李利華

(陜西理工大學(xué) 化學(xué)與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，陜西 漢中 723000)

丁香(Eugeniacaryophyllata)，為桃金娘科蒲桃屬熱帶植物丁香的干燥花蕾，又稱公丁香。丁香原產(chǎn)于印度尼西亞、馬來(lái)西亞、坦桑尼亞等地，自20世紀(jì)50年代引入我國(guó)南方地區(qū)栽培，其花蕾為重要的食用香辛調(diào)料和中藥材[1]。祖國(guó)醫(yī)學(xué)認(rèn)為[2]，丁香性味辛、溫，歸脾、胃、肺、腎經(jīng)，具有溫中降逆、散寒止痛、補(bǔ)腎助陽(yáng)的功效。現(xiàn)代研究表明[3]：丁香中含有揮發(fā)油、黃酮、多酚等多種活性成分，具有抑菌、鎮(zhèn)痛、麻醉、抗氧化和抗癌等生物活性。目前，有關(guān)丁香中揮發(fā)油的研究已有相關(guān)的報(bào)道[4,5]，而關(guān)于丁香中黃酮類物質(zhì)提取的研究報(bào)道較少。

黃酮類化合物(Flavonoids)是一類廣泛存在于植物的根、莖、果、葉、皮中的次生代謝產(chǎn)物，多數(shù)與糖類結(jié)合成甙而存在的天然有機(jī)化合物[6]。近年來(lái)已有研究證實(shí)[7，8]，黃酮類化合物是一種天然的抗氧化劑，能夠有效阻斷人體脂質(zhì)自氧化，清除體內(nèi)過(guò)量自由基，延緩機(jī)體衰老等，是目前研究的熱點(diǎn)。本研究采用超聲波輔助法提取丁香中的黃酮類化合物，先通過(guò)考察丁香總黃酮提取的4個(gè)主要影響因素：提取劑(乙醇)濃度、提取溫度、料液比和提取時(shí)間對(duì)丁香總黃酮提取率的影響，再采用正交實(shí)驗(yàn)法優(yōu)化丁香總黃酮的超聲波輔助提取工藝參數(shù)條件，皆為丁香總黃酮的開發(fā)利用提供一定理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

丁香：購(gòu)自漢中市健康大藥房，經(jīng)陜西理工大學(xué)生物系李新生教授鑒定為桃金娘科蒲桃屬熱帶植物丁香的干燥花蕾。

蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品：優(yōu)級(jí)純，購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所；無(wú)水乙醇、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉等：以上試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純；實(shí)驗(yàn)用水：二次蒸餾水。

KQ-700VDE三頻式超聲波處理器 昆山超聲儀器公司；UV型紫外-可見分光光度計(jì) 日本島津公司；TD-214型電子分析天平 北京梅特勒-托利多儀器有限公司；中草藥粉碎機(jī) 河北宏博中藥機(jī)械制造有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 丁香總黃酮提取工藝流程

丁香清洗→低溫烘干至恒質(zhì)量→粉碎→石油醚脫脂、脫色→揮發(fā)盡溶劑→乙醇浸提總黃酮→真空抽濾→測(cè)定提取液吸光度→真空干燥得丁香粗總黃酮。

1.2.2 丁香總黃酮提取率的測(cè)定

采用亞硝酸鈉-硝酸鋁顯色法[9]，以蘆丁為標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照品，于510 nm處測(cè)定吸光度值，以吸光度值(A)為縱坐標(biāo)、總黃酮含量(C)為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線方程：A=1.077C+0.135，R=0.9986。

精密移取丁香總黃酮浸提液1.0 mL于10 mL比色管中，分別加入10%的NaNO20.3 mL，10%的Al(NO3)30.3 mL， 4%的NaOH 4.0 mL，以60%乙醇補(bǔ)足至刻度線，室溫下反應(yīng)15 min，利用紫外-可見分光光度計(jì)在波長(zhǎng)510 nm下測(cè)定吸光度A，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算總黃酮含量，并計(jì)算總黃酮浸提率，每個(gè)樣品做3份重復(fù)。

1.2.3 單因素實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

以丁香總黃酮提取率為衡量指標(biāo)，恒定超聲波功率280 W，分別考察4個(gè)主要因素：乙醇濃度(40%，50%，60%，70%，80%，90%)、料液比(1∶10，1∶20，1∶30，1∶40，1∶50，1∶60)、提取溫度(40，50，60，70，80，90 ℃)和提取時(shí)間(30，45，60，75，90，105 min)對(duì)丁香中黃酮類物質(zhì)提取率的影響，每個(gè)處理做3份平行，選取各因素的適宜水平范圍。

1.2.4 正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

由單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，利用L9(34)正交實(shí)驗(yàn)表[10]，優(yōu)化丁香總黃酮的超聲波輔助提取最佳工藝參數(shù)條件，因素水平表見表1。

表1 正交實(shí)驗(yàn)因素水平

1.2.5 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)處理

使用Origin 8.0和SPSS 17.0處理數(shù)據(jù)并做圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素結(jié)果與分析

2.1.1 乙醇濃度對(duì)提取率的影響

圖1 乙醇濃度對(duì)提取率的影響

由圖1可知，乙醇濃度在40%～70%范圍內(nèi)，丁香總黃酮提取率隨乙醇濃度的增大呈上升趨勢(shì)，且在乙醇濃度70%時(shí)提取率最高，為8.25%；而當(dāng)乙醇濃度高于70%后，總黃酮提取率有所下降；這可能是濃度為70%的乙醇與丁香總黃酮的親和能力最強(qiáng)，促使丁香總黃酮最大限度地溶出。因此，乙醇濃度選擇70%左右為最佳濃度條件。

2.1.2 提取溫度對(duì)提取率的影響

圖2 提取溫度對(duì)提取率的影響

由圖2可知，在40～70 ℃范圍內(nèi)，丁香總黃酮的提取率隨著提取溫度的升高明顯增加，提取溫度為70 ℃時(shí)總黃酮提取率達(dá)最大值，為7.98%，之后提取溫度繼續(xù)升高，總黃酮提取率開始下降，90 ℃時(shí)總黃酮提取率僅為6.79%。這說(shuō)明適度升溫加快了分子的擴(kuò)散速度，有利于丁香總黃酮的浸出；而提取溫度過(guò)高一方面會(huì)引起乙醇溶劑的揮發(fā)，另一方面高溫會(huì)使丁香中雜質(zhì)的溶出量增加，導(dǎo)致丁香總黃酮提取率下降。因此，選擇提取溫度70 ℃左右。

2.1.3 料液比對(duì)提取率的影響

圖3 料液比對(duì)提取率的影響

由圖3可知，在料液比由1∶10增加到1∶30過(guò)程中，丁香總黃酮提取率上升較快，說(shuō)明適度增大提取劑的用量有利于原料和提取劑的充分接觸，增加濃度的梯度差，從而提高其提取率；在料液比1∶30～1∶40過(guò)程中，丁香總黃酮提取率增大幅度較少，且在料液比1∶40時(shí)提取率達(dá)最大值7.55%，之后提取率逐漸下降；這可能是當(dāng)總黃酮溶出已基本飽和后，再增大提取劑用量會(huì)使其他雜質(zhì)的溶出增多，影響總黃酮的提取率。因此，選擇料液比為1∶40左右。

2.1.4 提取時(shí)間對(duì)提取率的影響

圖4 提取時(shí)間對(duì)提取率的影響

由圖4可知，隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)，丁香總黃酮的提取率呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，在提取時(shí)間為75 min時(shí)丁香總黃酮提取率最高，為7.43%，提取時(shí)間超過(guò)75 min，丁香總黃酮提取率逐漸下降。這說(shuō)明適當(dāng)延長(zhǎng)提取時(shí)間，有利于丁香總黃酮活性成分在溶劑中的充分?jǐn)U散和溶出，而提取時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，會(huì)使溶液中已溶出的總黃酮物質(zhì)分解，從而導(dǎo)致丁香總黃酮提取率的下降。因此，選用提取時(shí)間75 min左右。

2.2 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果及分析

表2 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

由表2可知,A(乙醇濃度)對(duì)丁香總黃酮的提取率影響最大，其次是B(提取溫度)，D(提取時(shí)間)對(duì)丁香總黃酮提取率影響最小，優(yōu)化得到的最佳提取工藝條件為A2B3C2D3，即：乙醇濃度70%，提取溫度80 ℃，料液比1∶40，提取時(shí)間90 min。

表3 方差分析表

由表3可知，4個(gè)因素中A(乙醇濃度)對(duì)丁香總黃酮的提取率具有顯著性影響，其他3個(gè)因素均無(wú)顯著性影響。

2.3 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

因利用L9(34)正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化得到的丁香總黃酮最佳提取工藝條件與表2中的9組實(shí)驗(yàn)不重復(fù)，故通過(guò)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)考察該工藝條件的穩(wěn)定性，在最佳工藝條件下(乙醇濃度70%，提取溫度80 ℃，料液比1∶40，提取時(shí)間90 min)提取丁香總黃酮，并測(cè)定總黃酮提取率，制備3份平行試樣，得到丁香總黃酮平均提取率為(8.51±0.03)%，高于正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)中的9組總黃酮提取率數(shù)值，表明該工藝條件比較穩(wěn)定，可以作為丁香總黃酮的超聲波輔助提取的最佳工藝條件。

3 結(jié)論

本研究通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)和正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)對(duì)丁香總黃酮的超聲波輔助提取工藝進(jìn)行優(yōu)化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：乙醇濃度對(duì)丁香總黃酮的提取達(dá)到顯著性水平，優(yōu)化得到的最佳工藝條件為：乙醇濃度70%，提取溫度80 ℃，料液比1∶40，提取時(shí)間90 min；驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：在優(yōu)化得到的最佳工藝條件下，丁香總黃酮提取率為(8.51±0.03)%，高于正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)表中的數(shù)值，表明該工藝條件穩(wěn)定，可以作為丁香總黃酮的超聲波輔助提取工藝條件，為丁香總黃酮的工業(yè)化生產(chǎn)提供一定的數(shù)據(jù)參考，為丁香資源的進(jìn)一步開發(fā)利用提供了理論依據(jù)。

參考文獻(xiàn)：

[1]國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典:一部[M].北京:中國(guó)醫(yī)藥科技出版社,2010:4.

[2]張衛(wèi)明,肖正春.中國(guó)辛香料植物資源開發(fā)利用[M].南京:東南大學(xué)出版社,2007:640.

[3]江慎華,王書源,馬海樂(lè),等.丁香活性物質(zhì)提取工藝優(yōu)化與抗氧化活性研究[J].農(nóng)業(yè)機(jī)械學(xué)報(bào),2010,41(1):132-138.

[4]蔡君龍,盧金清,黎強(qiáng),等.不同產(chǎn)地丁香揮發(fā)性成分分析[J].植物科學(xué)學(xué)報(bào),2015,33(2):251-258.

[5]張小飛,萬(wàn)娜,王學(xué)成,等.丁香揮發(fā)油理化性質(zhì)、 提取工藝參數(shù)與其芳香水穩(wěn)定性的相關(guān)性研究[J].中草藥,2016,47(22):3975-3980.

[6]延璽,劉會(huì)青,鄒永青,等.黃酮類化合物生理活性及合成研究進(jìn)展[J].有機(jī)化學(xué),2008,28(9):1534-1544.

[7]曹志超,顧翔,蘇佩清.黃酮類化合物抗氧化及其作用機(jī)制的研究進(jìn)展[J].實(shí)用臨床醫(yī)藥雜志,2009,13(7):110-112.

[8]Cushine T P,Lamb A J.Recent advances in understanding the antibacterial properties of flavonoids[J].Int J Antimicrob Agents, 2011,38(9):99-107.

[9]李利華.大蒜總黃酮的超聲波輔助浸提及其抗氧化活性[J].食品與發(fā)酵工業(yè),2013,39(12):213-216.

[10]何為,薛衛(wèi)東.優(yōu)化實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì):方法及數(shù)據(jù)分析[M].北京:化學(xué)工業(yè)出版社，2014:6-12.