李 霞，印國兵，程 熙，潘倍倍，李順波，代 朦，郭 丹

重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院乳腺甲狀腺外科，重慶 400010

CC族趨化因子受體4（CC chemokine receptor 4，CCR4）是腫瘤轉(zhuǎn)移中常見的趨化因子受體［1］。CCL22被稱為巨噬細胞來源的趨化因子(macrophage-derived chemokine，MDC)，CCL17也被稱為胸腺和活化調(diào)節(jié)的趨化因子(thymus and activation-regulated chemokine，TARC)，這兩者又是CCR4的主要配體［2-3］。研究表明，CCR4-CCL17軸以及CCR4-CCL22軸與前列腺癌細胞的侵襲以及肺癌細胞的侵襲等密切相關(guān)［4］。乳腺癌細胞高表達CCR4促進乳腺癌肺轉(zhuǎn)移，其具體機制是乳腺癌高表達CCR4通過遠程促進CCL22和CCL17在肺組織中的表達進而促進乳腺癌肺轉(zhuǎn)移。通過抑制乳腺腫瘤細胞CCR4的表達可以顯著抑制乳腺癌肺轉(zhuǎn)移［4］。烏司他丁（ulinastatin）作為一種廣譜酶抑制劑，在增強巨噬細胞吞噬功能以及維持機體免疫力方面具有重要作用［5］，目前在治療急性、慢性胰腺炎中應(yīng)用較為廣泛。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)烏司他丁能抑制乳腺癌CCR4和TGF-β的表達［6］，腫瘤分泌CCL22和CCL17時存在TGF-β-microRNA-34a-CCL22軸［7］和microRNA-31-TGF-β-CCL17軸的激活［8］。肝臟是乳腺癌晚期容易轉(zhuǎn)移的部位之一，乳腺癌肝轉(zhuǎn)移嚴重影響患者預(yù)后。本研究旨在探尋CCL17/CCL22–CCR4在乳腺癌肝轉(zhuǎn)移中的作用，以及烏司他丁對乳腺癌肝轉(zhuǎn)移的影響及其分子機制，為進一步探尋乳腺癌肝轉(zhuǎn)移的治療提供理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

4T1乳腺癌細胞株和HC11小鼠正常乳腺上皮細胞株均購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院生物化學(xué)與細胞生物學(xué)研究所細胞庫，SPF級雌性BALB/c小鼠（20 g/只）購自重慶醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心（合格證號：0005818），RPMI-1640培養(yǎng)基和胎牛血清購自美國Gibco公司，烏司他丁購自廣東天普生化醫(yī)藥股份有限公司，免疫組織化學(xué)試劑盒及DAB顯色試劑盒購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，羊抗小鼠CCR4單克隆抗體（100 μg/mL，ab1669）、兔抗小鼠CCL17多克隆抗體（100 μg/mL，ab182793）和兔抗小鼠CCL22單克隆抗體（150 μg/mL，EPR1362）購自美國Abcam公司，所有PCR引物序列由重慶金麥生物技術(shù)有限公司合成，CCR4干擾慢病毒購自漢恒生物科技（上海）有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)

將4T1乳腺癌細胞和HC11正常小鼠乳腺上皮細胞在體積分數(shù)CO2為5%、37 ℃的條件下培養(yǎng)于含10%胎牛血清、1%的青霉素-鏈霉素雙抗的RPMI-1640高糖培養(yǎng)基中。

1.2.2 慢病毒轉(zhuǎn)染

將生長狀態(tài)良好的4T1細胞以每孔1×105個接種在24孔板中，待細胞貼壁后更換培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)。24 h后，待細胞生長至每孔2×105個，更換新鮮培養(yǎng)基，加入適量沉默CCR4基因的慢病毒及陰性慢病毒懸液，37 ℃溫育24 h，用新鮮培養(yǎng)基更換含病毒的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。96 h后用熒光顯微鏡觀察慢病毒的轉(zhuǎn)染效率，用流式細胞術(shù)檢查慢病毒的轉(zhuǎn)染率，并用蛋白質(zhì)印跡法（Western blot）進行驗證。

1.2.3 實驗動物分組及處理

將20只BALB/c小鼠隨機分為乳腺癌荷瘤組及對照組，每組10只，分別給予50 μL約1×106個的4T1細胞懸液和等量HC11細胞懸液于BALB/c小鼠第4對乳腺脂肪墊（mfp）接種；將16只BALB/c小鼠隨機分為CCR4抑制組（Transfection）和對照組（Control），每組各8只，分別給予50 μL約1×106個轉(zhuǎn)染慢病毒的4T1細胞和未轉(zhuǎn)染慢病毒的4T1細胞；將32只乳腺癌荷瘤模型構(gòu)建成功的小鼠隨機分為4組，即對照組（Control）和烏司他丁低濃度組（Low）、中濃度組（Medium）及高濃度組（High），每組8只，分別每日腹腔注射200 μL（只·d）0.9%氯化鈉溶液及400、800和1 600 U烏司他丁，給藥周期為15 d。本實驗所涉及的步驟經(jīng)重慶醫(yī)科大學(xué)動物倫理委員會評價及批準。

1.2.4 采用免疫組織化學(xué)法檢測小鼠乳腺腫瘤CCR4及肝臟CCL22和CCL17的表達

以頸椎脫臼法處死各組小鼠，取乳腺腫瘤及肝臟組織，用4%多聚甲醛固定48 h，石蠟包埋切片，切片厚度3～5 μm，切片常規(guī)脫蠟，微波蒸煮法抗原修復(fù)，采用3%的H2O2阻斷內(nèi)源性過氧化物酶活性，山羊血清封閉1 h，滴加CCR4、CCL22及CCL17抗體（1∶1 000），4 ℃過夜，滴加生物素標記二抗，于室溫溫育20 min，滴加辣根過氧化物酶標記的鏈霉卵白素工作液，室溫溫育1 h，DAB顯色，顯微鏡下觀察顯色程度，1～3 min終止顯色，蘇木精復(fù)染30～60 s，脫水、透明、封片。運用Image Pro Plus圖像分析軟件分析免疫組織化學(xué)圖片，按照公式：陽性指數(shù)（positive index，PI）=陽性平均吸光度（D）值×陽性面積百分率計算PI值。

1.2.5 采用Western blot法檢測各組小鼠肝臟組織TGF-β的蛋白水平

以頸椎脫臼法處死各組小鼠，取肝臟組織液氮保存，取大小為3 mm×3 mm×3 mm的轉(zhuǎn)移瘤組織或?qū)φ战M組織置于研缽中研磨，研磨后的組織粉末加入細胞裂解液作用30 min，12 000×g高速離心10 min，對上清液采用BCA法進行蛋白質(zhì)含量測定。等量蛋白經(jīng)SDS-PAGE分離后，轉(zhuǎn)移到PⅤDF膜上。用5%脫脂奶粉封閉60 min，加入TGF-β抗體（濃度均為1∶1 000），4 ℃作用過夜，然后用TBST洗5 min/3次，加入二抗稀釋液室溫溫育60 min，然后再用TBST洗3次，每次5 min。ECL發(fā)光液將PⅤDF 膜顯色，暗室曝光到X線片上，凝膠成像系統(tǒng)掃描分析結(jié)果。實驗重復(fù)3次。

1.2.6 實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction，RTFQ-PCR）法檢測肝臟組織中TGF-β、microRNA-34a以及microRNA-31的表達

內(nèi)參U6基因上游引物序列為5’-CTCGCT T C G G C AG C A C A-3’，下游引物序列為5’-A ACGCTTCACGA ATTTGCGT-3’；microR NA-34 a上游引物序列為5’-G G C AGTGTCTTAGCTGGTTG-3’，下游引物序列為5’-A AGAG C T T C C GA AGT C C T G G-3’；microRNA-31上游引物序列為5’-CGCGGAGGCA AGATGCT-3’，下游引物序列為5’-CAGTGCAGGGTCCGAG GTATT-3’；TGF-β上游引物序列為5’-CTGG TTCACGTGACTGATGG-3’，下游引物序列為5’-CTTCCCGAGGAGCTCTTTCT-3’。具體方法見參考文獻［8］，采用2－ΔΔct法計算相對表達。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

使用SPSS 22.0統(tǒng)計分析軟件對數(shù)據(jù)進行處理，所得數(shù)值均以x±s表示，多樣本均數(shù)比較，若方差齊并滿足正態(tài)分布則用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗法，否則采用秩合檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 小鼠乳腺癌高表達CCR4并在肝轉(zhuǎn)移時促進肝臟轉(zhuǎn)移瘤表達CCL22和CCL17

CCR4是腫瘤轉(zhuǎn)移常見的趨化因子受體［1］，CCL22以及CCL17是其主要的配體［2-3］。為了研究CCR4以及CCL22和CCL17在小鼠乳腺癌肝轉(zhuǎn)移中的作用，我們通過小鼠乳腺脂肪墊注射4T1乳腺癌細胞株以及HC11小鼠正常乳腺上皮細胞株懸液的方式，分別構(gòu)建荷瘤組小鼠乳腺癌模型和對照組模型，每組各10只小鼠，成瘤15 d后，摘取兩組小鼠乳腺腫瘤、肝臟轉(zhuǎn)移瘤以及轉(zhuǎn)移瘤的癌旁組織，采用免疫組織化學(xué)染色法分別檢測乳腺腫瘤組織中CCR4以及肝臟轉(zhuǎn)移瘤中CCL22和CCL17的表達。其中，CCR4在荷瘤組（4T1）小鼠乳腺腫瘤組織中呈高表達，在對照組（HC11）小鼠乳腺良性腫塊中表達較低。H-E染色法檢測到荷瘤組小鼠出現(xiàn)明顯的肝轉(zhuǎn)移病灶，對照組肝臟無明顯的變化；荷瘤組小鼠乳腺癌出現(xiàn)肝轉(zhuǎn)移后，CCL22和CCL17在轉(zhuǎn)移的肝臟腫瘤組織中的表達較轉(zhuǎn)移瘤癌旁組織顯著升高（圖1）。

圖 1 CCR4以及CCL22和CCL17在小鼠乳腺癌肝轉(zhuǎn)移中的表達Fig. 1 The expression of CCR4, CCL22 and CCL17 in breast cancer with liver metastasis

2.2 沉默乳腺癌細胞CCR4的表達抑制乳腺癌移植瘤的生長

為了進一步研究CCR4對乳腺癌生長的作用，我們通過慢病毒轉(zhuǎn)染的方式抑制4T1細胞CCR4的表達，將未轉(zhuǎn)染（Control）和轉(zhuǎn)染（Transfection）慢病毒的4T1細胞同樣以乳腺脂肪墊注射細胞的方式構(gòu)建乳腺癌模型，每組各8只小鼠。結(jié)果顯示，慢病毒轉(zhuǎn)染率較高，達58.4%。慢病毒轉(zhuǎn)染后CCR4的抑制效果較明顯。小鼠皮下注射細胞后，繼續(xù)喂養(yǎng)15 d，取下乳腺腫瘤并稱其質(zhì)量，發(fā)現(xiàn)抑制組乳腺腫瘤質(zhì)量明顯低于對照組（圖2）。綜上可知，沉默4T1乳腺癌細胞CCR4的表達可顯著抑制乳腺癌移植瘤的生長。

2.3 烏司他丁抑制小鼠乳腺癌肝轉(zhuǎn)移

2.3.1 烏司他丁抑制乳腺癌CCR4的表達和乳腺癌肝轉(zhuǎn)移

隨著烏司他丁給藥濃度增高，乳腺癌組織中CCR4表達降低，乳腺癌腫瘤質(zhì)量減輕，并且肝臟轉(zhuǎn)移瘤的質(zhì)量減輕（圖3）。

2.3.2 烏司他丁通過抑制TGF-β-microRNA-34a-CCL22軸及microRNA-31-TGF-β-CCL17軸抑制轉(zhuǎn)移瘤CCL22和CCL17的表達

結(jié)果顯示，烏司他丁抑制肝臟轉(zhuǎn)移瘤TGF-β的表達（圖4A，4B）；烏司他丁促進肝臟轉(zhuǎn)移瘤microRNA-34a的表達，并抑制microRNA-31的表達（圖4C）；烏司他丁抑制肝臟轉(zhuǎn)移瘤CCL22和CCL17的表達（圖4D）；相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)TGF-β的表達水平和microRNA-34a、microRNA-31、CCL22以及CCL17的表達高度相關(guān)（圖4E）。

圖 2 沉默乳腺癌細胞CCR4的表達抑制乳腺癌的生長Fig. 2 Silencing of CCR4 in breast cancer cells inhibited the growth of breast cancer

圖 3 烏司他丁抑制乳腺癌CCR4的表達和乳腺癌的生長并抑制乳腺癌肝轉(zhuǎn)移Fig. 3 Ulinastatin inhibited the expression of CCR4 in breast tumor tissues, the growth of breast tumor and metastatic tumor

圖 4 烏司他丁通過抑制TGF-β-microRNA-34a-CCL22軸及microRNA-31-TGF- β-CCL17 軸抑制轉(zhuǎn)移瘤CCL22和CCL17的表達Fig. 4 Ulinastatin inhibited the expression of CCL22 and CCL17 in liver tissues via TGF-β-microRNA-34a-CCL22 and microRNA-31-TGF-β-CCL17 axes

3 討 論

乳腺癌細胞具有高度的侵襲性，肝臟是晚期乳腺癌轉(zhuǎn)移的器官之一。研究表明，肝臟微環(huán)境和肝血竇結(jié)構(gòu)是乳腺癌在肝臟內(nèi)轉(zhuǎn)移侵襲至關(guān)重要的環(huán)節(jié)［9-12］。進一步研究乳腺癌肝轉(zhuǎn)移的機制具有重要意義。CCR4是腫瘤轉(zhuǎn)移中常見的趨化因子受體［1］，CCL22和CCL17是CCR4主要的配體［2-3］。研究表明，乳腺癌細胞高表達CCR4與乳腺癌細胞的惡性生物學(xué)行為密切相關(guān)［13］。高表達CCR4的乳腺癌細胞促進乳腺癌肺轉(zhuǎn)移，其具體機制是乳腺癌高表達CCR4通過遠程促進CCL22和CCL17在肺組織中的表達進而促進乳腺癌肺轉(zhuǎn)移［4］。烏司他丁作為一種廣譜酶抑制劑，在增強巨噬細胞吞噬功能以及維持機體免疫力方面具有重要作用［5］，目前主要用于急性、慢性胰腺炎以及休克的治療。近年來關(guān)于烏司他丁在腫瘤治療中的作用也有很多研究，也取得了一定的成果。Shen等［14］研究表明烏司他丁和姜黃素協(xié)同作用可以有效地抑制小鼠結(jié)腸癌遠處轉(zhuǎn)移；Gao等［6］研究發(fā)現(xiàn)烏司他丁與多西他賽聯(lián)合用藥可以抑制乳腺癌細胞的侵襲。然而烏司他丁在乳腺癌肝轉(zhuǎn)移中的作用目前未見相關(guān)報道。

本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)烏司他丁能抑制乳腺癌CCR4和TGF-β的表達［6,15,16］，而研究表明腫瘤細胞分泌CCL22和CCL17時存在TGF-β-microRNA-34a-CCL22軸［7］和microRNA-31-TGF-β-CCL17軸的激活［8］，TGF-β-microRNA-34a-CCL22軸調(diào)節(jié)CCL22的分泌［7］，內(nèi)源性的microRNA-31可以正向調(diào)控TGF-β介導(dǎo)的內(nèi)皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（endothelial-mesenchymal transition，EMT），進而誘導(dǎo)CCL17的表達［8］，兩條通路與腫瘤的轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。但是，CCR4及其配體CCL22和CCL17與乳腺癌肝轉(zhuǎn)移是否相關(guān)以及烏司他丁對乳腺癌肝轉(zhuǎn)移的影響及其相關(guān)機制目前尚不清楚。

本研究通過構(gòu)建乳腺癌小鼠荷瘤模型同樣發(fā)現(xiàn)乳腺癌肝轉(zhuǎn)移時乳腺原發(fā)腫瘤中CCR4呈高表達，與腫瘤轉(zhuǎn)移密切相關(guān)的CCL22和CCL17在轉(zhuǎn)移的肝臟腫瘤組織中的表達也顯著升高，沉默乳腺癌細胞CCR4的表達可抑制乳腺癌的生長。烏司他丁可以明顯抑制乳腺癌CCR4的表達和乳腺腫瘤的生長，并抑制乳腺癌肝轉(zhuǎn)移，隨著烏司他丁濃度的升高，抑制效果越明顯。此外，我們通過Western blot檢測到烏司他丁處理組的小鼠肝臟轉(zhuǎn)移瘤TGF-β呈低表達；RTFQPCR檢測發(fā)現(xiàn)烏司他丁高濃度組肝臟轉(zhuǎn)移瘤microRNA-34a mRNA表達量較其他組增加，而microRNA-31 mRNA表達量較其他組減少。相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)TGF-β的蛋白表達和microRNA-34a、microRNA-31、CCL22和CCL17表達高度相關(guān)。以上研究提示烏司他丁可能通過抑制細胞TGF-β-microRNA-34a-CCL22軸及microRNA-31-TGF-β-CCL17軸進而抑制乳腺癌肝轉(zhuǎn)移肝臟組織中CCL12和CCL17的表達。

綜上所述，本研究證實乳腺癌肝轉(zhuǎn)移時，CCL22和CCL17在轉(zhuǎn)移的肝臟組織中呈高表達；烏司他丁通過抑制TGF-β-microRNA-34a-CCL22軸以及microRNA-31-TGF-β-CCL17軸下調(diào)肝臟組織CCL22和CCL17的表達，進而抑制由CCL17/CCL22-CCR4介導(dǎo)的小鼠乳腺癌的肝轉(zhuǎn)移。烏司他丁是臨床成熟用藥，且不良反應(yīng)較小，此研究為臨床治療乳腺癌肝轉(zhuǎn)移提供了實驗基礎(chǔ)［17］。當(dāng)然，本研究也存在不足，沒有深入地探索烏司他丁抑制TGF-β的相關(guān)機制，也沒有對乳腺癌肝轉(zhuǎn)移的臨床樣本進行相關(guān)因子的檢測，這需要在后續(xù)的研究中進一步深入探討。

［參 考 文 獻］

［1］ COLLART M A. The Ccr4-Not complex is a key regulator of eukaryotic gene expression ［J］. Wiley Interdiscip Rev RNA,2016, 7(4): 438-454.

［2］ JAFARZADEH A, ARABI Z, AHANGAR-PARVIN R, et al.Ginger extract modulates the expression of chemokines CCL20 and CCL22 and their receptors (CCR6 and CCR4) in the central nervous system of mice with experimental autoimmune encephalomyelitis ［J］. Drug Res (Stuttg), 2017, 67(11): 632-639.

［3］ HIYOSHI M, OKUMA K, TATEYAMA S, et al. Furindependent CCL17-fused recombinant toxin controls HTLV-1 infection by targeting and eliminating infected CCR4-expressing cellsin vivoandin vitro［J］. Retrovirology, 2015, 20(12):73-87.

［4］ OLKHANUD P B, BAATAR D, BODOGAI M, et al. Breast cancer lung metastasis requires expression of chemokine receptor CCR4 and regulatory T cells ［J］. Cancer Res, 2009,69(14): 5996-6004.

［5］ WEI F, LIU S, LUO L, et al. Anti-inflammatory mechanism of ulinastatin: inhibiting the hyperpermeability of vascular endothelial cells induced by TNF-α via the RhoA/ROCK signal pathway ［J］. Int Immunopharmacol, 2017, 5(46): 220-227.

［6］ GAO F, SUN Z J, SUN X, et al. Ulinastatin exerts synergistic effects with taxotere and inhibits invasion and metastasis of breast cancer by blocking angiogenesis and the epithelial–mesenchymal transition ［J］. Cancer Biother Radiopharm,2013, 28(3): 218-225.

［7］ MAOLAKE A, IZUMI K, SHIGEHARA K, et al. Tumorassociated macrophages promote prostate cancer migration through activation of the CCL22-CCR4 axis ［J］. Oncotarget,2017, 8(6): 9739-9751.

［8］ KATSURA A, SUZUKI H I, UENO T, et al. MicroRNA-31 is a positive modulator of endothelial-mesenchymal transition and associated secretory phenotype induced by TGF-β ［J］.Genes Cells, 2016, 21(1): 99-116.

［9］ GYAWALI B, NIRAULA S. Duration of adjuvant trastuzumab in HER-2 positive breast cancer: overall and disease free survival results from meta-analyses of randomized controlled trials［J］. Cancer Treat Rev, 2017, 12(60): 18-23.

［10］ BOROS M, GEORGESCU R, PODOLEANU C, et al. Review on practical approach in multiple breast carcinomas: does each focus matter?［J］. Chirurgia (Bucur), 2017, 112(4): 418-428.

［11］ GRUBER-ROUH T, LANGENBACH M, NAGUIB N N N,et al. Trans-arterial chemoperfusion for the treatment of liver metastases of breast cancer and colorectal cancer: clinical results in palliative care patients ［J］. World J Clin Oncol,2017, 8(4): 343-350.

［12］ PIEROBON M, RAMOS C, WONG S, et al. Enrichment of PI3K-AKT-mTOR pathway activation in hepatic metastases from breast cancer ［J］. Clin Cancer Res, 2017, 23(16): 4919-4928.

［13］ MACHEREY S, MALLMANN P, MALTER W, et al. Lung metastasectomy for pulmonary metastatic breast carcinoma［J］. Geburtshilfe Frauenheilkd, 2017, 77(6): 645-650.

［14］ SHEN F, CAI W S, LI J L, et al. Synergism from the combination of ulinastatin and curcumin offers greater inhibition against colorectal cancer liver metastases via modulating matrix metalloproteinase-9 and E-cadherin expression ［J］. Onco Targets Ther, 2014, 18(7): 305-314.

［15］ SUN Z J, YU T, CHEN J S, et al. Effects of ulinastatin and cyclophosphamide on the growth of xenograft breast cancer and expression of CXC chemokine receptor 4 and matrix metalloproteinase-9 in cancers ［J］. J Int Med Res, 2010,38(3): 967-976.

［16］ 宋曉丹, 譚 令, 崔曉江, 等. 烏司他丁聯(lián)合多西他賽對乳腺癌免疫微環(huán)境的影響 ［J］. 重慶醫(yī)科大學(xué)學(xué)報, 2014,39(12): 1794-1799.

［17］ LIU D, YU Z, YIN J, et al. Effect of ulinastatin combined with thymosin alpha1 on sepsis: a systematic review and metaanalysis of Chinese and Indian patients ［J］. J Crit Care,2017, 39(6): 259-266.