魏玉珍 張藝宏 楊信志 林蕓秀△

(福建醫(yī)科大學,1 基礎醫(yī)學院人體解剖學與組織學胚胎學系,福州 350122;2 附屬漳州市醫(yī)院生殖醫(yī)學科,漳州 363000)

子宮內(nèi)膜修復異常會導致多種嚴重疾病乃至不孕,臨床常見與內(nèi)膜修復障礙相關的疾病如產(chǎn)后月經(jīng)不調(diào)、子宮內(nèi)膜異位癥等,其病因和發(fā)病機制尚不明確。已知Wnt信號通路對多種器官組織[1-3]的損傷修復起重要調(diào)控作用。β-catenin是此信號通路核心分子,通路激活時,Wnt蛋白通過與受體結合,導致β-catenin 的磷酸化降解過程受抑制,在細胞質(zhì)中累積并轉(zhuǎn)移入核內(nèi),與轉(zhuǎn)錄因子TCF/LEF結合,啟動靶基因的轉(zhuǎn)錄,從而調(diào)控細胞生長和增殖。近年來研究表明Wnt信號通路可能也在子宮內(nèi)膜修復中扮演重要角色,但相關研究甚少,作用機制尚未闡明。有文獻報道Wnt信號通路的激活劑氯化鋰可以促進雌激素誘導的小鼠子宮內(nèi)膜增生[4],單獨使用氯化鋰也可以促進移植入去卵巢(ovariectomy,OVX)裸鼠腎囊中的人子宮內(nèi)膜上皮細胞增生,與雌激素效果類似[5],表明Wnt信號通路激活可以促進子宮內(nèi)膜增生。此外有研究表明經(jīng)典Wnt信號通路對子宮內(nèi)膜間充質(zhì)干細胞增殖分化至關重要,參與內(nèi)膜的修復過程,干預Wnt信號通路將影響內(nèi)膜修復進程[6]。CD146作為間質(zhì)干細胞的表面標志之一,已用于分離和鑒定人子宮內(nèi)膜間充質(zhì)干細胞[7]。目前尚未見子宮內(nèi)膜蛻膜化損傷修復中β-catenin及CD146表達情況的報道。本研究擬采用子宮內(nèi)膜修復模型觀察β-catenin以及CD146的時空表達,探討Wnt信號通路與子宮內(nèi)膜干細胞在內(nèi)膜修復中的作用。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

6～8周齡ICR小鼠,體質(zhì)量20～30g,購自上海吳氏動物中心(合格證2007000542785許可證SCXK(滬)2007-0005)。恒溫25℃,光照14h,黑暗10h,自由飲水和攝食。

1.2 主要試劑

Active β-catenin抗體 (德國默克密理博公司); CD146抗體(Abcam公司);超敏二步法免疫組織化學檢測試劑盒(北京中杉生物科技公司);RNA抽提試劑(RNAiso Plus);逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(PrimeScriptTMRT reagent kit);實時熒光定量PCR試劑盒(SYBR Premix Ex Taq II)均購自大連寶生物公司。

1.3 子宮內(nèi)膜修復模型的建立

將雌鼠與雙側(cè)輸精管結扎并證實不育的雄鼠合籠,次晨檢查陰栓,以見栓時記為假孕第0.5天。第3.5 天于一側(cè)子宮角內(nèi)用微量進樣器注射20μl無菌花生油誘導蛻膜化,另一側(cè)僅針刺不注油作對照。第5.5天(即注油后48h)切除雙側(cè)卵巢。分別于去卵巢后0、24、48、72、96h處死,取子宮角用4%多聚甲醛固定做免疫組織化學檢測,另取部分于液氮凍存做qRT-PCR檢測。每組3只。

1.4 免疫組織化學檢測

子宮組織石蠟包埋,作4μm連續(xù)切片,檸檬酸緩沖液高壓熱修復,一抗4℃孵育過夜,PBS漂洗后滴加二抗,DAB顯色,中性樹膠封片,顯微鏡下觀察。各組每只小鼠隨機取3張切片,每張切片在子宮內(nèi)膜隨機選取5個高倍視野拍照,應用Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件系統(tǒng),將5個視野積分光密度值IOD和面積分別相加,計算每張切片平均積分光密度(IOD/面積)。

1.5 β-catenin mRNA qRT-PCR檢測

用RNAiso Plus提取各組注油側(cè)和非注油側(cè)子宮組織總RNA,逆轉(zhuǎn)錄成第一鏈cDNA,以GAPDH為內(nèi)參,用熒光定量PCR儀(ABI PRISM 7500)進行實時熒光定量PCR擴增。引物序列為GAPDH上游5′-GGT GAAGGTCGGTGTGAACG-3′,下游5′-CTCGCTCC TGGAAGATGGTG-3′,產(chǎn)物233bp;β-catenin上游5′-CCACAGGATTACAAGAAGCG-3′,下游5′CACC AGAGTGAAAAGAACGG 3′,產(chǎn)物145bp。反應條件：94℃預變性 2min;94℃變性30s,退火延伸(GAPDH 64℃,β-catenin 60℃)30s,72℃延伸30s,35循環(huán)。每個實驗重復3次。用2-△△CT法對樣本基因進行相對定量分析,以各組非注油側(cè)為參照,注油側(cè)為待測樣本,經(jīng)內(nèi)參GAPDH校準后得出各組注油側(cè)β-catenin mRNA相對表達量。

1.6 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 22.0 統(tǒng)計軟件進行單因素方差分析,采用LSD-t檢驗(以P<0.05 為差異有統(tǒng)計學意義)進行組間兩兩比較,并用Origin 8.0軟件作圖。

2 結果

2.1 active β-catenin蛋白在小鼠子宮內(nèi)膜修復過程中的時空表達

誘導蛻膜化去卵巢后0h,注油側(cè)子宮內(nèi)膜明顯增厚,出現(xiàn)廣泛蛻膜化反應,基質(zhì)細胞肥大,胞核亦增大,毛細血管增多,腺體減少,主要分布于近肌層,內(nèi)膜未見明顯陽性染色。24h,已發(fā)生蛻膜化的基質(zhì)細胞變性凋亡,體積變小,核小而深染,部分內(nèi)膜壞死并從近肌層處剝脫,蛋白主要表達在壞死內(nèi)膜的周邊、肌層細胞中。48h,壞死的蛻膜化組織已完全分離排出,子宮內(nèi)膜開始修復并明顯增厚,腺體增多,蛋白在子宮腔面、近腔側(cè)基質(zhì)及腺上皮中廣泛表達并達高峰。72h,蛋白主要表達于腔上皮、腺上皮,陽性水平下降,96h亦稍下降,蛋白主要表達于腔上皮、腺上皮中,基質(zhì)極少陽性。未注油側(cè)子宮中,蛋白陽性水平較低(表1，圖1，見封二)。

2.2 CD146蛋白在小鼠子宮內(nèi)膜修復過程中的時空表達

誘導蛻膜化去卵巢后0h,陽性染色主要分布在血管內(nèi)皮,基質(zhì)細胞極少陽性。24h,內(nèi)膜壞死,血管破壞,陽性水平稍下降,但基質(zhì)細胞陽性表達增多。48h,陽性明顯增加并達高峰,主要分布于近腔側(cè)的基質(zhì)中。72h開始下降,主要分布在新形成的腺上皮周圍基質(zhì)及部分腺上皮中。96h仍稍下降,陽性細胞散在分布于內(nèi)膜基質(zhì)。未注油側(cè)子宮中,蛋白陽性水平較低(表1，圖1，見封二)。

圖1 去卵巢不同時間子宮內(nèi)膜active β-catenin和CD146免疫組織化學顯色Fig 1 Immunohistochemical staining of active β-catenin and CD146 in the endometrium at different time points after OVXA1-E1：Active β-catenin detection of uterus treated with oil injection 0,24,48,72h and 96h after OVX; F1：Control side without oil injection.A2-E2：CD146 detection of uterus treated with oil injection 0,24,48,72h and 96h after OVX; F2：Control side without oil injection.A-F：×100,bar=200μm; A′-F′：×400,bar=50μm.c：Uterine cavity; g：Uterine gland; bv：Blood vessel

2.3 β-catenin mRNA的表達

qRT-PCR 檢測結果顯示β-catenin mRNA相對表達量與0h相比,24h無明顯變化,從48h開始略升高(P<0.01),72h達最高(P<0.01),96h稍下降(P<0.05)(表1)。

表1 去卵巢不同時間子宮內(nèi)膜 active β-catenin、CD146蛋白平均光密度值(IOD/面積)和β-catenin mRNA相對表達量Tab 1 IOD/area of active β-catenin and CD146 and relative expression of β-catenin mRNA in the endometrium at different time points after OVX (n=3,

**P<0.01vsother groups;△△P<0.01vs0h;##P<0.01vs24h;□P<0.05vs72h

3 討論

最早由Finn等[8]建立的小鼠子宮模擬月經(jīng)模型為研究子宮內(nèi)膜修復提供了較好的實驗模型,后經(jīng)過其他學者的改進[9],以此為基礎,本研究稍作了改良,在假孕狀態(tài)下宮腔注射花生油誘導內(nèi)膜蛻膜化反應后切除卵巢使蛻膜化組織脫落,模擬月經(jīng)過程并研究在無雌、孕激素作用下子宮內(nèi)膜的修復過程。結果顯示,假孕鼠宮腔注射花生油48h后子宮內(nèi)膜出現(xiàn)廣泛的蛻膜化改變。而在去卵巢24h后,內(nèi)膜由于缺乏孕激素支持出現(xiàn)壞死、剝脫,內(nèi)膜間質(zhì)很薄。去卵巢48h,壞死的內(nèi)膜組織已完全剝離,同時開始增生修復,部分腔上皮長出,內(nèi)膜間質(zhì)明顯增厚。至96h修復基本完成,表明本實驗模型成功模擬了子宮內(nèi)膜蛻膜化、壞死剝脫、增生修復的類月經(jīng)過程。在此過程中,active β-catenin呈現(xiàn)不同的時空表達。active β-catenin是去磷酸化的β-catenin,是β-catenin的活性形式,不被Axin/GSK3β/APC復合體降解,可在胞質(zhì)蓄積并轉(zhuǎn)入胞核與TCF/LEF轉(zhuǎn)錄因子形成復合物,轉(zhuǎn)錄大量靶基因。本研究結果顯示,當內(nèi)膜出現(xiàn)蛻膜化改變時,active β-catenin陽性極弱,可能因為此時基質(zhì)細胞大部分出現(xiàn)蛻膜化,有文獻報道,子宮內(nèi)膜分泌期孕酮可通過抑制Wnt信號通路從而抑制基質(zhì)細胞增生并誘導其分化為蛻膜細胞[10]。去卵巢24h內(nèi)膜壞死、剝脫,此時蛋白開始在壞死內(nèi)膜中檢測到,且鄰近剝脫面的基底層內(nèi)膜陽性明顯,可能是由于Wnt信號通路開始激活,隨后內(nèi)膜開始增生修復。48h,內(nèi)膜厚度明顯增加,蛋白陽性較強,主要集中于子宮腔面及近腔基質(zhì)中,可能與腔上皮首先修復以及近腔側(cè)內(nèi)膜基質(zhì)增生有關。72h,隨著內(nèi)膜修復接近完成,蛋白表達開始下降,主要位于新形成的較扁平的腺上皮及周圍基質(zhì)細胞。96h,內(nèi)膜修復基本完成,蛋白繼續(xù)下降,主要分布于腔上皮和腺上皮,間質(zhì)少見。綜上所述,隨著內(nèi)膜的修復進程,active β-catenin蛋白表達出現(xiàn)了先升高后下降的改變,而它是Wnt信號通路的核心分子,表明Wnt信號通路可能參與了內(nèi)膜的修復進程。有學者報道[11],β-catenin能調(diào)節(jié)子宮內(nèi)膜上皮的分化,介導腺體形成,其持續(xù)激活將導致小鼠子宮內(nèi)膜過度增生,腺體增多增大,甚至產(chǎn)生基質(zhì)細胞瘤[12]。而條件性敲除β-catenin導致腺體減少[11]。本研究結果顯示β-catenin在修復后期主要分布于腺體形成的部位,間接印證了前人的結果,預示其在腺體形成中的作用,但仍需今后進一步探討。而β-catenin mRNA相對表達量從48h開始略升高,72h最高,96h稍下降,與蛋白表達水平變化不完全相符,可能是由于本實驗檢測的是活性β-catenin,隨著內(nèi)膜修復逐漸完成可能Wnt通路活性下降,表現(xiàn)為部分β-catenin 蛋白被磷酸化降解導致活性β-catenin減少,并且子宮組織β-catenin mRNA相對表達量變化的幅度不大,最高僅達2倍左右,也許并沒有很大的生物學意義。在許多情況下,蛋白表達和RT-PCR的結果不一致,可能是由于存在非編碼RNA調(diào)節(jié)蛋白的翻譯過程,導致雖然mRNA表達增加,而蛋白表達不增加,本實驗是否存在這一情況尚待進一步驗證。本研究還觀察到切除卵巢后,內(nèi)膜仍然可以增生修復,表明子宮內(nèi)膜修復可以不依賴于雌、孕激素的作用,這與前人報道相似[13]。

在組織損傷修復中,干細胞起重要作用,已證實子宮內(nèi)膜也存在成體干細胞。CD146主要表達在血管內(nèi)皮細胞、周細胞,能提高細胞增殖活性,促進血管增生,是骨髓間充質(zhì)干細胞的表面標志[14]。CD146在胚胎時期血管發(fā)育和腫瘤血管發(fā)生中起重要作用[15]。Schwab等[16]利用CD146及血小板源性生長因子受體β(PDGF-Rβ)兩種血管周圍細胞標志物在子宮內(nèi)膜的共表達,顯示CD146、PDGF-Rβ陽性的細胞具有間充質(zhì)干細胞的特性,具有顯著的克隆形成能力和多向分化潛能,因此把CD146、PDGF-Rβ作為內(nèi)膜間充質(zhì)干細胞的表面標志。Fayazi等[17]證實CD146陽性細胞分布于人子宮內(nèi)膜基質(zhì)血管周圍,臨近子宮腺。近期有報道內(nèi)膜間充質(zhì)干細胞在內(nèi)膜的功能層和基底層均有分布,在月經(jīng)期被激活,參與內(nèi)膜周期性修復過程[18],而且干細胞因子可刺激分離的人子宮內(nèi)膜CD146陽性細胞增殖[19]。

本研究結果顯示CD146在小鼠子宮內(nèi)膜修復過程中的時空表達規(guī)律與β-catenin相似,也出現(xiàn)了先升高后下降的改變,修復后期內(nèi)膜基質(zhì)中CD146陽性細胞明顯減少,可能是由于部分內(nèi)膜間充質(zhì)干細胞分化為間質(zhì)細胞,失去干細胞表面標志所致。Barragan等[20]早前也報道內(nèi)膜間充質(zhì)干細胞在體外分化為內(nèi)膜間充質(zhì)細胞的過程中失去CD146陽性標記。綜上提示W(wǎng)nt信號通路可能參與了內(nèi)膜的修復進程,且可能與CD146陽性的內(nèi)膜間充質(zhì)干細胞有關。但其機制還需進一步探討。

參 考 文 獻

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