賈 凱，吳 慧，許 建，高 杰

（新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)與園藝學(xué)院，新疆烏魯木齊830052）

蕪菁（Brassica rapa L.）屬十字花科蕓薹屬2年生根菜類蔬菜。在新疆維吾爾語中稱恰麻古，是維吾爾族居民食藥兩用的傳統(tǒng)蔬菜［1］。目前，新疆地區(qū)所栽培的蕪菁品種混雜，多為農(nóng)戶自行留種后育成的農(nóng)家品種，由于這些農(nóng)家品種存在提早抽薹現(xiàn)象嚴(yán)重且容易遭受病蟲害，因此選育新的雜交品種已成為蕪菁育種的主要方向。選育新的雜交品種需要純合的親本進(jìn)行雜交，獲得純合的親本一般通過常規(guī)技術(shù)進(jìn)行多代自交，此方法耗時長、效率低。利用游離小孢子培養(yǎng)方法，可在1～2年內(nèi)獲得穩(wěn)定的純合自交系，縮短育種周期，提高育種效率［2］。因此，游離小孢子培養(yǎng)技術(shù)是蕪菁育種的一條有效途徑。

有關(guān)游離小孢子培養(yǎng)技術(shù)方面前人做了許多研究，其中，Lichter利用小孢子培養(yǎng)技術(shù)首次在甘藍(lán)型油菜上成功地獲得再生植株［3］；Sato等通過大白菜游離小孢子培養(yǎng)形成雙單倍體植株用于育種［4］；Takahata等對3種花青菜的供體植株進(jìn)行低溫處理，然后再進(jìn)行小孢子培養(yǎng)獲得胚狀體［5］；蔣武生等對蕪菁小孢子熱激處理后培養(yǎng)獲得胚狀體［6］；喬麗桃等對蕪菁花蕾長度與小孢子單核靠邊期的關(guān)系進(jìn)行初步探究，并觀察了蕪菁小孢子胚胎發(fā)生的顯微結(jié)構(gòu)［7］；王娜等研究了蕪菁花蕾大小與小孢子發(fā)育時期、小孢子胚胎發(fā)生率的對應(yīng)關(guān)系［8］，但在試驗過程中發(fā)現(xiàn)，蕪菁胚狀體發(fā)生率較低，這為后續(xù)試驗的進(jìn)行帶來不便。因此，本試驗對蕪菁小孢子胚狀體發(fā)生過程中的影響因素進(jìn)行研究，以提高蕪菁小孢子出胚率，從而為新疆蕪菁的遺傳育種研究提供基礎(chǔ)條件。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

供試材料來源于新疆柯坪縣當(dāng)?shù)剞r(nóng)家蕪菁品種阿恰蕪菁。2015年8月于新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)與園藝學(xué)院試驗田中種植蕪菁材料，將收獲的蕪菁肉質(zhì)根置于4℃低溫下保存。2016年4月21日將已經(jīng)通過低溫春化的肉質(zhì)根種植于露地，5月8日植株陸續(xù)抽薹開花，植株生長環(huán)境溫度范圍為12～26℃。

1.2 試驗方法

1.2.1 花蕾的采集與處理 于每日 08：00—10：00（采蕾環(huán)境溫度范圍為15～18℃）隨機(jī)摘取供試植株的主花序或一級分枝花序放入培養(yǎng)皿中，置于放有冰袋的泡沫箱中及時帶回組培實(shí)驗室。將花序上的花蕾輕輕用鑷子取下，選取處于單核靠邊期的花蕾［8］（約2.0～3.0mm）轉(zhuǎn)移到2%NaClO（含2滴吐溫乳化劑）中消毒10 min，再用無菌水沖洗3次，每次5 min?；ɡ傧炯靶℃咦佑坞x與培養(yǎng)的整個試驗過程均在無菌條件下完成，且所用試驗工具及液體都經(jīng)滅菌后置于4℃條件預(yù)冷。

1.2.2 小孢子的游離與培養(yǎng) 將消毒過的花蕾置于燒杯中，并加入1 mL B5洗滌培養(yǎng)基（pH值5.8），用注射器活塞壓榨花蕾，釋放小孢子，通過45μm尼龍篩網(wǎng)過濾小孢子懸浮液。將收集的濾液用B5培養(yǎng)基定容至5 mL，4℃、800 r／min離心5 min，之后倒掉上清液，留下沉淀，再倒入5mL B5培養(yǎng)基，重新懸浮小孢子并離心，共離心3次。最后，將收集到的小孢子用1 mLNLN培養(yǎng)基制成懸浮液，調(diào)整小孢子密度為10萬～20萬個／mL，分裝至直徑為60 mm的培養(yǎng)皿中，每皿約3 mL，用Parafilm膜封口。

1.2.3 不同處理方法對小孢子胚胎發(fā)生率的影響 小孢子的高溫?zé)峒ぬ幚恚簩⒉惶砑蛹に氐腘LN－13小孢子懸浮液放入恒溫箱中黑暗靜置培養(yǎng)，分別設(shè)置25℃（CK）、33℃、35℃共3種溫度和24、48、72 h共3種時間的熱激處理，隨后轉(zhuǎn)到25℃繼續(xù)黑暗靜置培養(yǎng)。

不同蔗糖濃度的培養(yǎng)基培養(yǎng)：分別用 NLN－9（蔗糖9%）、NLN－13（蔗糖13%）（CK）、NLN－15（蔗糖15%）3種不同蔗糖濃度且不含激素的NLN液體培養(yǎng)基懸浮培養(yǎng)小孢子，隨后分裝于60 mm培養(yǎng)皿中，每皿3 mL，Parafilm膜封口。經(jīng)33℃、24 h熱激處理后轉(zhuǎn)到25℃黑暗靜置培養(yǎng)。

培養(yǎng)基中添加6－BA和NAA培養(yǎng)：將小孢子沉淀物均勻懸浮于含有不同濃度 NAA（0.1、0.2、0.4 mg／L）、6－BA（0.1、0.2、0.4 mg／L）激素含量的 NLN－13培養(yǎng)基中，并分裝于60 mm培養(yǎng)皿中，每皿3 mL，Parafilm膜封口。以不添加任何激素的NLN－13培養(yǎng)基作為對照組（CK）。經(jīng)33℃、24 h熱激處理后轉(zhuǎn)到25℃黑暗靜置培養(yǎng)。

1.2.4 胚狀體的觀察 以上試驗每個處理均取20個花蕾。培養(yǎng)30 d后統(tǒng)計產(chǎn)胚量，并將形成的小孢子胚轉(zhuǎn)入固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)。在培養(yǎng)過程中使用倒置顯微鏡觀察小孢子的變化，采用 Duncans新復(fù)極差法進(jìn)行產(chǎn)胚量間差異顯著性比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同熱激溫度、時間處理對蕪菁胚狀體發(fā)生的影響

由表1可知，在其他培養(yǎng)條件相同的情況下，25℃（CK）條件下恒溫培養(yǎng)未出現(xiàn)胚狀體；熱激溫度為33℃、時間為24 h時，出胚率最高，為1.25胚／蕾，48 h后胚誘導(dǎo)率降至0.60胚／蕾，72 h后胚誘導(dǎo)率僅為0.05胚／蕾；當(dāng)熱激35℃、時間為 24 h時，胚誘導(dǎo)率為 0.35胚／蕾，48 h時為 0.20胚／蕾。本研究過程中還發(fā)現(xiàn)，33℃培養(yǎng)條件下形成的胚狀體中子葉形胚比率最高，達(dá)到94.5%；而35℃時，子葉形胚比率僅為63.6%，這可能是由于熱激溫度過高，不適于小孢子的發(fā)育。有研究認(rèn)為，熱激時間以24 h為出胚率最高，小孢子培養(yǎng)的前12 h是小孢子分裂的敏感期，而胚胎發(fā)生的敏感期在開始培養(yǎng)的24 h內(nèi)［9］。由此可見，熱激處理對于蕪菁的小孢子胚胎發(fā)生是必需的，本研究得出33℃、24 h的熱激處理適用于蕪菁游離小孢子培養(yǎng)。

表1 不同熱激溫度、時間處理對蕪菁胚狀體發(fā)生的影響

2.2 不同蔗糖濃度對蕪菁胚狀體發(fā)生的影響

蔗糖在小孢子培養(yǎng)的過程中調(diào)控著培養(yǎng)基的營養(yǎng)成分和滲透壓［10］。由表2可知，13%蔗糖濃度（NLN－13）誘導(dǎo)率最高，為1.25胚／蕾；在蔗糖濃度為15%（NLN－15）時，出胚量相對較少，平均為0.85胚／蕾；蔗糖濃度為9%（NLN－9）時，未出現(xiàn)胚狀體。結(jié)果表明，當(dāng)蔗糖濃度為13%（NLN－13）和15%（NLN－15）時能夠誘導(dǎo)出胚狀體，但13%（NLN－13）的蔗糖濃度最適于蕪菁小孢子的胚胎發(fā)生。

表2 不同蔗糖濃度對蕪菁胚狀體發(fā)生的影響

2.3 不同激素配比對蕪菁胚狀體發(fā)生的影響

由表3可知，NLN－13培養(yǎng)基中單獨(dú)添加6－BA時，小孢子胚誘導(dǎo)率較CK并無顯著提高；添加0.1 mg／L 6－BA時出胚率相對最高，達(dá)到2.10胚／蕾；高濃度的6－BA有抑制胚狀體的現(xiàn)象發(fā)生，當(dāng)6－BA濃度為0.4 g／L時，出胚率降低到0.6胚／蕾，在所有激素處理中處于最低水平。培養(yǎng)基中單獨(dú)添加NAA時，出胚率顯著高于CK，隨NAA濃度增加，出胚率呈先上升后下降的趨勢，當(dāng)NAA濃度為0.2 mg／L時達(dá)到最高，為8.60胚／蕾，是 CK的4.7倍，添加0.2 mg／LNAA是所有處理中能最有效提高出胚率的方法。在培養(yǎng)基中同時添加NAA與6－BA時，出胚率有小幅提升；當(dāng)同時添加0.2 mg／L NAA和0.2 mg／L 6－BA時，蕪菁小孢子的胚胎發(fā)生率達(dá)到最高，為3.15胚／蕾；增大NAA與6－BA濃度分別到0.4 mg／L時，胚誘導(dǎo)率下降到1.10胚／蕾。在培養(yǎng)基中加入激素能有效地提高小孢子胚胎發(fā)生的頻率，但是加入激素后，胚狀體的發(fā)育狀況也受到影響。單獨(dú)添加6－BA的處理中，所誘導(dǎo)出的胚狀體發(fā)育不完全，畸形胚數(shù)量相對較少；單獨(dú)添加0.2 mg／L NAA時，子葉形胚占胚狀體總數(shù)的比率相對較高，達(dá)到72.1%；當(dāng)NAA濃度為0.4 mg／L時，子葉形胚比率下降到 52.3%。綜上所述，在培養(yǎng)基中單獨(dú)添加0.2 mg／L NAA可以有效提高蕪菁小孢子胚誘導(dǎo)率，且子葉形胚比率相對較高。當(dāng)在培養(yǎng)基中同時添加NAA與6－BA時，并不能使小孢子胚胎發(fā)生與發(fā)育朝著良好的方向發(fā)展。

2.4 小孢子離體發(fā)育過程

從圖1可以看出，小孢子的膨大情況各不相同，同一處理中出現(xiàn)了膨大的小孢子和未有變化的小孢子（圖1－A）；隨著培養(yǎng)時間的增加，小孢子形成細(xì)胞團(tuán)（圖1－B）；細(xì)胞團(tuán)發(fā)育成為胚狀體的過程為球形胚－魚雷形胚－心形胚－子葉形胚（圖1－C、圖1－D、圖1－E、圖1－F）；未含激素的培養(yǎng)基中產(chǎn)生的小孢子胚發(fā)育狀況良好（圖1－G）；添加激素后小孢子胚胎數(shù)明顯增多，但胚狀體發(fā)育情況各異，出現(xiàn)較多畸形胚（圖1－H）；胚狀體轉(zhuǎn)接至固體培養(yǎng)基后轉(zhuǎn)綠（圖1－I）。將小孢子胚接種于 B5＋0.2 mg／L 6－BA ＋0.05 mg／L NAA固體培養(yǎng)基上，胚狀體逐漸轉(zhuǎn)綠并開始萌發(fā)，胚狀體萌發(fā)后形成較多幼芽。然后將幼芽轉(zhuǎn)入B5＋0.2 mg／L NAA生根培養(yǎng)基上可以生根，形成完整植株。

3 結(jié)論與討論

目前游離小孢子培養(yǎng)技術(shù)在大多數(shù)蔬菜的育種工作中都得以運(yùn)用，本試驗在已確定小孢子處于單核靠邊期時花蕾大小的對應(yīng)關(guān)系后，主要針對南疆地區(qū)主栽農(nóng)家蕪菁品種阿恰蕪菁進(jìn)行誘導(dǎo)，探究小孢子出胚的最適條件以獲得更多數(shù)量的雙單倍體純合植株。

高溫?zé)峒ぬ幚砜梢愿淖冃℃咦拥陌l(fā)育途徑，使其不能形成成熟的花粉粒轉(zhuǎn)而向胚胎發(fā)育的途徑發(fā)展，形成小孢子胚［11］。本研究認(rèn)為，33℃、24 h的高溫?zé)峒ぬ幚韺κ忀夹℃咦优咛グl(fā)生是必要的，出胚率為1.25胚／蕾，而且小孢子胚的生長狀況良好，多數(shù)可發(fā)育成子葉形胚。培養(yǎng)基中的蔗糖一方面維持著小孢子生長發(fā)育所需要的營養(yǎng)物質(zhì)，另一方面調(diào)節(jié)著培養(yǎng)基中的滲透壓［12－13］。在誘導(dǎo)油菜、大白菜等小孢子胚狀體過程中發(fā)現(xiàn)，當(dāng)NLN培養(yǎng)基中的蔗糖濃度為13%時，小孢子胚的發(fā)生與發(fā)育狀況最好［14］，這與本研究所得結(jié)論一致。蔣武生等研究發(fā)現(xiàn)，不含任何激素的NLN培養(yǎng)基有利于胚狀體的發(fā)育［15］；朱守亮等在 NLN－13培養(yǎng)基中添加0.1 mg／L 6－BA和 0.05 mg／L NAA能夠誘導(dǎo)出高胚產(chǎn)量［16］；李巖等研究發(fā)現(xiàn)，NLN培養(yǎng)基中加入0.05mg／LNAA和0.05mg／L 6－BA的胚誘導(dǎo)率顯著高于不加入任何激素的NLN培養(yǎng)基［17］；戴希剛等在進(jìn)行羽衣甘藍(lán)的小孢子培養(yǎng)試驗中發(fā)現(xiàn)，6－BA對胚胎發(fā)生有抑制作用［18］。本試驗結(jié)果表明，在NLN培養(yǎng)基中單獨(dú)添加0.2 mg／L NAA可以顯著提高小孢子出胚數(shù)，單獨(dú)添加低濃度的6－BA能夠促進(jìn)蕪菁小孢子胚的發(fā)生，但效果不如NAA明顯，混合加入NAA與6－BA對小孢子胚的產(chǎn)生無明顯作用。同時研究發(fā)現(xiàn)，添加激素后小孢子的胚胎發(fā)育受到一定影響，培養(yǎng)過程中出現(xiàn)畸形胚，胚狀體到一定時期并不會再向著子葉形胚發(fā)展。本試驗研究認(rèn)為，采用33℃熱激處理24 h時，在NLN－13中加入0.2 mg／L NAA是蕪菁游離小孢子的胚胎發(fā)生與發(fā)育的最佳條件。

表3 不同激素濃度對蕪菁胚狀體發(fā)生的影響

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