鄭穎 李強(qiáng) 陽(yáng)慧 林德洪 邢波

中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院附屬?？谑腥嗣襻t(yī)院心內(nèi)科（?？?570208）

冠狀動(dòng)脈側(cè)支循環(huán)（coronary collateral circula?tion，CCC）形成是心肌缺血缺氧后建立起來(lái)的代償機(jī)制，有助于緩解臨床癥狀，提高生存質(zhì)量［1］。目前認(rèn)為，側(cè)支循環(huán)的形成受冠狀動(dòng)脈狹窄程度的影響［2］，但是其中的分子機(jī)制尚不明確。miR?NAs作為高度保守的非編碼小RNA，參與了眾多生物過(guò)程的調(diào)控［3］。miRNA?195是 microRNA?15/16/195/424/497 家族中的一員［4］，有研究［5］表明，miRNA?195參與了多種心血管疾病的進(jìn)展過(guò)程。為此，本研究試圖探討冠狀動(dòng)脈嚴(yán)重狹窄患者血漿miRNA?195的表達(dá)及其與側(cè)支循環(huán)形成的關(guān)系，目的在于發(fā)現(xiàn)對(duì)于冠狀動(dòng)脈側(cè)支循環(huán)形成有價(jià)值的生物標(biāo)記物。現(xiàn)報(bào)道如下。

1 對(duì)象與方法

1.1 病案選取 入選病例為2016年3月-2017年5月期間我院血管內(nèi)科住院并接受選擇性冠狀動(dòng)脈造影（Coronary angiography，CAG）檢查的患者，共190例。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）符合2014年美國(guó)心臟病學(xué)院（American College of Cardiology，ACC）和美國(guó)心臟協(xié)會(huì)（American Heart Association，AHA）修訂版診療指南中的診斷標(biāo)準(zhǔn)［6］；（2）CAG提示左前降支、左回旋支和右冠狀動(dòng)脈3支中至少1支狹窄程度≥90%。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）既往有冠狀動(dòng)脈旁路移植（Coronary artery bypass grafting，CABG）手術(shù)史；（2）既往有經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入（Percutaneous coro?nary intervention，PCI）治療史；（3）冠狀動(dòng)脈畸形；（4）伴有冠狀動(dòng)脈心肌橋；（5）伴有瓣膜性心臟病；（6）急性心肌梗死；（7）急診CAG 或PCI；（8）伴有嚴(yán)重感染、腫瘤、肝腎功能不全等。本研究經(jīng)所有入選者及家屬知情簽字，醫(yī)院倫理委員會(huì)通過(guò)。

1.2 方法

1.2.1 冠狀動(dòng)脈造影以及冠狀動(dòng)脈病變程度的評(píng)估 選擇橈動(dòng)脈或股動(dòng)脈穿刺行CAG檢查。儀器為Philips HC500型心血管專(zhuān)用X線(xiàn)機(jī)，視野為7英寸，12.5f/s采集。圖像以512×512矩陣、DICOM格式儲(chǔ)存、刻盤(pán)。

冠狀動(dòng)脈病變程度的評(píng)估采用Gensini積分法［7］。按照AHA制定的冠狀動(dòng)脈血管圖像記錄分段評(píng)估標(biāo)準(zhǔn)評(píng)定所有分支血管的病變程度，狹窄程度≤25%為1分，25%～49%之間為2分，50%～74%之間為4分，75%～89%之間為8分，90%～99%之間為16分，100%為32分。不同節(jié)段冠狀動(dòng)脈病變程度分別為各自評(píng)分乘以相應(yīng)系數(shù)，具體為：左冠狀動(dòng)脈主干病變程度＝得分X5，左前降支近段病變程度＝得分X 2.5，左前降支中段病變程度＝得分X 1.5，左前降支遠(yuǎn)段病變程度＝得分X1，對(duì)角支（D1）病變程度＝得分X1，對(duì)角支（D1）病變程度＝得分X0.5，左回旋支近段病變程度＝得分X 2.5，左回旋支遠(yuǎn)端病變程度＝得分X1，后降支病變程度＝得分X1，后側(cè)支病變程度＝得分X 0.5，右冠病狀動(dòng)脈近段、中段、遠(yuǎn)段和后降支病變程度（均）＝得分X1。最終積分為所有病變分支積分之和。

1.2.2 冠狀動(dòng)脈側(cè)支循環(huán)的分級(jí) 采用Rentrop法［8］對(duì)冠狀動(dòng)脈側(cè)支循環(huán)進(jìn)行分級(jí)，具體為：（1）0級(jí)：無(wú)任何側(cè)支循環(huán)被造影劑充盈；（2）1級(jí)：造影劑充盈側(cè)支循環(huán)病變血管的分支，但沒(méi)有到達(dá)心外膜下血管段；（3）2級(jí)：造影劑充盈部分心外膜下血管段；（4）3級(jí)：造影劑充盈整個(gè)心外膜下血管段。其中，0、1級(jí)視為側(cè)支循環(huán)不良，2、3級(jí)視為側(cè)支循環(huán)良好。

1.2.3 血漿miRNA?195的檢測(cè) 所有入選患者者在入院后第2天清晨于空腹?fàn)顟B(tài)下采肘靜脈血5 mL，對(duì)照組在體檢當(dāng)天上午空腹?fàn)顟B(tài)下采肘靜脈血5 mL，置于EDTA抗凝試管中，室溫下靜置20 min，3 000 r/min離心15 min，分離血漿置于1.5 mL EP管中，-20℃保存。

采用Trizol溶液（美國(guó)Invitrogen生產(chǎn)）提取總RNA。步驟如下：（1）冰上融化冷凍血漿；（2）取250 μL血漿和1 mL Trizol置入無(wú)Rnase的EP管中，渦旋混勻，室溫下靜置5 min；（3）加入0.2 mL氯仿，振蕩15 s后，室溫下靜置5 min；（4）4 ℃，12 000 r/m離心10 min，取0.5 mL上層水相，置入另外的無(wú)Rnase的 EP管中；（5）加入0.5 mL異丙醇，渦旋混勻，室溫下靜置5 min；（6）4℃，12 000 r/min離心10 min，去上清，RNA沉淀于離心管管底；（7）加入75%乙醇1 mL，洗滌RNA沉淀，4℃，12 000 r/min離心2 min，去上清；（8）4℃，12 000 r/min離心1 min，去上清；（9）晾干，置于空氣中 5～10 min，干燥RNA 沉淀；（10）加入 10～20 μL DEPC H2O 溶解RNA沉淀。

PCR擴(kuò)增。引物由生工生物工程有限公司生產(chǎn)，miRNA?195 的上游引物5′?UAGCAGCACAGA?AAUAUUGGC?3′，下游引物 5′?CAAUAUUUCU?GUGCUGCUAUU?3′；引物序列正義鏈5′?ACCATG?GATGATGATATCGCC?3′，反義鏈 5′?GCCTTGCA?CATGCCGG?3′；反應(yīng)條件：95 ℃ 10 min、95 ℃ 15 s、60℃ 1 min，50個(gè)循環(huán)。

測(cè)序與分析。將miRNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，采用熒光定量的方法檢測(cè)（熒光定量檢測(cè)試劑盒由北京全式金生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)），miRNA?195的表達(dá)量 =2-ΔCT，ΔCT=CT（miRNA?195）－CT（內(nèi)參引物）（內(nèi)參引物為18sRNA引物，由生工生物工程有限公司生產(chǎn)）。

1.2.4 血漿血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothe?lial growth factor，VEGF）的檢測(cè) 所有入選患者者在入院后第2天清晨于空腹?fàn)顟B(tài)下采肘靜脈血5 mL，對(duì)照組在體檢當(dāng)天上午空腹?fàn)顟B(tài)下采肘靜脈血5 mL，EDTA抗凝，室溫下靜置20 min，2 000 r/min離心10 min，分離血漿轉(zhuǎn)入EP管中，-20℃保存。采用ELISA法檢測(cè)血漿VEGF水平（試劑盒由美國(guó)R&D公司生產(chǎn)并提供）。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 19.0進(jìn)行分析處理。計(jì)量資料的正態(tài)檢驗(yàn)采用One?Sample Kolmogorov?Smirnov Test法，正態(tài)分布的計(jì)量數(shù)據(jù)用±s表示，兩組間數(shù)據(jù)比較采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料采用率或百分比（%）表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)；相關(guān)性檢驗(yàn)采用Persona分析；取P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 比較側(cè)支循環(huán)不良組與側(cè)支循環(huán)良好組的基線(xiàn)指標(biāo) Rentrop法分級(jí)顯示，入選患者中側(cè)支循環(huán)不良者90例，側(cè)支循環(huán)良好者100例。經(jīng)過(guò)比較發(fā)現(xiàn)，除了側(cè)支循環(huán)良好組的Gensini積分明顯高于側(cè)支循環(huán)不良組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），其他所有基線(xiàn)指標(biāo)差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性，見(jiàn)表1。

表1 側(cè)支循環(huán)不良組與側(cè)支循環(huán)良好組基線(xiàn)指標(biāo)的比較Tab.1 Comparison of baseline indicators between poor collateral circulation group and good collateral circulation group ±s

表1 側(cè)支循環(huán)不良組與側(cè)支循環(huán)良好組基線(xiàn)指標(biāo)的比較Tab.1 Comparison of baseline indicators between poor collateral circulation group and good collateral circulation group ±s

注：性別★、糖尿病★、高血壓★、吸煙史★、服用ACEI/ARB類(lèi)藥物★、服藥β-受體阻滯劑★、服用他汀類(lèi)藥物★采用χ2檢驗(yàn)，其余基線(xiàn)指標(biāo)采用t檢驗(yàn)

基線(xiàn)指標(biāo)性別★男［例（%）］女［例（%）］年齡（歲）病程（年）糖尿?。劾?）］★高血壓［例（%）］★吸煙史［例（%）］★服用ACEI/ARB類(lèi)藥物［例（%）］★服藥β-受體阻滯劑［例（%）］★服用他汀類(lèi)藥物［例（%）］★TG（mmol/L）TC（mmol/L）HDL?C（mmol/L）LDL?C（mmol/L）Gensini積分側(cè)支循環(huán)不良組（n=90） 側(cè)支循環(huán)良好組（n=100）t（χ 2）值0.217 P值0.642 51（56.67）39（43.33）61.45±7.33 5.13±0.62 26（28.89）39（43.33）18（20.00）51（56.67）59（65.56）80（88.89）1.75±0.22 5.19±0.67 0.95±0.05 3.70±0.45 67.51±8.55 60（60.00）40（40.00）61.89±8.13 5.30±0.71 42（42.00）51（51.00）25（25.00）63（63.00）73（73.00）95（95.00）1.79±0.25 5.25±0.72 0.96±0.06 3.75±0.51 118.35±14.56 0.390 1.749 2.580 1.117 0.676 0.792 1.238 2.433 1.165 0.593 1.240 0.713 29.690 0.697 0.082 0.108 0.291 0.411 0.374 0.266 0.119 0.245 0.554 0.216 0.477 0.000

2.2 比較側(cè)支循環(huán)不良組與側(cè)支循環(huán)良好組的血漿miRNA?195和VEGF水平 結(jié)果顯示，側(cè)支循環(huán)良好組的血漿miRNA?195和VEGF水平均明顯高于側(cè)支循環(huán)不良組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)表2。

表2 側(cè)支循環(huán)不良組與側(cè)支循環(huán)良好組血漿miRNA?195和VEGF水平的比較Tab.2 Comparison of plasma miRNA?195 and VEGF levels between poor collateral circulation group and good collateral circulation group ±s

表2 側(cè)支循環(huán)不良組與側(cè)支循環(huán)良好組血漿miRNA?195和VEGF水平的比較Tab.2 Comparison of plasma miRNA?195 and VEGF levels between poor collateral circulation group and good collateral circulation group ±s

組別側(cè)支循環(huán)不良組側(cè)支循環(huán)良好組t值P值例數(shù)90 100血漿miRNA?195（2－ΔCT）4.45±0.40 7.62±0.85 33.410 0.000血漿VEGF（ng/L）215.25±25.62 364.08±38.52 31.637 0.000

2.3 所有入選患者血漿miRNA?195與VEGF水平的相關(guān)性分析 Person相關(guān)分析顯示，冠心病患者血漿miRNA?195與VEGF水平呈正相關(guān)性（r=0.628，P=0.022）。

2.4 所有入選患者血漿miRNA?195與Gensini積分的相關(guān)性分析 Person相關(guān)分析顯示，冠心病患者血漿miRNA?195與Gensini積分呈正相關(guān)性（r=0.765，P=0.013）。

3 討論

側(cè)支循環(huán)能夠代償?shù)毓┭牟蛔?，保護(hù)左室功能、縮小梗死面積，減少各種心臟不良事件的發(fā)生率，是缺血性心臟病的重要保護(hù)機(jī)制［1］。目前，由于側(cè)支循環(huán)需要經(jīng)過(guò)CAG這樣的有創(chuàng)檢查才能夠被證實(shí)，因此尋找一種可以預(yù)測(cè)側(cè)支循環(huán)形成的生物標(biāo)記物具有一定的臨床意義。

研究顯示［9］，miRNAs在病理過(guò)程中的變化較其他生物標(biāo)記物要早，并且血漿中的miRNAs大多與蛋白結(jié)合或被脂質(zhì)包膜包裹，穩(wěn)定性高，不容易被RNA酶降解，因此將血漿中的miRNA作為疾病檢測(cè)的生物學(xué)標(biāo)記物具有可操作性。研究已證實(shí)［10］，miRNA?195在心血管疾病的進(jìn)程中起著重要作用，在急慢性缺血性心臟病的心肌肥厚、心肌纖維化的過(guò)程中均發(fā)現(xiàn)有miRNA?195的參與，在主要的心血管細(xì)胞中（內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞）均發(fā)現(xiàn)miRNA?195的高表達(dá)，甚至是心血管疾病進(jìn)程中的差異性表達(dá)。本研究就發(fā)現(xiàn)，在冠狀動(dòng)脈嚴(yán)重狹窄的患者中，側(cè)支循環(huán)良好組的血漿miR?NA?195明顯高于側(cè)支循環(huán)不良組，與有關(guān)文獻(xiàn)的結(jié)果吻合。

VEGF在新生血管的生成過(guò)程中具有重要作用，側(cè)支循環(huán)的血管生成大約需要10 ～ 14 d［1］，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示，大鼠急性心梗模型術(shù)后14 d VEGF動(dòng)態(tài)水平達(dá)到峰值［11］，犬心肌缺血模型術(shù)后21 d的VEGF呈現(xiàn)持續(xù)上升趨勢(shì)［12］。有學(xué)者指出［13］，可能是miRNA以調(diào)控VEGF的方式誘發(fā)了側(cè)支循環(huán)的形成，但并未肯定是miRNA?195。有文獻(xiàn)表明［14］，血漿VEGF水平與側(cè)支循環(huán)的形成情況呈正相關(guān)性，即血漿VEGF水平越高則側(cè)支循環(huán)越良好。本研究顯示，側(cè)支循環(huán)良好組的血漿VEGF水平均高于側(cè)支循環(huán)不良組，與文獻(xiàn)結(jié)論一致。

本研究經(jīng)過(guò)Person相關(guān)分析發(fā)現(xiàn)，冠心病患者血漿miRNA?195與VEGF水平呈正相關(guān)性。MA等［15］發(fā)現(xiàn)，miRNAs作為缺氧性誘導(dǎo)基因，在其表達(dá)上調(diào)后能夠引發(fā)白細(xì)胞的增加和NF?kB表達(dá)的上調(diào)，促使IL?6、IL?8等炎性因子的釋放，從而加強(qiáng)機(jī)體的炎性反應(yīng)，在持續(xù)炎癥反應(yīng)的作用下，VEGF釋放增加促發(fā)了新生血管的生成。雖然目前并未見(jiàn)文獻(xiàn)顯示miRNA?195直接參與了VEGF表達(dá)的上調(diào)，但是可以推測(cè)血漿miRNA?195與VEGF水平具有比較密切的關(guān)系。

本研究最后的數(shù)據(jù)分析顯示，冠心病患者血漿miRNA?195與Gensini積分呈正相關(guān)性。目前臨床上普遍認(rèn)為［16］，冠狀動(dòng)脈的狹窄程度是側(cè)支循環(huán)形成的主要影響因素，狹窄程度越嚴(yán)重則對(duì)側(cè)支循環(huán)形成的影響越大，當(dāng)狹窄程度超過(guò)冠狀動(dòng)脈的90%時(shí)候，其影響程度達(dá)到最大。因此可以認(rèn)為，冠狀動(dòng)脈嚴(yán)重狹窄后，在機(jī)體缺血缺氧等因素的作用下誘發(fā)了miRNA?195表達(dá)的上調(diào)。

綜上所述，冠狀動(dòng)脈嚴(yán)重狹窄患者側(cè)支循環(huán)的形成過(guò)程中，miRNA?195可能是通過(guò)調(diào)控VEGF誘導(dǎo)著新生血管生成的相關(guān)通路發(fā)揮著重要作用，因此可以嘗試將其作為預(yù)測(cè)側(cè)支循環(huán)形成的生物標(biāo)記物供臨床參考。

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