劉 祥 金昌洙 韓鋒產(chǎn)

(濱州醫(yī)學院,1 山東省醫(yī)藥衛(wèi)生耳科遺傳病重點實驗室,2 生物化學與分子生物學教研室,3 人體解剖學教研室,煙臺 264003)

年齡相關(guān)性聽力損失(age-related hearing loss,AHL)即增齡性聾,是聽覺器官隨著年齡的增加而退變,出現(xiàn)雙耳對稱性、漸進性聽力減退,是由環(huán)境因素和基因變異導致的復雜的病理學改變[1]。AHL是人群中最為常見的聽覺系統(tǒng)疾病之一,影響著全球數(shù)千萬人的生活[2]。DBA/2J小鼠是研究AHL常用的動物模型,其聽力受損發(fā)生較早且呈漸進性。掃描電鏡在DBA/2J小鼠成年周齡之前毛細胞靜纖毛的研究中應用相對較少。Shin等[3]報道了DBA/2J小鼠1月齡到6月齡的掃描電鏡低倍鏡下可見底回毛細胞靜纖毛出現(xiàn)漸進性丟失,但并未報道高倍鏡下單個毛細胞靜纖毛的病變過程;Perrin等[4]報道了DBA/2J小鼠5周齡時耳蝸底回到頂回外毛細胞靜纖毛長度的改變,但并未詳細觀察其他周齡的底回外毛細胞靜纖毛的變化情況。本研究通過掃描電鏡觀察低周齡DBA/2J小鼠耳蝸毛細胞頂端的纖毛的超微形態(tài)結(jié)構(gòu)變化,旨在探討早發(fā)性聽力受損的病因及其機制。

1 材料和方法

1.1 動物及試劑

選購DBA/2J小鼠15只(南京大學—南京生物醫(yī)藥研究院),將雌雄小鼠按照2∶1比例合籠。待新生小鼠周齡達到2、4周齡和8周齡時,每個周齡隨機取6只小鼠并使用1%戊巴比妥鈉(0.25ml/kg)腹腔注射麻醉后進行聽力測試及內(nèi)耳耳蝸取材。1%戊巴比妥鈉(北京普博斯生物);2.5%戊二醛及1%鋨酸(濱州醫(yī)學院醫(yī)藥研究中心電鏡室提供);EDTA Na2(北京索萊寶)。

1.2 腦干誘發(fā)電位(auditory brainstem response,ABR)測試小鼠聽力

將小鼠麻醉后置于隔音室(可屏蔽電場和磁場),并置于加熱墊上(維持體溫在37℃～38℃),使用腦干誘發(fā)電位儀(Miami,美國)測試小鼠聽力。信號采集細針電極分別插到小鼠頭頂、右耳腹側(cè)和左耳腹側(cè)的皮下。檢測刺激頻率分別為click(復合音)、8、16kHz以及32kHz時的ABR閾值。

1.3 內(nèi)耳-耳蝸標本處理

小鼠麻醉后在立體顯微鏡(S6D型,萊卡,德國)下解剖顳骨,取出完整的內(nèi)耳。參照 Men等[5]及孫建和等[6]的耳蝸掃描電鏡樣本制作方法,將取出的內(nèi)耳用2.5%戊二醛中4℃固定并過夜后用10% EDTA-Na2于室溫下脫鈣16h。修剪內(nèi)耳耳蝸基底膜使毛細胞暴露完全并置于0.1mol/L PBS中清洗過夜。第3天,1%鋨酸后固定40min再進行梯度乙醇脫水。CO2臨界點干燥后在真空離子噴濺儀中(Q 150R S型,Quorum,英國)噴金鍍膜15～20nm。最后將樣品放入掃描電鏡高真空觀察艙內(nèi)等待觀察。

1.4 掃描電鏡觀察

將制備好的耳蝸樣品在掃描電鏡(EVO MA 15/LS型,卡爾蔡司,德國)下觀察。分別采集連續(xù)3個視野下的×600、×2000以及×10000鏡下放大的掃描電鏡圖片。

1.5 統(tǒng)計學處理

2 結(jié)果

2.1 ABR測試

結(jié)果顯示,DBA/2J小鼠聽力閾值呈現(xiàn)漸進性升高,表明其聽力受損逐漸加重(圖1)。ABR閾值水平高于55(click)、40(8kHz)、35(16kHz) 或60(32kHz) dB SPL時認為有聽力受損。早在4周齡,DBA/2J小鼠在各個音頻刺激下均出現(xiàn)聽力受損;8周齡時,無論click(復合音)刺激還是短純音刺激下其ABR閾值均高于60dB SPL(60～80dB SPL為中級聽力受損)。

2.2 掃描電鏡觀察

2.2.1 2周齡時靜纖毛總體排列尚且規(guī)則 2周齡小鼠靜纖毛排列規(guī)則,沒有出現(xiàn)纖毛束的缺失。在600倍鏡下,2整個耳蝸底回靜纖毛排列規(guī)則,可見外毛細胞(out hair cells,OHC)靜纖毛呈倒“V”型3行或者4行排列,內(nèi)毛細胞(inner hair cells,ZHC)靜纖毛呈單行排列(圖2A)。

2.2.2 纖毛束出現(xiàn)融合變化 在2000倍鏡下,2周齡的DBA/2J小鼠OHC靜纖毛已出現(xiàn)部分纖毛束的融合病變,單根纖毛束之間的界限變模糊,甚至有的數(shù)根纖毛融合成團塊狀或者球狀,在掃描電鏡下為高亮的點狀(圖2B)。纖毛束在4周齡時融合更為嚴重,電鏡下可見大面積的纖毛束呈團塊狀高亮區(qū)(圖2C)。同樣IHC靜纖毛也表現(xiàn)出類似的變化,纖毛束出現(xiàn)球狀融合(氣球樣變)(圖2B、C)。

圖1 聽覺腦干反應平均閾值的時間變化曲線(n=6)Fig 1 Time curves of mean ABR thresholds (n=6)

2.2.3 纖毛束出現(xiàn)軟化 2周齡的DBA/2J小鼠OHC靜纖毛已出現(xiàn)纖毛束的軟化,但未見纖毛束的倒伏。在10000倍鏡下顯示小鼠OHC靜纖毛上端軟化,部分纖毛束出現(xiàn)彎曲,但未出現(xiàn)整體纖毛束的倒伏;IHC靜纖毛除了纖毛束的無規(guī)律排布和部分融合外未見明顯軟化彎曲(圖2E)。

2.2.4 纖毛束出現(xiàn)嚴重倒伏 4周齡的DBA/2J小鼠靜纖毛出現(xiàn)嚴重的倒伏。無論OHC靜纖毛還是IHC靜纖毛均呈傾倒的“C”型,纖毛束嚴重彎曲倒伏貼于毛細胞上端的頂盤上(圖2C、F)。4周齡時即使纖毛束出現(xiàn)嚴重倒伏但并未出現(xiàn)倒“V”型纖毛束的大面積缺失(偶有缺失)。

2.2.5 纖毛束出現(xiàn)嚴重缺失 8周齡的DBA/2J小鼠倒“V”型纖毛束出現(xiàn)較為嚴重缺失(區(qū)域性),且纖毛束融合更為嚴重(圖2D),尤其OHC靜纖毛束融合更為明顯,已無法辨別單根纖毛(圖2G)。

3 討論

動物模型通常作為研究年齡相關(guān)的遺傳和生理基礎疾病的重要工具[7]。DBA/2J小鼠是被公認的AHL動物模型,該小鼠模型不僅表現(xiàn)為年齡相關(guān)性、漸進性聽力受損,而且之前的報道其伴有較為嚴重的早發(fā)性聽力受損。DBA/2J小鼠在3周齡時已表現(xiàn)出聽力損失,其聽力閾值上升15～20dB SPL,在14周齡時接近全聾[8]。DBA/2J小鼠在2個月就有嚴重的聽力損失,16kHZ的純音刺激下其ABR閾值高于60dB SPL[9]。本研究ABR測試結(jié)果也證實了DBA/2J小鼠確實存在漸進性聽力受損,尤其是4周齡以后(小鼠可以測聽最小周齡為3周)。因此,研究該模型小鼠的早發(fā)性聽力損失的原因?qū)τ谄渲委熀透纳坡犃p失有著重要作用。

圖2 DBA/2J 小鼠耳蝸毛細胞靜纖毛超微形態(tài),掃描電鏡。A：×600; B～D：×2000; E～G：×5000Fig 2 Ultramicroscopic morphology of cochlea hair cell stereocilia of DBA/2J mice,scanning electron microscopeA：×600; B-D：×2000; E-G：×10000.A-D：HCs; E-G：OHCs.A,B,E: 2 weeks; C,F: 4 weeks; D,G: 8 weeks.HCs: Hair cells; OHCs: Out hair cells

3.1 纖毛的漸進性丟失是增齡性聾的主要病理過程之一

作為聽覺感受器細胞的內(nèi)耳耳蝸毛細胞及其纖毛的漸進性丟失是增齡性聾的主要病理過程之一[7]。毛細胞頂端的靜纖毛在聲音傳導過程中起到了不可缺失的作用。靜纖毛能感受聲波刺激引起毛細胞的信號轉(zhuǎn)換作用,將機械信號轉(zhuǎn)換成電信號,產(chǎn)生聽覺。如果纖毛出現(xiàn)病變將導致聽力受損。Shin等[3]研究認為,DBA/2J小鼠2周齡耳蝸底回毛細胞靜纖毛沒有缺失,1月齡到6月齡的低倍鏡下可見纖毛束出現(xiàn)漸進性丟失。本研究結(jié)果顯示,在掃描電鏡600倍鏡下DBA/2J小鼠2周齡耳蝸底回毛細胞靜纖毛排列規(guī)則,未見缺失。OHC靜纖毛呈倒“V”型多行排列,IHC靜纖毛呈單行“一”字型排列。2周齡時,在掃描電鏡2000倍鏡下小鼠毛細胞纖毛束頂端可見散在點狀高亮影,掃描電鏡10000倍鏡下可見高亮影為幾根纖毛束的融合。

Perrin等[4]的研究認為,DBA/2J小鼠5周齡時耳蝸底回OHC靜纖毛長度變短,但并未報道5周齡之前的纖毛變化情況。本研究結(jié)果顯示,早在2周齡時的掃描電鏡10000倍鏡下可見DBA/2J小鼠耳蝸底回靜纖毛不僅有融合變化而且出現(xiàn)軟化,4周齡時雖然未見倒“V”型纖毛束整體缺失但纖毛束整體倒伏較為嚴重,并且出現(xiàn)單根或者幾根的纖毛丟失,無論OHC靜纖毛還是IHC靜纖毛均如此。

本研究結(jié)果顯示DBA/2J小鼠4周齡時未見倒“V”型纖毛束明顯缺失,但纖毛束整體倒伏較為嚴重;8周齡時出現(xiàn)大面積的倒“V”型纖毛束的丟失。筆者認為,早期毛細胞纖毛束的融合和軟化最終導致其嚴重倒伏,進而出現(xiàn)纖毛束的漸進性缺失。這些結(jié)果導致毛細胞靜纖毛對聲波刺激的反應減弱,進而影響聽覺的產(chǎn)生,隨著年齡的增加表現(xiàn)為嚴重的聽力受損。

3.2 基因缺陷是導致DBA/2J小鼠毛細胞纖毛束損害主要因素

在基因水平上,DBA/2J小鼠出現(xiàn)早期聽力受損的原因除了Ahl基因位座上被命名為Cdh23 (鈣黏蛋白CDH23)等位基因的突變外,還有位于Ahl 8基因位座上被確認的fascin-2(交聯(lián)蛋白FSCN-2)基因的突變[10]。CDH23是鈣黏蛋白超家族的成員之一,它表達于感覺神經(jīng)上皮細胞表面,被認為與耳蝸毛細胞靜纖毛的結(jié)構(gòu)和毛細胞束的形成有關(guān)[11-13]。fascin-2基因表達肌動蛋白交聯(lián)蛋白(FSCN-2),FSCN-2 蛋白大量存在于毛細胞靜纖毛,集中分布于纖毛束的頂端,維持靜纖毛的長度和硬度[14]。

本研究結(jié)果顯示,早在2周齡的DBA/2J小鼠就出現(xiàn)纖毛束軟化,4周齡出現(xiàn)纖毛束倒伏,推測其早發(fā)性聽力受損可能是fascin-2基因的突變所產(chǎn)生的貢獻更多。因此,筆者認為,DBA/2J小鼠由于fascin-2基因和Cdh23基因功能降低,導致其出現(xiàn)漸進性的纖毛束的軟化和倒伏以及缺失,造成了小鼠聽力的早期受損。

綜上所述,本研究通過觀察2、4周齡及8周齡時DBA/2J小鼠毛細胞靜纖毛的超微形態(tài)結(jié)構(gòu)改變,觀察到纖毛束融合、軟化以及嚴重的倒伏甚至缺失等現(xiàn)象,筆者認為這些形態(tài)學的改變是造成了DBA/2J小鼠的早發(fā)性聽力損害的重要因素。

參 考 文 獻

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