索明珠，李 平，張 梅，朱耀東，徐夢冉，李為雨

1.安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院中西醫(yī)結(jié)合腫瘤科，安徽 合肥，230022；

2. 首都醫(yī)科大學(xué)腫瘤醫(yī)學(xué)院2014級五年臨床三班，北京 100069

實體惡性腫瘤需要豐富的血液供應(yīng)來支持生長和轉(zhuǎn)移。長期以來，腫瘤血管生成（angiogenesis）被認為是腫瘤可以獲得足夠的血液供應(yīng)的唯一手段。1999年Maniotis等［1］在人類葡萄膜惡性黑色素瘤中發(fā)現(xiàn)了新的腫瘤血供模式，血管壁是由變形的惡性黑色素瘤細胞和基質(zhì)細胞構(gòu)成的。由于其結(jié)構(gòu)與正常血管相似，它們被稱為血管生成擬態(tài)（vasculogenic mimicry，ⅤM）。近年來，研究者相繼在乳腺癌等多種高度侵襲性的腫瘤中也發(fā)現(xiàn)了這一現(xiàn)象，腫瘤細胞在無內(nèi)皮細胞參與下，通過自身變形及與細胞外基質(zhì)的相互作用，形成環(huán)狀并具有腫瘤血供作用的圖案樣網(wǎng)絡(luò)［2］。血管生成擬態(tài)是對經(jīng)典的內(nèi)皮性血管生成之外腫瘤血管生成方式的重要補充，為腫瘤的抗血管治療提供了新的思路。傳統(tǒng)的抗腫瘤血管治療藥物僅針對血管內(nèi)皮細胞，容易誘發(fā)腫瘤內(nèi)部逃逸，使腫瘤細胞的表型發(fā)生轉(zhuǎn)化。腫瘤細胞通過自身變形，在無需內(nèi)皮細胞參與的情況下，可直接形成血管生成擬態(tài)［3］。在這種情況下，單純抗內(nèi)皮血管治療可能意義不大，應(yīng)考慮聯(lián)合抗血管生成擬態(tài)治療。因此，尋找抑制血管擬態(tài)的關(guān)鍵作用靶點，篩選有效的治療藥物，對提高腫瘤的治療效果有著重要的意義。

馬錢子堿（brucine）為通絡(luò)藥馬錢子的主要生物堿單體，廣泛用于各種腫瘤、癌性疼痛和風(fēng)濕頑痹以及骨病的治療［4］。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，馬錢子堿對裸鼠移植性乳腺癌骨轉(zhuǎn)移具有明顯的抑制作用，能夠降低腫瘤組織中血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，ⅤEGF）的表達，降低微血管密度（microvessel density，MⅤD）［5］。既往研究表明，馬錢子堿具有潛在的抗血管生成作用［6-8］，缺乏針對血管生成擬態(tài)的相關(guān)性研究。恩度（Endostar）為血管生成抑制類藥物，其作用機制是通過抑制腫瘤血管的生成，阻斷腫瘤細胞的營養(yǎng)供給，從而發(fā)揮抑制腫瘤增殖或轉(zhuǎn)移的作用［9］。

本研究通過觀察馬錢子堿對于乳腺癌細胞系MDA-MB-231的抑制增殖、誘導(dǎo)凋亡的作用，并進行乳腺癌細胞體外三維培養(yǎng)，探討馬錢子堿對人乳腺癌細胞MDA-MB-231體外形成血管生成擬態(tài)的影響及其可能的作用機制。

1 材料和方法

1.1 主要試劑及細胞株

馬錢子堿（批號：16042903，HPLC≥98%）購自成都普菲德生物技術(shù)有限公司，恩度購自山東先聲麥得津生物制藥有限公司，高糖的DMEM培養(yǎng)基購自美國Hyclone公司，胎牛血清、胰蛋白酶-EDTA消化液購自美國Gibco公司，二甲基亞砜（DMSO）購自美國Sigma公司，MTT粉末購自美國Biosharp公司，Matrigel基質(zhì)膠（貨號：356234）購自美國Corning公司，Dispase?Ⅱ（neutral protease，gradeⅡ）（貨號：04942078001）購自瑞士Roche公司，Annexin Ⅴ-FITC/碘化丙啶（propidium iodide，PI）雙染細胞凋亡檢測試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司，糖原PAS染色試劑盒購自美國Solarbio公司，ⅤEGFA抗體購自美國Proteintech公司，MMP-2抗體（8B4）、MMP-9抗體（2C3）購自美國Santa Cruz Biotechnology公司，人EphA2抗體購自美國RD Systems公司，ⅤE-cadherin抗體（D87F2）購自美國Cell Signaling Technology公司，GAPDH抗體購自美國Millipore Chemicon公司，抗兔、抗鼠、抗羊IgG抗體購自美國Promega公司，增強型化學(xué)發(fā)光自顯影試劑盒（enhanced chemiluminescence，ECL）購自美國Biological Industries公司，人乳腺癌細胞系MDA-MB-231購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院生物化學(xué)與細胞生物學(xué)研究所細胞庫。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)

MDA-MB-231細胞于DMEM高糖培養(yǎng)基（含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 μg/mL鏈霉素）中培養(yǎng)，置于37 ℃、CO2體積分數(shù)為5%的培養(yǎng)箱中。細胞貼壁生長，每2～3天傳代1次。

1.2.2 藥物配制和分組

馬錢子堿用DMSO溶解后，用培養(yǎng)基配制成濃度為800 μg/mL的母液，然后用DMEM高糖培養(yǎng)基分別稀釋至50、100、200和400 μg/mL實驗組濃度。陽性對照組恩度濃度為250 μg/mL，空白對照組不含藥，用等量培養(yǎng)液替代。

1.2.3 MTT法細胞增殖檢測

消化MDA-MB-231細胞，以8×103個/孔接種于96孔培養(yǎng)板上，于37 ℃培養(yǎng)箱中貼壁生長后，棄掉舊培養(yǎng)液，分別加入各處理組的培養(yǎng)液200 μL。每組設(shè)復(fù)孔5個。培養(yǎng)24 h、48 h后各孔加入5 μg/mL MTT至終濃度0.5 mg/mL。繼續(xù)培養(yǎng)4 h后吸棄原有培養(yǎng)液。每孔加入150 μL DMSO，于搖床上搖晃至結(jié)晶溶解完全。然后在酶聯(lián)免疫檢測儀490 nm處測定各孔的吸光度值（D）。按照下列公式計算細胞增殖抑制率。

1.2.4 AnnexinⅤ-FITC/PI細胞凋亡實驗

把不同濃度馬錢子堿處理24 h后的各組細胞培養(yǎng)液吸出至離心管，PBS洗滌細胞后加入適量胰酶進行消化。然后加入之前收集的細胞培養(yǎng)液以終止消化。將收集到的細胞懸液1 000×g離心5 min后棄上清液，加入195 μL AnnexinⅤ-FITC結(jié)合液輕輕重懸。加入5 μL AnnexinⅤ-FITC，輕輕混勻。加入10 μL PI，輕輕混勻。室溫陰暗處溫育15 min后，立即用流式細胞儀進行分析。

1.2.5 HO/PI細胞死亡檢測

使用Hoechst 33342/PI（propidium iodide）（HO/PI）進行染色分析。不同濃度馬錢子堿處理各組細胞24 h，用培養(yǎng)基配制10 mmol/ L HO（C1022，上海碧云天生物技術(shù)有限公司）和10 mmol/L PI（ST511，上海碧云天生物技術(shù)有限公司）混合液，于37 ℃培養(yǎng)箱進行細胞染色。20 min后，置于熒光顯微鏡下拍照。

1.2.6 乳腺癌細胞體外三維培養(yǎng)

將預(yù)先于4 ℃解凍的Matrigel基質(zhì)膠加至預(yù)冷的24孔板中，每孔200 μL，置于37 ℃培養(yǎng)箱中固化2 h。消化處于對數(shù)生長期的MDA-MB-231細胞用于實驗，用完全培養(yǎng)基重懸混勻，調(diào)整細胞密度為105個/mL，然后緩慢加入500 μL細胞懸液于24孔板的Matrigel基質(zhì)膠的表面。于37 ℃繼續(xù)培養(yǎng)，隨時在倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)變化及管道形成情況。10 h后，鏡下觀察到MDA-MB-231細胞之間相互連接，形成管道、網(wǎng)絡(luò)樣結(jié)構(gòu)，即血管生成擬態(tài)結(jié)構(gòu)（血管生成擬態(tài)管道）形成。

1.2.7 PAS染色

將上述培養(yǎng)10 h后形成的血管生成擬態(tài)結(jié)構(gòu)進行PAS染色，用于驗證血管生成擬態(tài)結(jié)構(gòu)是否由腫瘤細胞直接形成，不含血管內(nèi)皮細胞。吸棄孔板中的培養(yǎng)液，PBS清洗；PAS固定液固定10 min，蒸餾水清洗；入過碘酸溶液，室溫氧化15 min，蒸餾水清洗；置于Schiff液于室溫陰暗處浸染10 min；亞硫酸鈉溶液滴洗2次，每次2 min；蒸餾水多次沖洗；入蘇木精染色液，復(fù)染2 min；蒸餾水沖洗，鏡檢。

1.2.8 馬錢子堿對乳腺癌細胞血管生成擬態(tài)的影響

于24孔板中加入200 μL/孔預(yù)先于4 ℃過夜解凍的Matrigel基質(zhì)膠，置于37 ℃培養(yǎng)箱中固化2 h。期間，消化處于對數(shù)生長期的MDA-MB-231細胞，分別用含有不同濃度馬錢子堿（50、100、200和400 μg/mL）的完全培養(yǎng)基重懸混勻，調(diào)整細胞密度為105個/mL，然后緩慢加入500 μL細胞懸液于24孔板的Matrigel基質(zhì)膠的表面，繼續(xù)置于37 ℃培養(yǎng)10 h，觀察各孔血管生成擬態(tài)結(jié)構(gòu)的形成狀況，比較不同濃度馬錢子堿對于血管生成擬態(tài)影響的差異。重復(fù)3次獨立實驗。在形成血管生成擬態(tài)管道的孔中加入10 mg/mL的Dispase分散酶，振蕩5 min，將細胞從基質(zhì)膠中分離出來，進行后續(xù)實驗。

1.2.9 蛋白質(zhì)印跡法（Western blot）檢測血管生成擬態(tài)各標志蛋白的表達

采用Western blot檢測血管生成擬態(tài)相關(guān)標志分子表達的變化，如血管內(nèi)皮生長因子A（vascular endothelial growth factor-A，ⅤEGF-A）、血管內(nèi)皮鈣黏蛋白（vascular endothelial cadherin，ⅤE-cadherin）、EphA2和基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloprotein，MMP）。

將收集到的細胞加入RIPA細胞裂解液進行裂解，然后加入等體積的電泳上樣緩沖液。于沸水中煮10 min制成電泳樣品，將樣品等量上樣后進行電泳分離，冰水浴中恒壓濕轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜。5%脫脂牛奶室溫封閉1 h。配制適當濃度一抗（ⅤEGF-A為1∶200，ⅤE-cadherin為1∶1 000，EphA2為1∶1 000，MMP-2為1∶200，MMP-9為1∶200，GAPDH為1∶200），溫育一抗4 ℃過夜。TBST緩沖液（Tris-HCl，NaCl，吐溫20）室溫振蕩清洗3次，每次10 min。用一抗相對應(yīng)的二抗室溫溫育1 h，TBST室溫振蕩清洗3次，每次10 min。用ECL顯影試劑盒進行顯色檢測。使用Image J進行統(tǒng)計分析。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 20.0軟件進行統(tǒng)計分析。組間比較采用單因素方差分析，各組之間的數(shù)據(jù)比較采用方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 馬錢子堿對乳腺癌細胞增殖的抑制作用

MTT結(jié)果表明，不同濃度的馬錢子堿均可抑制乳腺癌細胞MDA-MB-231的生長，對細胞的增殖抑制作用隨著藥物濃度、作用時間的增加而增強，呈明顯的劑量-效應(yīng)、時間-效應(yīng)關(guān)系（P＜0.05，圖1）。

圖 1 馬錢子堿作用24和48 h后對MDA-MB-231細胞增殖的影響Fig. 1 The effect of Brucine on the proliferation of the MDAMB-231 after 24 and 48 hours

2.2 HO/PI染色細胞死亡檢測

由于PI不可以透過活細胞的細胞膜，只能透過破損的細胞膜而對核染色呈現(xiàn)紅色熒光，所以可以指示死細胞；HO可以將死細胞和活細胞的細胞核均染上藍色，所以可以代表細胞總數(shù)。HO/PI結(jié)果顯示，與MTT分析結(jié)果一致，細胞死亡數(shù)隨著馬錢子堿濃度增高而增多（圖2）。

圖 2 馬錢子堿增加MDA-MB-231細胞的死亡 (×400)Fig. 2 Brucine with different concentrations promoted MDA-MB-231 cell death

2.3 Annexin Ⅴ-FITC/PI雙染流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡

將Annexin Ⅴ與PI聯(lián)合使用時，PI則被排除在活細胞（Annexin V-/PI-）和早期凋亡細胞（Annexin V+/PI-）之外，而晚期凋亡細胞和壞死細胞同時被FITC和PI結(jié)合雙染呈現(xiàn)雙陽性（Annexin V+/PI+）。

Annexin V-FITC/PI結(jié)果表明，各濃度馬錢子堿組作用24 h后，當馬錢子堿劑量為100 μg/mL時，細胞的早期凋亡率與空白對照組相比，早期凋亡細胞所占比例顯著增加（P＜0.05），各劑量組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），24 h早期凋亡細胞隨著馬錢子堿劑量的增加而逐漸增加（n=3，圖3）。

圖 3 馬錢子堿作用24 h對MDA-MB-231細胞凋亡率變化的影響Fig. 3 The effects of brucine and positive control on MDA-MB-231 apoptosis rate

2.4 PAS染色

MDA-MB-231細胞接種后10 h，細胞貼附在Matrigel基質(zhì)膠原表面，細胞變形，彼此相互連接，圍成空腔樣、環(huán)狀結(jié)構(gòu)（圖4）。PAS染色顯示，由腫瘤細胞相互連接（不含內(nèi)皮細胞）的PAS陽性的管網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)（圖5）。擬態(tài)血管由腫瘤細胞圍成，無內(nèi)皮細胞襯覆的管道樣結(jié)構(gòu)。

圖 4 MDA-MB-231細胞在體外形成血管生成擬態(tài)Fig. 4 The vasculogenic mimicry formation of MDA-MB-231 in vitro(scale: 100 μm)

圖 5 血管生成擬態(tài)的PAS染色Fig. 5 PAS staining of vasculogenic mimicry (scale: 100 μm)

2.5 馬錢子堿對血管生成擬態(tài)的影響

10 h后，于倒置顯微鏡下觀察并拍照記錄。與空白對照和陽性對照相比，隨著馬錢子堿濃度的增加，管道結(jié)構(gòu)形成的數(shù)目減少，節(jié)點數(shù)、血管分支數(shù)減少；且當馬錢子堿濃度達到100 μg/mL時，抑制血管生成擬態(tài)結(jié)構(gòu)效果開始明顯（圖6）。說明馬錢子堿可以有效抑制乳腺癌細胞血管生成擬態(tài)結(jié)構(gòu)，更好地發(fā)揮抗腫瘤作用。

2.6 馬錢子堿對血管生成擬態(tài)相關(guān)蛋白的影響

Western blot檢測結(jié)果顯示，與空白對照和陽性對照相比，Brucine處理組內(nèi)隨著藥物濃度的增加，ⅤEGF、ⅤE-cadherin、EphA2、MMP-9和MMP-2蛋白水平明顯下降（圖7）。馬錢子堿抑制體外乳腺癌細胞的血管生成擬態(tài)結(jié)構(gòu)，可能與下調(diào)ⅤEGF、ⅤE-cadherin、EphA2、MMP-9和MMP-2蛋白有關(guān)。

圖 6 馬錢子堿及恩度（250 μg/mL）對血管生成擬態(tài)的影響 (×400)Fig. 6 The effects of Brucine and positive control on vasculogenic mimicry (scale: 100 μm)

圖 7 馬錢子堿下調(diào)血管生成擬態(tài)相關(guān)蛋白的表達Fig. 7 Brucine down regulated the expression of vasculogenic mimicry related protein

3 討 論

乳腺癌是導(dǎo)致女性死亡的常見惡性腫瘤。導(dǎo)致乳腺癌患者死亡的最主要原因是侵襲和轉(zhuǎn)移，而腫瘤血管生成是導(dǎo)致腫瘤浸潤的一個重要因素［10］。以往人們一直認為來自機體的血管內(nèi)皮細胞進入腫瘤組織內(nèi)，形成的新生血管是腫瘤獲得血液供應(yīng)的唯一途徑。因此，臨床上應(yīng)用的抗血管生成藥物大多針對血管內(nèi)皮細胞，通過抑制內(nèi)皮細胞生長和血管生成，來阻止腫瘤細胞的血液供應(yīng)，達到遏制腫瘤生長的目的［11］。但在實際治療過程中這種方法的臨床效果并不理想［12］。因此如何提高抗腫瘤血管治療的臨床療效，是目前研究的熱點。

血管生成擬態(tài)是近年來被發(fā)現(xiàn)的存在于多種高度侵襲性腫瘤內(nèi)的一種新的腫瘤血液供應(yīng)方式。血管生成擬態(tài)是由具有多潛能性、干細胞表型的高度惡性的腫瘤細胞所形成的管腔樣結(jié)構(gòu)，是實體腫瘤中獨立于血管內(nèi)皮細胞依賴性血管的微循環(huán)結(jié)構(gòu)，其管壁呈過碘酸希夫（periodic acid schiff，PAS）染色陽性，而CD34、CD31等內(nèi)皮細胞標志物染色為陰性，表明血管生成擬態(tài)的管壁不含有血管內(nèi)皮細胞，而是由腫瘤細胞直接構(gòu)成［13］。因此，在三維培養(yǎng)中能否形成擬態(tài)管腔樣結(jié)構(gòu)，常用于鑒定體外是否具有形成血管生成擬態(tài)的能力。

在血管生成擬態(tài)過程中，腫瘤細胞能夠模仿內(nèi)皮細胞的生物學(xué)行為，表達多種與內(nèi)皮細胞相關(guān)的基因，如VEGF-A、VE-cadherin、EphA2和MMPs等［14-17］。已有研究表明，ⅤEGF/EphA2/MMPs信號通路可能是卵巢癌血管生成擬態(tài)的重要調(diào)節(jié)通路［18］；ⅤEGF/ⅤE-cadherin/MMPs信號通路可能是胃癌血管生成擬態(tài)的重要調(diào)節(jié)通路［19］。由此推測，ⅤEGF/EphA2/ⅤE-cadherin/MMPs信號通路可能在乳腺癌血管生成及血管生成擬態(tài)過程中，起到關(guān)鍵性的調(diào)控作用。

在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)馬錢子堿可以有效地抑制MDA-MB-231細胞的增殖，并誘導(dǎo)細胞的凋亡、壞死；同時在Matrigel基質(zhì)膠原上構(gòu)建了一個三維培養(yǎng)的乳腺癌細胞模型，觀察到MDAMB-231細胞可以在體外形成血管生成擬態(tài)結(jié)構(gòu)，馬錢子堿可以抑制乳腺癌細胞的血管生成擬態(tài)，其機制可能與ⅤEGF/ⅤE-cadherin/EphA2/MMP-9/MMP-2表達的下調(diào)有關(guān)。本研究為腫瘤的抗血管治療提供了新的思路，并將拓展馬錢子堿的臨床應(yīng)用。本研究同時也存在不足，在其他乳腺癌細胞系及其相關(guān)動物模型中是否同樣存在血管生成擬態(tài)，馬錢子堿對這一結(jié)構(gòu)是否具有類似作用，尚需進一步研究。

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