賀 旭 葛金文 鄧?guó)P君 宋禎彥 潘愛(ài)華 嚴(yán)小新

(1 益陽(yáng)醫(yī)學(xué)高等專(zhuān)科學(xué)校解剖學(xué)教研室,益陽(yáng) 413000; 2 湖南中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合學(xué)院,長(zhǎng)沙 410208; 3 中南大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院人體解剖學(xué)與神經(jīng)生物學(xué)系,長(zhǎng)沙 410013; 4 益陽(yáng)醫(yī)學(xué)高等專(zhuān)科學(xué)校藥學(xué)系,益陽(yáng) 413000)

Sp8是鋅指轉(zhuǎn)錄家族中重要一員,可通過(guò)調(diào)控小鼠外胚層頂嵴的形成而作用于肢體生長(zhǎng)和神經(jīng)孔的閉合,胚胎神經(jīng)發(fā)生敲除 Sp8 基因可產(chǎn)生嚴(yán)重的露腦畸形[1-2]。Sp8可以用來(lái)標(biāo)記神經(jīng)祖細(xì)胞[3],Sp8沿室管膜下層呈切線遷移,由外向內(nèi)放射狀分布于大腦皮質(zhì)各層。小鼠嗅球中間神經(jīng)元產(chǎn)生需要轉(zhuǎn)錄因子Sp8的調(diào)控,基因消融Sp8后嚴(yán)重減少生長(zhǎng)激素抑制素中間神經(jīng)元的表達(dá)[4]。側(cè)腦室室管膜區(qū)(subventricle zone,SVZ)和海馬齒狀回的顆粒細(xì)胞層(SGZ)作為產(chǎn)生新生神經(jīng)元的“龕”,在內(nèi)源性因素和外界環(huán)境的干預(yù)下,不斷產(chǎn)生新的神經(jīng)元參與神經(jīng)元結(jié)構(gòu)的可塑性。SVZ區(qū)產(chǎn)生的神經(jīng)祖細(xì)胞經(jīng)過(guò)吻側(cè)遷移流到達(dá)嗅球,分化為中間神經(jīng)元[5],目前有研究指出Sp8在SVZ區(qū)廣泛表達(dá)且可調(diào)控新生神經(jīng)元的產(chǎn)生[6],并且Sp8轉(zhuǎn)錄因子也能在成年豚鼠海馬齒狀回顆粒細(xì)胞層有廣泛表達(dá),可能是該部位靜息狀態(tài)下神經(jīng)干細(xì)胞的一種標(biāo)記物[7]。隨著年齡的增加,大腦神經(jīng)源性能力逐步下降,并且在年齡相關(guān)性的神經(jīng)退行性疾病中受到損害,然而Sp8在SVZ區(qū)的表達(dá)是否受年齡的影響,以及大鼠SVZ區(qū)神經(jīng)元的表達(dá)是否受到Sp8轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控,目前尚未報(bào)道，故對(duì)此進(jìn)行研究。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

選擇1、6、12月齡的雄性健康SD大鼠各4只,由湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供。所有動(dòng)物飼養(yǎng)于室溫為23℃±1℃,相對(duì)濕度為55%的動(dòng)物房。整個(gè)實(shí)驗(yàn)程序都通過(guò)中南大學(xué)倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)。

1.2 主要實(shí)驗(yàn)儀器和試劑

珊頓冰凍切片機(jī) (Shan Don公司)；Olympus BX67熒光顯微鏡(奧林巴斯)；鼠抗Sp8(sc-104661)、羊抗Doublecortin (DCX,Santa Cruz公司,sc-8066)；兔抗膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP,Sigma-Aldrich公司,G9269)；兔抗 Ki-67(Vector公司,014-1107)。

1.3 組織學(xué)處理和實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 組織學(xué)處理 給予SD大鼠麻醉,灌注取出腦組織。4℃后固定過(guò)夜,梯度沉糖。恒低溫冰凍切片機(jī)下采用鄰切法進(jìn)行冠狀位切片,切片厚度為6μm。

1.3.2 免疫熒光單標(biāo)染色法 選取6μm切片。在搖床上PBS-T溶液輕微漂洗3次，每次5min；5%驢血清+0.1% Triton X-100磷酸鹽緩沖液室溫孵育2h；然后將腦片分別與羊抗Doublecortin (DCX，1∶1 000)，鼠抗Sp8 (1∶1000) 孵育；置于4℃冰箱過(guò)夜；室溫下復(fù)溫30min，PBS-T溶液輕微漂洗3次，每次5min；分別加入Alexa Fluor 488偶聯(lián)驢抗羊、驢抗鼠IgG (1∶200) 室溫孵育2h；PBS-T溶液漂洗3次，每次5min；雙苯酰亞胺 (1∶5000) 染核10min；PBS-T溶液漂洗3次，每次5min；貼片，50%甘油封片，熒光顯微鏡下觀察并選取SVZ區(qū)拍照。

1.3.3 免疫熒光雙標(biāo)染色法 選取6μm切片。在搖床上PBS-T溶液輕微漂洗3次,每次5min;5% 驢血清+0.1%Triton X-100磷酸鹽緩沖液室溫孵育2h;然后將腦片與以下2組抗體孵育：兔抗GFAP(1∶2000) 與鼠抗Sp8(1∶1000);兔抗Ki67(1∶1000) 與鼠抗Sp8(1∶1000)],置于 4℃冰箱過(guò)夜;室溫下復(fù)溫30min,PBS-T溶液輕微漂洗3次,每次5min;Alexa Fluor 488與Alexa Fluor 594偶聯(lián)驢抗兔、驢抗鼠IgG(1∶200) 室溫孵育2h;接下來(lái)實(shí)驗(yàn)步驟同免疫熒光單標(biāo)染色法。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 Sp8在SVZ區(qū)的表達(dá)

為了探討是否SVZ區(qū)的Sp8的表達(dá)隨著年齡的增加而遞減,在1月齡、6月齡及12月齡大鼠的SVZ區(qū)進(jìn)行免疫熒光單標(biāo)染色。Sp8在各個(gè)年齡組均有表達(dá),表達(dá)部位位于細(xì)胞的胞核(圖1，見(jiàn)封三)。在1月齡 SVZ 區(qū)Sp8表達(dá)最高,細(xì)胞密度為(6001.0±387.9)/mm2,隨著大鼠年齡的增加,Sp8細(xì)胞密度依次遞減,6月齡及12月齡的細(xì)胞密度分別為(3470.4±274.2)/mm2和(2165.6±375.9)/mm2。3個(gè)年齡組SVZ區(qū)Sp8細(xì)胞經(jīng)單因素兼組間多重比較,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.2 DCX在SVZ區(qū)的表達(dá)

DCX是一種微管相關(guān)蛋白,可作為未成熟神經(jīng)元的標(biāo)記物,代表著神經(jīng)發(fā)生的水平[8]。已有研究表明作為主要神經(jīng)發(fā)生區(qū)域之一的SVZ區(qū)在正常生理情況下可表達(dá)DCX[9],且受到外界傷害性應(yīng)激后DCX細(xì)胞可大量表達(dá)[10-12]。本研究結(jié)果顯示DCX在各個(gè)年齡組(1月齡、6月齡及12月齡)均有表達(dá),表達(dá)部位位于細(xì)胞的胞質(zhì)和突起中(圖2，見(jiàn)封三)。1月齡、6月齡及12月齡SVZ 區(qū)DCX隨著年齡的增大而依次遞減,神經(jīng)元的密度分別為(1442.2±153.3)/mm2、(1081.2±95.1)/mm2、(561.3±104.5)/mm2,各個(gè)年齡組SVZ區(qū)DCX細(xì)胞經(jīng)單因素兼組間多重比較,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.3 Sp8在SVZ區(qū)與 Ki67及GFAP細(xì)胞的共表達(dá)

目前從細(xì)胞和分子機(jī)制對(duì)哺乳動(dòng)物內(nèi)SVZ區(qū)的神經(jīng)發(fā)生進(jìn)行了一系列的研究,包括從細(xì)胞、分子活動(dòng)的有絲分裂活動(dòng)到神經(jīng)元的分化、增殖。因此開(kāi)展了Sp8與反映有絲分裂后的神經(jīng)元的分化及成熟的分子標(biāo)記物進(jìn)行了免疫熒光雙標(biāo)染色。Ki67是機(jī)體內(nèi)源性細(xì)胞增殖的標(biāo)記物,本次實(shí)驗(yàn)觀察到1月齡大鼠SVZ區(qū)Sp8與Ki67細(xì)胞均有大量表達(dá)(圖3，見(jiàn)封三),且SVZ區(qū)Sp8與Ki67的共表達(dá)細(xì)胞較為密集(圖3a，見(jiàn)封三)。GFAP是星形膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物,可能表達(dá)于神經(jīng)干細(xì)胞中或者成熟的星形膠質(zhì)細(xì)胞中。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示SVZ區(qū)1月齡大鼠SVZ區(qū)Sp8與GFAP細(xì)胞均有大量表達(dá)(圖4，見(jiàn)封三),這可能是發(fā)育早期GFAP屬于星形(B型)細(xì)胞,具有神經(jīng)干細(xì)胞的屬性。而Sp8與GFAP細(xì)胞的共表達(dá)結(jié)果顯示GFAP細(xì)胞的突起與Sp8有少量的共表達(dá)(圖4b，見(jiàn)封三)。這提示轉(zhuǎn)錄因子Sp8也參與了星形膠質(zhì)干細(xì)胞的分化。

圖1 Sp8細(xì)胞在各個(gè)年齡階段SVZ區(qū)的表達(dá)。標(biāo)尺=100μm,白色箭頭所示為Sp8細(xì)胞.
圖2 DCX細(xì)胞在各個(gè)年齡階段 SVZ 區(qū)的表達(dá)。標(biāo)尺=100μm,白色箭頭所示為DCX細(xì)胞.
圖3 1月齡大鼠SVZ區(qū)Sp8與Ki67細(xì)胞的共表達(dá)。標(biāo)尺=100μm,a為局部放大圖,Sp8與細(xì)胞內(nèi)源性增殖標(biāo)記物標(biāo)記物Ki67有大量的共表達(dá)(白色圓圈和箭頭所示).
圖4 1月齡大鼠SVZ區(qū)Sp8與GFAP細(xì)胞的共表達(dá)。標(biāo)尺=100μm,b為局部放大圖,Sp8與星形膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物GFAP有共表達(dá)(白色箭頭所示).
Fig 1 The expression of Sp8 in the SVZ at different age groups.The white arrows showed the Sp8 cells.
Fig 2 The expression of DCX in the SVZ at different age groups.The white arrows showed the DCX cells.
Fig 3 The coexpression of the Sp8 with Ki67 in the SVZ region at 1-month group.Figure a was an enlarged image and panels showed that Sp8 was intensely colocalized with the mitotic cell marker Ki67 (pointed by circles and arrows).
Fig 4 The coexpression of Sp8/GFAP in the SVZ region at 1-month group.Figure b was an enlarged image and panels showed that Sp8 was coexpressed with the astrocyte cell marker GFAP (pointed by white arrows).
Scale bar was 100μm,which was applied to the following images.

3 討論

自從“中樞神經(jīng)系統(tǒng)(腦和脊髓)的神經(jīng)干細(xì)胞可以產(chǎn)生新生神經(jīng)元替代凋亡和壞死的細(xì)胞”的學(xué)說(shuō)得到公認(rèn)之后,干細(xì)胞的運(yùn)用和開(kāi)發(fā)引起了生物學(xué)家和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的廣泛興趣。衰減干細(xì)胞的活化作用可能會(huì)減少引起腫瘤發(fā)生的惡性腫瘤細(xì)胞的分裂或者是另外一些涉及到過(guò)量的細(xì)胞增殖和分裂的條件[13-15]。另外一個(gè)方面是可能通過(guò)促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞的保存和激活對(duì)于表現(xiàn)為神經(jīng)元丟失的神經(jīng)退行性疾病及再生醫(yī)學(xué)提供一種治療方案[16-18]。鑒于此,探索和了解神經(jīng)發(fā)生區(qū)域(主要指SVZ區(qū)和SGZ區(qū))神經(jīng)干細(xì)胞的數(shù)量及去向?qū)τ诶斫庹Ｈ梭w和病理狀態(tài)下神經(jīng)元的自我更新和修復(fù)有著重要作用。

腦缺血是腦卒中的主要形式,占到發(fā)病率的60%。腦卒中是一種嚴(yán)重的腦血管疾病,常有嚴(yán)重的神經(jīng)功能后遺癥,表現(xiàn)為肢體運(yùn)動(dòng)功能下降、面部癱瘓、嘴角流涎。同時(shí)研究也發(fā)現(xiàn)這些腦卒中后的患者神經(jīng)康復(fù)某種程度與大腦相關(guān)腦區(qū)的神經(jīng)再生有關(guān)聯(lián),具體表現(xiàn)為腦創(chuàng)傷和缺血性腦卒中可以加速腦內(nèi)缺血部位和神經(jīng)發(fā)生“龕”中神經(jīng)再生能力[19-21],這種依靠腦組織自身產(chǎn)生的新生神經(jīng)元整合到被破壞的神經(jīng)功能環(huán)路中,從而發(fā)揮修補(bǔ)和重塑腦組織的作用。Sp8作為一種轉(zhuǎn)錄因子,參與調(diào)控了側(cè)腦室室管膜區(qū)新生神經(jīng)元的表達(dá)。DCX是一種微管相關(guān)蛋白,可特異性表達(dá)于未成熟和遷移神經(jīng)元,主要分布在海馬的齒狀回顆粒細(xì)胞層、側(cè)腦室室管膜區(qū)及嗅球等部位,通過(guò)調(diào)節(jié)突觸可塑性參與神經(jīng)元網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的構(gòu)建。DCX代表著神經(jīng)發(fā)生的水平[8,22],而Ki67是細(xì)胞增殖核抗原,是內(nèi)源性細(xì)胞增殖的標(biāo)記物,常用來(lái)檢測(cè)神經(jīng)干細(xì)胞有絲分裂期細(xì)胞的增殖[23]。免疫熒光單標(biāo)染色結(jié)果表明Sp8與DCX細(xì)胞在SVZ區(qū)均有表達(dá),且隨著年齡的增加神經(jīng)元的密度依次減少(P<0.05),這表明衰老是引起SVZ區(qū)神經(jīng)發(fā)生功能下降的誘導(dǎo)因素之一,并且新生神經(jīng)元下降可能是其調(diào)控因子之一的Sp8的衰減導(dǎo)致。除此之外,免疫熒光雙標(biāo)染色結(jié)果顯示1月齡大鼠SVZ區(qū)Sp8與內(nèi)源性細(xì)胞增殖標(biāo)記物Ki67有大量的共表達(dá),這說(shuō)明新生大鼠SVZ區(qū)轉(zhuǎn)錄因子Sp8參與了細(xì)胞有絲分裂期間的細(xì)胞增殖;免疫熒光雙標(biāo)染色結(jié)果表明1月齡大鼠SVZ 區(qū)存在Sp8與星形膠質(zhì)干細(xì)胞標(biāo)記物GFAP的共存,這提示轉(zhuǎn)錄因子Sp8也參與了星形膠質(zhì)干細(xì)胞的分化。

綜上所述,鋅指結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)錄因子Sp8可廣泛表達(dá)在SD大鼠的SVZ區(qū),并且隨著年齡的增加而發(fā)生衰減;除此之外,Sp8還可調(diào)控 SVZ區(qū)的神經(jīng)發(fā)生及星形膠質(zhì)干細(xì)胞的分化。

參 考 文 獻(xiàn)

[1] Bell S M,Schreiner C M,Waclaw R R,et al.Sp8 is crucial for limb outgrowth and neuropore closure[J].Proc Natl Acad Sci U S A,2003,100(21)：12195-12200.

[2] 吳俊,張雪梅,賀旭,等.Sp樣轉(zhuǎn)錄因子家族在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育與疾病中的研究進(jìn)展[J].腦與神經(jīng)疾病雜志,2014,22(2)：143-147.

[3] Zhang X M,Cai Y,Wang F,et al.Sp8 expression in putative neural progenitor cells in guinea pig and human cerebrum[J].Dev Neurobiol,2016,76(9)：939-955.

[4] Jiang X,Zhang M,You Y,et al.The production of somatostatin interneurons in the olfactory bulb is regulated by the transcription factor Sp8[J].PLoS One,2013,8(7)：e70049.

[5] 孟艷,高殿帥,蔡青,等.成年大鼠腦室下區(qū)吻側(cè)遷移流的細(xì)胞形態(tài)學(xué)研究[J].神經(jīng)解剖學(xué)雜志,2005,21(6)：576-582.

[6] 聶琰珍,田苗,劉芳.轉(zhuǎn)錄因子Sp8在成年大鼠側(cè)腦室下區(qū)新生神經(jīng)元中的表達(dá)[J].解剖學(xué)報(bào),2011,42(3)：318-322.

[7] 王芳,張雪梅,嚴(yán)小新,等.Sp8陽(yáng)性細(xì)胞在健康及放射性腦損傷豚鼠SGZ區(qū)的表達(dá)[J].腦與神經(jīng)疾病雜志,2016,24(7)：397-403.

[8] Couillard-Despres S,Winner B,Schaubeck S,et al.Doublecortin expression levels in adult brain reflect neurogenesis[J].Eur J Neurosci,2005,21(1)：1-14.

[9] 譚新杰,胡長(zhǎng)林,蔡文琴.微管相關(guān)蛋白Doublecortin在成年大鼠神經(jīng)元前體細(xì)胞發(fā)生中的表達(dá)[J].解剖學(xué)雜志,2006,29(5)：601-603.

[10] He X,Deng F J,Ge J W,et al.Effects of total saponins of Panax notoginseng on immature neuroblasts in the adult olfactory bulb following global cerebral ischemia/reperfusion[J].Neural Regen Res,2015,10(9)：1450-1456.

[11] Adamczak J,Aswendt M,Kreutzer C,et al.Neurogenesis upregulation on the healthy hemisphere after stroke enhances compensation for age-dependent decrease of basal neurogenesis[J].Neurobiol Dis,2017,99：47-57.

[12] 賀旭,葛金文,黃俊,等.三七總皂苷對(duì)全腦缺血成年大鼠側(cè)腦室室管膜區(qū)神經(jīng)再生的影響[J].中草藥,2016,47(9)：1535-1540.

[13] Sosa M S,Bragado P,Aguirre-Ghiso J A.Mechanisms of disseminated cancer cell dormancy：an awakening field[J].Nat Rev Cancer,2014,14(9)：611-622.

[14] Sosa M S,Parikh F,Maia A G,et al.NR2F1 controls tumour cell dormancy via SOX9- and RARbeta-driven quiescence programmes[J].Nat Commun,2015,6：6170.

[15] 馮軍峰,劉偉國(guó).神經(jīng)干細(xì)胞及腫瘤干細(xì)胞與腦腫瘤發(fā)生關(guān)系的研究[J].國(guó)外醫(yī)學(xué).神經(jīng)病學(xué)神經(jīng)外科學(xué)分冊(cè),2005,32(2)：167-170.

[16] Choi S S,Lee S R,Kim S U,et al.Alzheimer’s disease and stem cell therapy[J].Exp Neurobiol,2014,23(1)：45-52.

[17] Kim S U,Lee H J,Park I H,et al.Human nerual stem cells for brain repair[J].Int J Stem Cells,2008,1(1)：27-35.

[18] 招遠(yuǎn)祺,喬利軍,袁龍健,等.從神經(jīng)干細(xì)胞角度探索中醫(yī)藥介入中樞神經(jīng)再生的研究策略[J].中國(guó)中醫(yī)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)雜志,2015,21(7)：915-918.

[19] 侯鐵軍,程焱.缺血性腦損傷與神經(jīng)干細(xì)胞的再生[J].中國(guó)卒中雜志,2007,2(4)：367-371.

[20] Lin R,Cai J,Nathan C,et al.Neurogenesis is enhanced by stroke in multiple new stem cell niches along the ventricular system at sites of high BBB permeability[J].Neurobiol Dis,2015,74：229-239.

[21] Jin K,Minami M,Lan J Q,et al.Neurogenesis in dentate subgranular zone and rostral subventricular zone after focal cerebral ischemia in the rat[J].Proc Natl Acad Sci U S A,2001,98(8)：4710-4715.

[22] Francis F,Koulakoff A,Boucher D,et al.Doublecortin is a developmentally regulated,microtubule-associated protein expressed in migrating and differentiating neurons[J].Neuron,1999,23(2)：247-256.

[23] Sibbe M,Kuner E,Althof D,et al.Stem- and progenitor cell proliferation in the dentate gyrus of the reeler mouse[J].PLoS One,2015,10(3)：e119643.