賈 凱,吳 慧,許 建,高 杰
(新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)與園藝學(xué)院,新疆烏魯木齊830052)
蕪菁(Brassica rapa L.)屬十字花科蕓薹屬2年生根菜類蔬菜。在新疆維吾爾語中稱恰麻古,是維吾爾族居民食藥兩用的傳統(tǒng)蔬菜[1]。目前,新疆地區(qū)所栽培的蕪菁品種混雜,多為農(nóng)戶自行留種后育成的農(nóng)家品種,由于這些農(nóng)家品種存在提早抽薹現(xiàn)象嚴(yán)重且容易遭受病蟲害,因此選育新的雜交品種已成為蕪菁育種的主要方向。選育新的雜交品種需要純合的親本進(jìn)行雜交,獲得純合的親本一般通過常規(guī)技術(shù)進(jìn)行多代自交,此方法耗時長、效率低。利用游離小孢子培養(yǎng)方法,可在1~2年內(nèi)獲得穩(wěn)定的純合自交系,縮短育種周期,提高育種效率[2]。因此,游離小孢子培養(yǎng)技術(shù)是蕪菁育種的一條有效途徑。
有關(guān)游離小孢子培養(yǎng)技術(shù)方面前人做了許多研究,其中,Lichter利用小孢子培養(yǎng)技術(shù)首次在甘藍(lán)型油菜上成功地獲得再生植株[3];Sato等通過大白菜游離小孢子培養(yǎng)形成雙單倍體植株用于育種[4];Takahata等對3種花青菜的供體植株進(jìn)行低溫處理,然后再進(jìn)行小孢子培養(yǎng)獲得胚狀體[5];蔣武生等對蕪菁小孢子熱激處理后培養(yǎng)獲得胚狀體[6];喬麗桃等對蕪菁花蕾長度與小孢子單核靠邊期的關(guān)系進(jìn)行初步探究,并觀察了蕪菁小孢子胚胎發(fā)生的顯微結(jié)構(gòu)[7];王娜等研究了蕪菁花蕾大小與小孢子發(fā)育時期、小孢子胚胎發(fā)生率的對應(yīng)關(guān)系[8],但在試驗過程中發(fā)現(xiàn),蕪菁胚狀體發(fā)生率較低,這為后續(xù)試驗的進(jìn)行帶來不便。因此,本試驗對蕪菁小孢子胚狀體發(fā)生過程中的影響因素進(jìn)行研究,以提高蕪菁小孢子出胚率,從而為新疆蕪菁的遺傳育種研究提供基礎(chǔ)條件。
供試材料來源于新疆柯坪縣當(dāng)?shù)剞r(nóng)家蕪菁品種阿恰蕪菁。2015年8月于新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)與園藝學(xué)院試驗田中種植蕪菁材料,將收獲的蕪菁肉質(zhì)根置于4℃低溫下保存。2016年4月21日將已經(jīng)通過低溫春化的肉質(zhì)根種植于露地,5月8日植株陸續(xù)抽薹開花,植株生長環(huán)境溫度范圍為12~26℃。
1.2.1 花蕾的采集與處理 于每日 08:00—10:00(采蕾環(huán)境溫度范圍為15~18℃)隨機(jī)摘取供試植株的主花序或一級分枝花序放入培養(yǎng)皿中,置于放有冰袋的泡沫箱中及時帶回組培實(shí)驗室。將花序上的花蕾輕輕用鑷子取下,選取處于單核靠邊期的花蕾[8](約2.0~3.0mm)轉(zhuǎn)移到2%NaClO(含2滴吐溫乳化劑)中消毒10 min,再用無菌水沖洗3次,每次5 min?;ɡ傧炯靶℃咦佑坞x與培養(yǎng)的整個試驗過程均在無菌條件下完成,且所用試驗工具及液體都經(jīng)滅菌后置于4℃條件預(yù)冷。
1.2.2 小孢子的游離與培養(yǎng) 將消毒過的花蕾置于燒杯中,并加入1 mL B5洗滌培養(yǎng)基(pH值5.8),用注射器活塞壓榨花蕾,釋放小孢子,通過45μm尼龍篩網(wǎng)過濾小孢子懸浮液。將收集的濾液用B5培養(yǎng)基定容至5 mL,4℃、800 r/min離心5 min,之后倒掉上清液,留下沉淀,再倒入5mL B5培養(yǎng)基,重新懸浮小孢子并離心,共離心3次。最后,將收集到的小孢子用1 mLNLN培養(yǎng)基制成懸浮液,調(diào)整小孢子密度為10萬~20萬個/mL,分裝至直徑為60 mm的培養(yǎng)皿中,每皿約3 mL,用Parafilm膜封口。
1.2.3 不同處理方法對小孢子胚胎發(fā)生率的影響 小孢子的高溫?zé)峒ぬ幚恚簩⒉惶砑蛹に氐腘LN-13小孢子懸浮液放入恒溫箱中黑暗靜置培養(yǎng),分別設(shè)置25℃(CK)、33℃、35℃共3種溫度和24、48、72 h共3種時間的熱激處理,隨后轉(zhuǎn)到25℃繼續(xù)黑暗靜置培養(yǎng)。
不同蔗糖濃度的培養(yǎng)基培養(yǎng):分別用 NLN-9(蔗糖9%)、NLN-13(蔗糖13%)(CK)、NLN-15(蔗糖15%)3種不同蔗糖濃度且不含激素的NLN液體培養(yǎng)基懸浮培養(yǎng)小孢子,隨后分裝于60 mm培養(yǎng)皿中,每皿3 mL,Parafilm膜封口。經(jīng)33℃、24 h熱激處理后轉(zhuǎn)到25℃黑暗靜置培養(yǎng)。
培養(yǎng)基中添加6-BA和NAA培養(yǎng):將小孢子沉淀物均勻懸浮于含有不同濃度 NAA(0.1、0.2、0.4 mg/L)、6-BA(0.1、0.2、0.4 mg/L)激素含量的 NLN-13培養(yǎng)基中,并分裝于60 mm培養(yǎng)皿中,每皿3 mL,Parafilm膜封口。以不添加任何激素的NLN-13培養(yǎng)基作為對照組(CK)。經(jīng)33℃、24 h熱激處理后轉(zhuǎn)到25℃黑暗靜置培養(yǎng)。
1.2.4 胚狀體的觀察 以上試驗每個處理均取20個花蕾。培養(yǎng)30 d后統(tǒng)計產(chǎn)胚量,并將形成的小孢子胚轉(zhuǎn)入固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)。在培養(yǎng)過程中使用倒置顯微鏡觀察小孢子的變化,采用 Duncans新復(fù)極差法進(jìn)行產(chǎn)胚量間差異顯著性比較。
由表1可知,在其他培養(yǎng)條件相同的情況下,25℃(CK)條件下恒溫培養(yǎng)未出現(xiàn)胚狀體;熱激溫度為33℃、時間為24 h時,出胚率最高,為1.25胚/蕾,48 h后胚誘導(dǎo)率降至0.60胚/蕾,72 h后胚誘導(dǎo)率僅為0.05胚/蕾;當(dāng)熱激35℃、時間為 24 h時,胚誘導(dǎo)率為 0.35胚/蕾,48 h時為 0.20胚/蕾。本研究過程中還發(fā)現(xiàn),33℃培養(yǎng)條件下形成的胚狀體中子葉形胚比率最高,達(dá)到94.5%;而35℃時,子葉形胚比率僅為63.6%,這可能是由于熱激溫度過高,不適于小孢子的發(fā)育。有研究認(rèn)為,熱激時間以24 h為出胚率最高,小孢子培養(yǎng)的前12 h是小孢子分裂的敏感期,而胚胎發(fā)生的敏感期在開始培養(yǎng)的24 h內(nèi)[9]。由此可見,熱激處理對于蕪菁的小孢子胚胎發(fā)生是必需的,本研究得出33℃、24 h的熱激處理適用于蕪菁游離小孢子培養(yǎng)。
表1 不同熱激溫度、時間處理對蕪菁胚狀體發(fā)生的影響
蔗糖在小孢子培養(yǎng)的過程中調(diào)控著培養(yǎng)基的營養(yǎng)成分和滲透壓[10]。由表2可知,13%蔗糖濃度(NLN-13)誘導(dǎo)率最高,為1.25胚/蕾;在蔗糖濃度為15%(NLN-15)時,出胚量相對較少,平均為0.85胚/蕾;蔗糖濃度為9%(NLN-9)時,未出現(xiàn)胚狀體。結(jié)果表明,當(dāng)蔗糖濃度為13%(NLN-13)和15%(NLN-15)時能夠誘導(dǎo)出胚狀體,但13%(NLN-13)的蔗糖濃度最適于蕪菁小孢子的胚胎發(fā)生。
表2 不同蔗糖濃度對蕪菁胚狀體發(fā)生的影響
由表3可知,NLN-13培養(yǎng)基中單獨(dú)添加6-BA時,小孢子胚誘導(dǎo)率較CK并無顯著提高;添加0.1 mg/L 6-BA時出胚率相對最高,達(dá)到2.10胚/蕾;高濃度的6-BA有抑制胚狀體的現(xiàn)象發(fā)生,當(dāng)6-BA濃度為0.4 g/L時,出胚率降低到0.6胚/蕾,在所有激素處理中處于最低水平。培養(yǎng)基中單獨(dú)添加NAA時,出胚率顯著高于CK,隨NAA濃度增加,出胚率呈先上升后下降的趨勢,當(dāng)NAA濃度為0.2 mg/L時達(dá)到最高,為8.60胚/蕾,是 CK的4.7倍,添加0.2 mg/LNAA是所有處理中能最有效提高出胚率的方法。在培養(yǎng)基中同時添加NAA與6-BA時,出胚率有小幅提升;當(dāng)同時添加0.2 mg/L NAA和0.2 mg/L 6-BA時,蕪菁小孢子的胚胎發(fā)生率達(dá)到最高,為3.15胚/蕾;增大NAA與6-BA濃度分別到0.4 mg/L時,胚誘導(dǎo)率下降到1.10胚/蕾。在培養(yǎng)基中加入激素能有效地提高小孢子胚胎發(fā)生的頻率,但是加入激素后,胚狀體的發(fā)育狀況也受到影響。單獨(dú)添加6-BA的處理中,所誘導(dǎo)出的胚狀體發(fā)育不完全,畸形胚數(shù)量相對較少;單獨(dú)添加0.2 mg/L NAA時,子葉形胚占胚狀體總數(shù)的比率相對較高,達(dá)到72.1%;當(dāng)NAA濃度為0.4 mg/L時,子葉形胚比率下降到 52.3%。綜上所述,在培養(yǎng)基中單獨(dú)添加0.2 mg/L NAA可以有效提高蕪菁小孢子胚誘導(dǎo)率,且子葉形胚比率相對較高。當(dāng)在培養(yǎng)基中同時添加NAA與6-BA時,并不能使小孢子胚胎發(fā)生與發(fā)育朝著良好的方向發(fā)展。
從圖1可以看出,小孢子的膨大情況各不相同,同一處理中出現(xiàn)了膨大的小孢子和未有變化的小孢子(圖1-A);隨著培養(yǎng)時間的增加,小孢子形成細(xì)胞團(tuán)(圖1-B);細(xì)胞團(tuán)發(fā)育成為胚狀體的過程為球形胚-魚雷形胚-心形胚-子葉形胚(圖1-C、圖1-D、圖1-E、圖1-F);未含激素的培養(yǎng)基中產(chǎn)生的小孢子胚發(fā)育狀況良好(圖1-G);添加激素后小孢子胚胎數(shù)明顯增多,但胚狀體發(fā)育情況各異,出現(xiàn)較多畸形胚(圖1-H);胚狀體轉(zhuǎn)接至固體培養(yǎng)基后轉(zhuǎn)綠(圖1-I)。將小孢子胚接種于 B5+0.2 mg/L 6-BA +0.05 mg/L NAA固體培養(yǎng)基上,胚狀體逐漸轉(zhuǎn)綠并開始萌發(fā),胚狀體萌發(fā)后形成較多幼芽。然后將幼芽轉(zhuǎn)入B5+0.2 mg/L NAA生根培養(yǎng)基上可以生根,形成完整植株。
目前游離小孢子培養(yǎng)技術(shù)在大多數(shù)蔬菜的育種工作中都得以運(yùn)用,本試驗在已確定小孢子處于單核靠邊期時花蕾大小的對應(yīng)關(guān)系后,主要針對南疆地區(qū)主栽農(nóng)家蕪菁品種阿恰蕪菁進(jìn)行誘導(dǎo),探究小孢子出胚的最適條件以獲得更多數(shù)量的雙單倍體純合植株。
高溫?zé)峒ぬ幚砜梢愿淖冃℃咦拥陌l(fā)育途徑,使其不能形成成熟的花粉粒轉(zhuǎn)而向胚胎發(fā)育的途徑發(fā)展,形成小孢子胚[11]。本研究認(rèn)為,33℃、24 h的高溫?zé)峒ぬ幚韺κ忀夹℃咦优咛グl(fā)生是必要的,出胚率為1.25胚/蕾,而且小孢子胚的生長狀況良好,多數(shù)可發(fā)育成子葉形胚。培養(yǎng)基中的蔗糖一方面維持著小孢子生長發(fā)育所需要的營養(yǎng)物質(zhì),另一方面調(diào)節(jié)著培養(yǎng)基中的滲透壓[12-13]。在誘導(dǎo)油菜、大白菜等小孢子胚狀體過程中發(fā)現(xiàn),當(dāng)NLN培養(yǎng)基中的蔗糖濃度為13%時,小孢子胚的發(fā)生與發(fā)育狀況最好[14],這與本研究所得結(jié)論一致。蔣武生等研究發(fā)現(xiàn),不含任何激素的NLN培養(yǎng)基有利于胚狀體的發(fā)育[15];朱守亮等在 NLN-13培養(yǎng)基中添加0.1 mg/L 6-BA和 0.05 mg/L NAA能夠誘導(dǎo)出高胚產(chǎn)量[16];李巖等研究發(fā)現(xiàn),NLN培養(yǎng)基中加入0.05mg/LNAA和0.05mg/L 6-BA的胚誘導(dǎo)率顯著高于不加入任何激素的NLN培養(yǎng)基[17];戴希剛等在進(jìn)行羽衣甘藍(lán)的小孢子培養(yǎng)試驗中發(fā)現(xiàn),6-BA對胚胎發(fā)生有抑制作用[18]。本試驗結(jié)果表明,在NLN培養(yǎng)基中單獨(dú)添加0.2 mg/L NAA可以顯著提高小孢子出胚數(shù),單獨(dú)添加低濃度的6-BA能夠促進(jìn)蕪菁小孢子胚的發(fā)生,但效果不如NAA明顯,混合加入NAA與6-BA對小孢子胚的產(chǎn)生無明顯作用。同時研究發(fā)現(xiàn),添加激素后小孢子的胚胎發(fā)育受到一定影響,培養(yǎng)過程中出現(xiàn)畸形胚,胚狀體到一定時期并不會再向著子葉形胚發(fā)展。本試驗研究認(rèn)為,采用33℃熱激處理24 h時,在NLN-13中加入0.2 mg/L NAA是蕪菁游離小孢子的胚胎發(fā)生與發(fā)育的最佳條件。
表3 不同激素濃度對蕪菁胚狀體發(fā)生的影響
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