號(hào)標(biāo)準(zhǔn)偏差，但對(duì)檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確度沒有實(shí)質(zhì)性影響。

因此，通過考察分析樣品的前處理?xiàng)l件，確定HR-ICP-MS定磷法定量DNA樣品的前處理過程無需進(jìn)行微波消解，但需要鑒定樣品DNA純度，保證樣品中不含有目標(biāo)DNA外的核酸雜質(zhì)。

2.2 工作標(biāo)準(zhǔn)的選擇

考慮到DNA樣品的生物特殊性，用無機(jī)磷做標(biāo)準(zhǔn)曲線可能與實(shí)際DNA樣品有差異。因此，分別用無機(jī)磷標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和小牛胸腺DNA含量標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)配制標(biāo)準(zhǔn)溶液，考察兩種標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)HR-ICP-MS檢測(cè)DNA的影響。根據(jù)3次獨(dú)立試驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)曲線(見圖2)分析，小牛胸腺DNA含量標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)配制的標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率小于無機(jī)磷標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)配制的標(biāo)準(zhǔn)曲線。經(jīng)過統(tǒng)計(jì)分析t-test統(tǒng)計(jì)結(jié)果見表2，兩種標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率存在顯著性差異。因此，小牛胸腺DNA含量標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)配制的標(biāo)準(zhǔn)曲線與無機(jī)磷標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)配制的標(biāo)準(zhǔn)曲線有很大不同。

(a)

圖2 無機(jī)磷標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)配制的標(biāo)準(zhǔn)曲線和小牛胸腺DNA含量標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)配制的標(biāo)準(zhǔn)曲線((a)～(c)分別表示在不同時(shí)間進(jìn)行的3次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)，每次實(shí)驗(yàn)每種標(biāo)準(zhǔn)曲線做3個(gè)重復(fù))表2 無機(jī)磷和小牛胸腺DNA含量標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)配制的標(biāo)準(zhǔn)曲線差異統(tǒng)計(jì)分析

為進(jìn)一步選擇適合檢測(cè)DNA的工作標(biāo)準(zhǔn)，將鮭魚精DNA成分標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)作為被測(cè)樣品。HR-ICP-MS測(cè)量樣品依據(jù)無機(jī)磷工作標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算結(jié)果為843.37 mg/L，依據(jù)小牛胸腺DNA工作標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算結(jié)果為944.68 mg/L。鮭魚精DNA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)證書上標(biāo)明其標(biāo)準(zhǔn)值為(968±38) mg/L，k=2。用小牛胸腺DNA工作標(biāo)準(zhǔn)計(jì)算得到的HR-ICP-MS測(cè)量結(jié)果符合標(biāo)準(zhǔn)值，而用無機(jī)磷工作標(biāo)準(zhǔn)計(jì)算得到的結(jié)果與比標(biāo)準(zhǔn)值明顯偏低12.9%。分析原因，認(rèn)為在檢測(cè)核酸樣品時(shí)，DNA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)比無機(jī)磷標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)與樣品具有更好基體一致性，HR-ICP-MS定磷法測(cè)量DNA樣品時(shí)應(yīng)該選擇小牛胸腺DNA含量標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)配制的標(biāo)準(zhǔn)曲線作為工作標(biāo)準(zhǔn)。

2.3 靈敏度和精密度

利用儀器調(diào)試溶液對(duì)儀器進(jìn)行各項(xiàng)參數(shù)的調(diào)試，儀器的最優(yōu)化條件為：冷卻氣流量16.86 L/min，輔助氣流量0.99 L/min，霧化氣流量1.123 L/min，功率1 350 W。

以小牛胸腺DNA含量標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中磷的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(x)，質(zhì)譜信號(hào)豐度為縱坐標(biāo)(y)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖3所示，線性擬合度良好。

用HR-ICP-MS連續(xù)測(cè)量6次超純水和空白樣品，兩者質(zhì)譜信號(hào)值差別很小，說明空白樣品中沒有干擾HR-ICP-MS檢測(cè)的元素。其中空白樣品的SDICP為35.06 cps。HR-ICP-MS定磷法的磷元素最低檢出限LODP為0.032 ng/mL，換算成HR-ICP-MS定磷法檢測(cè)DNA的最低檢出限LODDNA為0.000 32 ng/μL，UV法連續(xù)測(cè)量6次空白樣品的SD為0.002 Abs,檢測(cè)DNA的最低檢出限LODUV為0.3 ng/μL，可見HR-ICP-MS檢測(cè)DNA的最低檢出限優(yōu)于紫外分光光度法3個(gè)數(shù)量級(jí)。因此，HR-ICP-MS定磷法檢測(cè)DNA的靈敏度更低，適用于定量低濃度DNA樣品。用HR-ICP-MS定磷法8次測(cè)量轉(zhuǎn)基因大豆質(zhì)粒DNA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，測(cè)量結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.15%，證明該方法精密度良好。

圖3 小牛胸腺DNA含量標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)配制的標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.4 HR-ICP-MS定磷法應(yīng)用于標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的定值

在標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研制中，將HR-ICP-MS定磷法應(yīng)用于阪崎腸桿菌檢測(cè)質(zhì)粒DNA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的定值。4個(gè)阪崎腸桿菌檢測(cè)質(zhì)粒DNA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(PXL04、PXL05、PXL06、PXL07)采用UV法和HR-ICP-MS定磷法2種方法定值；HR-ICP-MS檢測(cè)數(shù)據(jù)見表3。匯總?cè)吭紨?shù)據(jù)后經(jīng)統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)確認(rèn)各組數(shù)據(jù)無離群值、各組數(shù)據(jù)等精度、每組數(shù)據(jù)的平均值之間不存在顯著性差異后，取檢測(cè)結(jié)果的平均值為各質(zhì)粒DNA 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)值，分別為52.4，61.6，74.4，85.4 ng/μL。因此，HR-ICP-MS定磷法的精確度和靈敏度都能很好的滿足質(zhì)粒DNA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的定值，在今后研究中可以應(yīng)用于質(zhì)粒DNA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的定值。

表3 HR-ICP-MS定磷法測(cè)量阪崎腸桿菌質(zhì)粒DNA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)

3 結(jié) 語

本文通過實(shí)驗(yàn)研究，建立了一種HR-ICP-MS定磷法定量檢測(cè)DNA分子的方法。該方法可作為常規(guī)制備DNA稀釋后直接定量檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)定值方法，具有簡(jiǎn)便快捷、靈敏度高、精密度好等優(yōu)點(diǎn)，滿足DNA實(shí)際定量測(cè)量的應(yīng)用需求。該方法重點(diǎn)攻克生物分析量值溯源領(lǐng)域的瓶頸問題，實(shí)現(xiàn)DNA分子HR-ICP-MS可溯源定值，推動(dòng)DNA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的研制工作，為生物檢測(cè)過程提供量值傳遞依據(jù)。

參考文獻(xiàn)(References)：

[1] Haynes H M J,Rabb R J, Satija S A J. Factors Affecting Quantification of Total DNA by UV Spectroscopy and PicoGreen Fluorescence [J]. Agr Food Chem, 2009, 57(16)： 7221-7226.

[2] English C A, Merson S, Keer J T. Use of Elemental Analysis To Determine Comparative Performance of Established DNA Quantification Methods [J]. Anal Chem, 2006, 78(13): 4630-4633.

[3] O’Connor G, Dawson C, Woolford A，etal. Quantitation of oligonucleotides by phosphodiesterase digestion followed by isotope dilution mass spectrometry: proof of concept [J]. Anal Chem,2002(15), 74:3670-3676.

[4] Little D P, Cornish T J, O’ Donnell M J,etal. MALDI on a chip: analysis of arrays of low-femtomole to subfemtomole quantities of synthetic oligonucleotides and DNA diagnostic products dispensed by a piezoelectric pipet[J]. Anal Chem, 1997, 69(22): 4540-4546.

[5] Zhang L K, Gross M L. Matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry methods for oligodeoxynucleotides: Improvements in matrix, detection limits, quantification,and sequencing[J]. Journal of the American Society for Mass Spectrometry, 2000, 11(10): 854-865.

[6] 許 麗. 4 種阪崎腸桿菌檢測(cè)質(zhì)粒DNA 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的研制[J]. 實(shí)驗(yàn)室研究與探索，2016,35(3): 4-8.

[7] 梁 文. 轉(zhuǎn)基因大豆質(zhì)粒DNA 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的研制[J]. 實(shí)驗(yàn)室研究與探索，2016,35(5): 4-8.

[8] Lowry M, Fakayode S O, Geng M L,etal. Molecular Fluorescence, Phosphorescence, and Chemiluminescence Spectrometry [J]. Anal Chem, 2008, 80(12): 4551-4574.

[9] Oefner P J, Umlauft F, Berti G N,etal. High-Resolution Liquid Chromatography of Fluorescent Dye-Labeled Nucleic Acids[J]. Anal Biochem, 1994, 223(11): 39-46.

[10] Li P, Wang J, Gao Y H. Analysis of Fluorescent Dye-labeled Oligonucleotides by Ion-Pair Reversed-Phase High-Performance Liquid Chromatography [J]. Chin J Anal Chem, 2009, 37(12): 1722-1726.

[11] Hai F L. Study on time function revision of ICP-OES signal drift [J]. China Measurement & Test,2009, 35(2): 11-13.

[12] Liang W, Xu L, Sui Z. W. Quantification of plasmid DNA reference materials for Shiga toxin-producing Escherichia coli based on UV, HR?ICP?MS and digital PCR[J]. Chemistry Central Journal, 2016, 55(10):1-10.

[13] Olga Leclerc． Method development for genomic Legionella pneumophila DNA quantification by inductively coupled plasma mass spectrometry [J]. Analytical Biochemistry ,2013,435: 153-158．

[14] Holden M J, Rabb S A, Tewari Y B,etal. Traceable phosphorus measurements by ICP-OES and HPLC for the quantitation of DNA[J]. Anal Chem,2007, 79(3):1536-1541.

[15] JJF 1343-2012. 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)定值的通用原則及統(tǒng)計(jì)學(xué)原理[S]. 2012.

[16] ISO Guide 35. Reference materials-General and statistical principles for certification [S]. 2006.