師 亮 陳 浩,2△ 崔慧林 張皓潔 郝躍亭

(1 山西醫(yī)科大學(xué)組織學(xué)胚胎學(xué)教研室,太原 030001; 2 山西醫(yī)學(xué)科學(xué)院,山西醫(yī)科大學(xué)附屬大醫(yī)院,太原 030026)

腫瘤細(xì)胞誘導(dǎo)的血管新生是大多數(shù)惡性腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移的前提[1]。越來(lái)越多的研究表明血管新生與多發(fā)性骨髓瘤(multiple myeloma,MM)發(fā)生、發(fā)展、惡化及預(yù)后密切相關(guān)[2]。目前以反應(yīng)停為代表的抗血管新生藥物應(yīng)用于難治復(fù)發(fā)性骨髓瘤的臨床治療,并取得較好療效,提示以抗血管新生為靶點(diǎn)的治療已成為治療難治復(fù)發(fā)骨髓瘤重要著眼點(diǎn)。青蒿琥酯(artesunate,ART)是世界上廣泛采用的抗瘧藥青蒿素的衍生物。本課題組前期研究表明青蒿琥酯具有明顯抗骨髓瘤活性,能誘導(dǎo)骨髓瘤細(xì)胞凋亡、抑制骨髓瘤生長(zhǎng)[3]。本實(shí)驗(yàn)繼續(xù)研究青蒿琥酯在MM細(xì)胞促血管新生效應(yīng)中的作用及其機(jī)制,尋找青蒿琥酯在MM治療中的理論依據(jù)。

1 材料和方法

1．1 實(shí)驗(yàn)材料

青蒿琥酯由南藥桂林有限公司提供,產(chǎn)品編號(hào)H10930195,臨用前加5%NaHCO3注射液溶解。骨髓瘤RPMI-8226細(xì)胞由中科院上海細(xì)胞生物學(xué)研究所提供。蛋白提取試劑盒、BCA蛋白濃度檢測(cè)試劑盒購(gòu)于上?？党缮锕?全部抗體購(gòu)于美國(guó)Santa Cruz公司。

1．2 MTT實(shí)驗(yàn)

人骨髓瘤RPMI-8226細(xì)胞用RPMI1640培養(yǎng)基培養(yǎng)于37℃二氧化碳培養(yǎng)箱。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的人骨髓瘤RPMI-8226細(xì)胞,經(jīng)胰酶消化后,調(diào)細(xì)胞濃度為2×105/ml,用96孔板接種,每孔加200μl細(xì)胞懸液。分別以終濃度為0、2.5、5、10、20、40μmol/L和80μmol/L的青蒿琥酯處理為實(shí)驗(yàn)組;加入等體積的DMSO為陰性對(duì)照。共計(jì)8個(gè)組,每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。培養(yǎng)24、48h后,MTT比色法測(cè)定。終止反應(yīng)前4h,每孔加入5g/ml的MTT 20μl繼續(xù)培養(yǎng)4h,小心吸去孔內(nèi)液體,然后加入200μl DMSO,振蕩使結(jié)晶物充分溶解,選擇570nm波長(zhǎng),測(cè)定各孔光吸收值。采用下列公式計(jì)算細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率：生長(zhǎng)抑制率(%)=(1-試驗(yàn)孔A570/對(duì)照孔A570) ×100%,并據(jù)此,采用IC50計(jì)算軟件計(jì)算青蒿琥酯對(duì)RPMI-8226細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度(IC50)。

1．3 雞胚絨毛尿囊膜血管生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)

將RPMI-8226細(xì)胞放入RPMI1640培養(yǎng)48h后,反復(fù)沖洗5次,另用無(wú)血清1640培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)4h,收集細(xì)胞并調(diào)細(xì)胞濃度至1×106/ml,培養(yǎng)24h后備用。臺(tái)盼蘭拒染實(shí)驗(yàn)顯示RPMI-8226細(xì)胞的活力>95%。將雞胚培養(yǎng)4d后,開(kāi)窗暴露近氣室處的接種部位,繼續(xù)孵化24h,分組進(jìn)行如下處理：(1) 陰性對(duì)照組，無(wú)菌將僅含RPMI1640培養(yǎng)液的可吸收海綿放于雞胚絨毛尿囊膜,海綿大小約1mm3;(2) RPMI-8226組，在孵化第6天,無(wú)菌將浸有100μl 5×106RPMI-8226細(xì)胞懸液的海綿放于雞胚絨毛尿囊膜;(3) 青蒿琥酯處理組，將部分(2)組雞胚在第8天取出,給予3、6μmol/L 或12μmol/L的青蒿琥酯處理。雞胚接種后均需無(wú)菌封口,垂直放置在溫箱繼續(xù)孵育直至第12天,收集各組雞胚絨毛尿囊膜標(biāo)本。部分標(biāo)本留于免疫蛋白印跡進(jìn)一步實(shí)驗(yàn);其余標(biāo)本用固定液(甲醇、丙酮等比混合液)處理,在解剖顯微鏡下觀察并拍照,參考田氏法[4],計(jì)數(shù)接種區(qū)5mm范圍內(nèi)的血管數(shù)目,并按照以下公式計(jì)算：

1．4 免疫蛋白印跡檢測(cè)

將1．3實(shí)驗(yàn)中收集到的部分雞胚絨毛尿囊膜標(biāo)本通過(guò)蛋白抽提試劑盒提取總蛋白,BCA檢測(cè)法測(cè)定蛋白濃度。蛋白定量后,行SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳,半干式轉(zhuǎn)移至NC膜,切取目標(biāo)條帶,分別加對(duì)應(yīng)一抗血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)(1∶800)、血管緊張素1 (angiopoietin-1,Ang-1)(1∶150)或β-actin(1∶1000)抗體,4℃孵育過(guò)夜。次日反復(fù)沖洗3次,分別加對(duì)應(yīng)二抗室溫孵育2h,底物化學(xué)發(fā)光ECL法顯影,凝膠圖像處理系統(tǒng)分析目標(biāo)帶光密度值。

1．5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2．1 青蒿琥酯對(duì)RPMI-8226細(xì)胞增殖的影響

青蒿琥酯以劑量依賴和時(shí)間依賴的方式抑制RPMI-8226細(xì)胞增殖。隨著青蒿琥酯濃度增加或者作用時(shí)間延長(zhǎng),其細(xì)胞增殖抑制作用逐漸增強(qiáng)(圖1)。藥物作用24h和48h后,其IC50值分別為(36.33±2.65) μmol/L和(14.31±3.28) μmol/L。

圖1 青蒿琥酯對(duì)RPMI-8226細(xì)胞的增殖抑制作用Fig 1 The proliferation inhibition effect of artesunate

2．2 青蒿琥酯對(duì)RPMI-8226細(xì)胞誘導(dǎo)血管新生的影響

RPMI-8226細(xì)胞組呈很強(qiáng)的血管新生刺激能力,眾多新生微血管以海綿為中心呈放射狀排列。與陰性對(duì)照組(圖2A)相比,RPMI-8226細(xì)胞組新生血管密度明顯增大,血管分支明顯增多,血管管徑也增粗(圖2B,箭頭)。經(jīng)過(guò)12μmol/L青蒿琥酯處理后,其血管新生刺激能力明顯減弱,新生血管的密度和分支減少,管徑也變細(xì)(圖2C,箭頭)。與單純RPMI-8226細(xì)胞組相比,3、6、12μmol/L青蒿琥酯處理組新生血管數(shù)目分別減少21.9%、38.2%和76.9%(P<0.05)(圖2D)。

2．3 青蒿琥酯對(duì)雞胚絨毛尿囊膜中VEGF和Ang-1蛋白表達(dá)的影響

免疫印跡檢測(cè)雞胚絨毛尿囊膜中VEGF和Ang-1蛋白表達(dá),與單純RPMI-8226細(xì)胞組相比,青蒿琥酯處理組雞胚絨毛尿囊膜中VEGF含量分別下降22.2%、34.2%和52.6%(P<0.01);Ang-1蛋白表達(dá)量分別下降15.6%、24.2% 和39.6%(P<0.05)(圖3)。

3 討論

青蒿素類藥物是從傳統(tǒng)中草藥黃花蒿中分離得到的有效成分,用于瘧疾治療已有上千年歷史,其高效低毒的效應(yīng)得到全世界肯定。青蒿琥酯是青蒿素的可溶性衍生物,其在水中的溶解程度和對(duì)瘧原蟲的作用強(qiáng)于青蒿素。同時(shí)其表現(xiàn)出的抗腫瘤活性也越來(lái)越引起關(guān)注[5]。已經(jīng)證實(shí)青蒿琥酯可以加速癌細(xì)胞DNA損傷,阻滯細(xì)胞周期,調(diào)節(jié)鐵產(chǎn)生自由基,改變腫瘤的保護(hù)性免疫抑制,對(duì)多種實(shí)體腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)具有抑制效應(yīng)[5]。本課題組前期實(shí)驗(yàn)表明青蒿琥酯可有效抑制骨髓瘤細(xì)胞增殖,并誘導(dǎo)其凋亡[3]。本研究首先觀察青蒿琥酯對(duì)人骨髓瘤RPMI-8226細(xì)胞增殖的影響,結(jié)果顯示青蒿琥酯亦呈劑量和時(shí)間依賴方式抑制人骨髓瘤RPMI-8226細(xì)胞生長(zhǎng)。近年來(lái)有數(shù)例青蒿琥酯抗腫瘤血管新生作用的報(bào)道。體外研究顯示青蒿琥酯可減少K562白血病細(xì)胞表達(dá)VEGF,對(duì)其誘導(dǎo)的血管新生具有抑制作用[7]?，F(xiàn)就青蒿琥酯對(duì)人骨髓瘤細(xì)胞體內(nèi)誘導(dǎo)血管新生進(jìn)行研究,以進(jìn)一步明確青蒿琥酯抗骨髓瘤作用機(jī)制。

圖2 青蒿琥酯對(duì)各組雞胚絨毛尿囊膜血管新生的影響Fig 2 The effect of artesunate on angiogenesis of chick embryo chorioallantoic membranes in each group (n=11,A: Negative control group; B: RPMI-8226 cells group; C: 12μmol/L artesunate treatment group; D: Statistical analysis.**P<0.01 vs negative control group； #P<0.05,##P<0.01 vs RPMI-8226 cells group

圖3 各組雞胚絨毛尿囊膜中VEGF和Ang-1蛋白含量Fig 3 The VEGF and Ang-1 protein content of chick chorioallantoic membrane in each group (n=3,**P<0.01 vs negative control group; #P<0.05,##P<0.01 vs RPMI-8226 cell group

據(jù)報(bào)道青蒿素衍生物在15～180μmol/L范圍內(nèi)具有抑制腫瘤細(xì)胞增殖能力[8];本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示青蒿琥酯作用于RPMI-8226細(xì)胞24h和48h后,其IC50值分別為(36.33±2.65) μmol/L和(14.31±3.28) μmol/L。本研究選取3、6μmol/L和12μmol/L 3個(gè)較低濃度,觀察低濃度青蒿琥酯對(duì)RPMI-8226細(xì)胞誘導(dǎo)的血管新生有無(wú)影響。體內(nèi)雞胚尿囊膜血管生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：與單純RPMI-8226細(xì)胞組相比,經(jīng)過(guò)青蒿琥酯處理后新生血管密度和分支顯著下降,管徑也明顯變細(xì)。提示青蒿琥酯具有抑制RPMI-8226骨髓瘤細(xì)胞誘導(dǎo)血管新生的作用。而新生血管減少又進(jìn)一步減弱RPMI-8226細(xì)胞增殖能力。結(jié)合本課題組前期發(fā)表的實(shí)驗(yàn)結(jié)果[3],筆者認(rèn)為青蒿琥酯一方面可干擾骨髓瘤細(xì)胞分化增殖;另一方面還對(duì)骨髓瘤血管新生具有抑制作用。其作用的機(jī)制可能與調(diào)節(jié)血管新生調(diào)控因子表達(dá)有關(guān)[9]。

多種細(xì)胞因子可調(diào)控血管新生,其中VEGF和Ang-1相互配合協(xié)調(diào),在血管形成過(guò)程中起主要作用[10]。經(jīng)典的促血管生長(zhǎng)因子——VEGF專一作用于血管內(nèi)皮,促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖,數(shù)量增多;Ang-1則是近年發(fā)現(xiàn)的另一促血管新生因子,其也對(duì)血管內(nèi)皮具有專一性,可特異性結(jié)合內(nèi)皮細(xì)胞表面受體,延長(zhǎng)內(nèi)皮細(xì)胞壽命,促使其出芽,與VEGF相互協(xié)調(diào),促進(jìn)血管發(fā)生和成熟。本課題組前期的臨床研究也證實(shí)骨髓瘤患者體內(nèi)高表達(dá)的Ang-1和VEGF水平是其骨髓微血管密度升高的重要原因[11]。為進(jìn)一步明確青蒿琥酯抗血管新生的機(jī)制,本實(shí)驗(yàn)對(duì)體內(nèi)血管新生實(shí)驗(yàn)中雞胚尿囊膜進(jìn)行VEGF和Ang-1蛋白含量檢測(cè),結(jié)果顯示經(jīng)青蒿琥酯處理后,血管生成減少同時(shí)伴有VEGF和Ang-1蛋白含量降低。提示青蒿琥酯對(duì)MM細(xì)胞誘導(dǎo)的血管新生抑制效應(yīng)可能與VEGF和Ang-1表達(dá)降低有關(guān)。青蒿琥酯對(duì)人骨髓瘤RPMI-8226細(xì)胞VEGF和Ang-1表達(dá)的抑制效應(yīng)可能是其抑制RPMI-8226細(xì)胞誘導(dǎo)血管新生的重要作用機(jī)制。

參 考 文 獻(xiàn)

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