張曉翠， 侯兆玉， 張紅利， 鄧 芳

(安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院兒科， 安徽 合肥 230022)

血管緊張素II(angiotensin II，Ang II)作為腎素-血管緊張素系統(tǒng)(renin-angiotensin system，RAS)的主要效應(yīng)分子，在腎臟病理及生理功能調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用[1]，其與Ang II 1型受體(Ang II type 1 receptor，AT1R)結(jié)合，可激活核因子-κB(nuclear factor-κB，NF-κB)等多條細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路而發(fā)揮致炎作用，刺激細(xì)胞生成活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)[2]。腎小球血管內(nèi)皮細(xì)胞(glomerular endothelial cells，GECs)與基底膜和足細(xì)胞共同組成腎小球?yàn)V過屏障，是腎臟發(fā)揮生理作用的基礎(chǔ)，亦是炎癥反應(yīng)的靶細(xì)胞[3]。內(nèi)皮細(xì)胞損傷是血管病變的始動(dòng)環(huán)節(jié)，GECs可表達(dá)多種血管活性物質(zhì)如內(nèi)皮素-1(endothelin-1， ET-1)、一氧化氮(nitric oxide，NO)和所有RAS組分，而受損激活后可分泌多種炎癥因子如白細(xì)胞介素-6(interleukin-6，IL-6)和腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)等。Ang II對(duì)GECs的損傷機(jī)制一直是研究者的關(guān)注重點(diǎn)。血管緊張素1-7(angiotensin 1-7, Ang1-7)是由Ang I和Ang II 轉(zhuǎn)化生成的七肽活性物質(zhì)，在調(diào)節(jié)腎臟功能上與Ang II相互拮抗[4]，已有研究證實(shí)Ang1-7可通過Mas受體拮抗Ang II誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)單核細(xì)胞趨化蛋白-1(monocyte chemoattractant protein-1，MCP-1)和細(xì)胞間黏附分子-1(intercellular adhesion molecule-1，ICAM-1)，改善Ang II所致人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞凋亡、氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)[5-6]。而人腎小球內(nèi)皮細(xì)胞(human glomerular endothelial cells，HGECs)與人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)不同[7]，Ang1-7是否能夠通過Mas受體減輕Ang II所致?lián)p傷作用尚未確定，為此，本研究通過體外培養(yǎng)HGECs, 探討Ang1-7對(duì)Ang II所致HGECs損傷的作用及其可能機(jī)制，從而為臨床腎臟疾病的防治提供新的理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

材 料 和 方 法

1 細(xì)胞與主要試劑

HGECs(廣州吉尼歐)。Ang II、Ang1-7和Mas受體抑制劑A779(TOCRIS)；DMEM低糖培養(yǎng)基(HyClone)；胎牛血清(BI)；0.25%胰蛋白酶(Gibco)；CCK-8試劑(上海貝博)；IL-6和TNF-α ELISA試劑盒(R&D)；ET-1、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(transforming growth factor-β， TGF-β) ELISA試劑盒(Abcam)；乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)和NO檢測(cè)試劑盒(南京建成)；MCP-1和ICAM-1 ELISA試劑盒(深圳達(dá)科為)；Annexin V-FITC凋亡檢測(cè)試劑盒(BD)；ROS檢測(cè)試劑盒(碧云天)。

2 方法

2.1HGECs的體外培養(yǎng) 細(xì)胞培養(yǎng)在含15% FBS的DMEM培養(yǎng)液中，置于飽和濕度、5% CO2、37 ℃的溫箱中常規(guī)培養(yǎng)和傳代。待細(xì)胞融合達(dá)80%后，用0.25% 胰蛋白酶-EDTA適度消化、加完全培養(yǎng)基終止消化,用滅菌槍頭均勻輕柔吹落瓶壁細(xì)胞形成細(xì)胞懸液,1 000 r/min離心3 min，棄上清，按1∶3傳代。選擇生長(zhǎng)良好的第3～5代對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)，所有細(xì)胞均于實(shí)驗(yàn)前均換用無血清的DMEM培養(yǎng)液靜止培養(yǎng)12 h。

2.2實(shí)驗(yàn)分組 實(shí)驗(yàn)主要分為6組：對(duì)照(control)組：不加干預(yù)因素；Ang II組：加入1 μmol/L Ang II培養(yǎng)； Ang II+ Ang1-7組：先用終濃度0.1 μmol/L的Ang1-7預(yù)處理30 min后，再加入終濃度為1 μmol/L Ang II共培養(yǎng)；Ang II+ Ang1-7+A779組：先用終濃度為10 μmol/L的A779預(yù)處理15 min后，再加入終濃度為0.1 μmol/L的Ang1-7，30 min后再加入終濃度為1 μmol/L的Ang II；Ang1-7組：加入0.1 μmol/L的Ang1-7處理；A779組：加入10 μmol/L的A779處理，所有組別均于最后一次給藥后連續(xù)培養(yǎng)24 h[6]。

2.3CCK-8實(shí)驗(yàn)測(cè)定細(xì)胞活力并篩選藥物濃度與時(shí)間 調(diào)整HGECs密度為2×107/L，每孔100 μL接種于96孔板中，待細(xì)胞生長(zhǎng)約70%左右加入Ang II使其終濃度分別為10、1、0.1、0.01和0.001 μmol/L(每組6個(gè)復(fù)孔),作用時(shí)間分別為12 h、24 h和36 h，然后每孔中加入10 μL的CCK-8溶液，37 ℃避光孵育1 h，使用酶標(biāo)儀檢測(cè)各孔吸光度(A) 值，波長(zhǎng)設(shè)定為450 nm，按公式計(jì)算細(xì)胞活力：細(xì)胞活力(%)=(加藥孔A值-空白孔A值)/(對(duì)照孔A值-空白孔A值)×100%，篩選藥物作用合適濃度與時(shí)間。在此基礎(chǔ)上依次加入Ang1-7(10、1、0.1和0.01 μmol/L)、A779(100、10和0.1 μmol/L)篩選合適濃度，實(shí)驗(yàn)重復(fù)4次。

2.4流式細(xì)胞術(shù)Annexin V/PI雙標(biāo)法檢測(cè)HGECs凋亡 將HGECs接種于12孔培養(yǎng)板中，當(dāng)細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)至80%時(shí)，給予各實(shí)驗(yàn)組不同的處理因素作用24 h后，用胰酶(不含EDTA)常規(guī)消化收集各組細(xì)胞，1 000 r/min離心5 min，輕棄上清液，加入預(yù)冷的PBS洗2次，再次離心后棄去上清液，動(dòng)作輕柔，加入1×Buffer 200 μL調(diào)整密度為1×109/L細(xì)胞懸液，分別加入5 μL Annexin V-FITC和PI混勻后室溫避光孵育15 min，上流式細(xì)胞儀檢測(cè)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)5次。

2.5細(xì)胞內(nèi)ROS含量的檢測(cè) 將HGECs接種于12孔培養(yǎng)板中，當(dāng)細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)至80%時(shí)，給予各實(shí)驗(yàn)組不同的處理因素作用24 h后，設(shè)置陽(yáng)性對(duì)照組，陰性對(duì)照組及干預(yù)組，各組無血清培養(yǎng)基洗3次，避光下各實(shí)驗(yàn)孔原位裝載1 μL的DCFH-DA探針，37 ℃孵育30 min后，棄去培養(yǎng)液，無血清培養(yǎng)基充分洗3次，于熒光顯微鏡(488/525 nm)拍攝各組ROS變化。常規(guī)消化收集各組細(xì)胞，1 000 r/min離心5 min，輕棄去部分上清液，按上述方法標(biāo)記細(xì)胞，上流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)ROS的變化，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2.6HGECs培養(yǎng)液中各炎癥指標(biāo)的檢測(cè) 各組細(xì)胞培養(yǎng)24 h后收集上清液，按照ELISA試劑盒說明書操作，測(cè)定HGECs上清液中IL-6、TNF-α、TGF-β、MCP-1、ICAM-1和ET-1的含量，其中TGF-β需加入1 mol/L HCl和1.2 mol/L NaOH/0.5 mol/L HEPES混合液對(duì)樣本進(jìn)行激活釋放TGF-β；利用微板法，按照LDH試劑盒說明書測(cè)定LDH的含量；應(yīng)用硝酸還原酶法用酶標(biāo)儀于550 nm處比色，按照NO試劑盒說明書操作，測(cè)定上清液中NO2-/NO3-含量，以間接反映其NO 水平。其中IL-6、TNF-α、TGF-β、MCP-1和ICAM-1實(shí)驗(yàn)重復(fù)6次，ET-1、NO和LDH實(shí)驗(yàn)重復(fù)4次。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD) 表示，組間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，采用SNK-q檢驗(yàn)進(jìn)行均數(shù)之間的兩兩比較，以P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞活力并篩選藥物的作用最適濃度與時(shí)間

利用CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞活力，結(jié)果顯示選取1 μmol/L的Ang II作用HGECs 24 h作為最佳濃度及時(shí)間，見圖1。而Ang1-7及A779即在Ang II基礎(chǔ)上測(cè)定各濃度梯度細(xì)胞活力變化，以出現(xiàn)顯著差異濃度組為最佳，因而篩選Ang1-7為0.1 μmol/L，A779為10 μmol/L。

Figure 1. Concentration-time curve of HGECs viability induced by Ang II. Mean±SD.n=4.

圖1AngII在不同濃度和作用時(shí)間下細(xì)胞活力的變化

2 Ang 1-7與A779對(duì)Ang II所致HGECs凋亡的影響

流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果示,對(duì)照組HGECs的凋亡率較低；Ang II(1 μmol/L)處理HGECs 24 h后的細(xì)胞凋亡率與對(duì)照組相比明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；0.1 μmol/L Ang1-7的加入可減少Ang II誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡率(P<0.05)；而與Ang II+ Ang1-7組比較，10 μmol/L A779加入后增加了細(xì)胞凋亡率(P<0.05)；單獨(dú)Ang1-7和A779組細(xì)胞凋亡率與對(duì)照組對(duì)比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性，見圖2。

Figure 2. The effects of Ang1-7 and A779 on the apoptosis of HGECs induced by Ang II. Mean±SD.n=5.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsAng II group;△P<0.05vsAng II+Ang1-7 group.

圖2Ang1-7與A779對(duì)AngII所致人腎小球內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的影響

3 Ang 1-7與A779對(duì)Ang II所致HGECs氧化應(yīng)激的影響

Ang II(1 μmol/L)作用HGECs 24 h，胞內(nèi)ROS平均熒光強(qiáng)度增強(qiáng)，與對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；而加入0.1 μmol/L Ang1-7可使胞內(nèi)ROS的生成減少，與Ang II組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與Ang II+ Ang1-7組比較，加入10 μmol/L A779 增加了胞內(nèi)ROS的生成(P<0.05)； 單獨(dú)Ang1-7和A779組與對(duì)照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性，見圖3。

Figure 3. The effects of Ang 1-7 and A779 on the production of ROS in HGECs induced by Ang II (×200). MFI: mean fluorescence intensity. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsAng II group;△P<0.05vsAng II+Ang1-7 group.

圖3Ang1-7與A779對(duì)AngII所致人腎小球內(nèi)皮細(xì)胞ROS生成的影響

4 Ang 1-7與A779對(duì)Ang II誘導(dǎo)的HGECs培養(yǎng)上清中LDH、NO和ET-1含量的影響

與對(duì)照組相比，Ang II (1 μmol/L)組中HGECs LDH漏出明顯增加、ET-1分泌明顯增多，而NO的釋放減少(P<0.05)；與Ang II組相比，Ang1-7可呈劑量依賴性(0.01～10 μmol/L)地抑制Ang II所致的HGECs的LDH漏出和ET-1分泌，并促進(jìn)NO的釋放(P<0.05)；與Ang II+Ang1-7組比較，加入A779可使Ang1-7的抑制作用減弱，LDH的漏出和ET-1的分泌增加，NO釋放減少(P<0.05)；單用Ang1-7(0.1 μmol/L)和A779(10 μmol/L)時(shí)LDH、ET-1和NO的含量與對(duì)照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性，結(jié)果見表1。

5 Ang1-7與A779對(duì)Ang II誘導(dǎo)的HGECs培養(yǎng)上清中 IL-6、TNF-α、TGF-β、MCP-1和ICAM-1含量的影響

與對(duì)照組相比，IL-6、TNF-α、TGF-β、MCP-1和ICAM-1在Ang II組分泌增多(P<0.05)；而與Ang II組比較，Ang II+Ang1-7組的IL-6、TNF-α、TGF-β、MCP-1和ICAM-1的含量明顯減少(P<0.05)；與Ang II+Ang1-7組比較，加入A779可使IL-6、TNF-α、TGF-β、MCP-1和ICAM-1含量增加(P<0.05)；單用Ang1-7和A779時(shí)的上述各指標(biāo)與對(duì)照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性，見圖4。

討 論

本研究旨在探討Ang1-7在Ang II誘導(dǎo)的HGECs損傷及氧化應(yīng)激中的作用及可能機(jī)制，目前研究結(jié)果表明：(1)Ang II可使HGECs凋亡率增加、ROS生成增多、炎癥因子表達(dá)增多；(2)Ang1-7通過抑制Mas受體可降低Ang II所致的HGECs凋亡率、減少ROS生成和炎癥因子表達(dá)；(3)Ang1-7呈濃度依賴性抑制Ang II所致HGECs的損傷作用，其保護(hù)作用可被Ang1-7拮抗劑A779幾乎完全阻斷；(4)單獨(dú)應(yīng)用Ang1-7和A779 對(duì)HGECs的上述指標(biāo)無影響。

表1 細(xì)胞培養(yǎng)上清中LDH、NO和ET-1含量的變化

*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsAng II group;△P<0.05vsAng II+Ang1-7 (0.1 μmol/L) group.

Figure 4. The effects of Ang 1-7 and A779 on the concentrations of inflammatory mediators in HGECs induced by Ang II. Mean±SD.n=6.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsAng II group;△P<0.05vsAng II+Ang1-7 group.

圖4Ang1-7與A779對(duì)AngII誘導(dǎo)人腎小球內(nèi)皮細(xì)胞炎癥介質(zhì)含量的影響

LDH和ET-1釋放水平增高，NO含量降低是內(nèi)皮細(xì)胞損傷及過度活化的標(biāo)志。IL-6 升高可上調(diào)內(nèi)皮細(xì)胞表面ICAM-l的表達(dá)，促使中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞及淋巴細(xì)胞黏附于血管內(nèi)皮，造成血管內(nèi)皮細(xì)胞的損傷。MCP-1是一種單核細(xì)胞趨化蛋白，主要由內(nèi)皮細(xì)胞、單核細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞表達(dá)，促進(jìn)單核細(xì)胞攝取脂質(zhì)，演變成泡沫細(xì)胞。ICAM-1是一類介導(dǎo)細(xì)胞間或細(xì)胞與基質(zhì)黏附的分子，主要促進(jìn)單核細(xì)胞與內(nèi)皮黏附、遷移和聚集等，是細(xì)胞激活后引起內(nèi)皮細(xì)胞損傷的關(guān)鍵。

Ang II 作為炎癥介質(zhì)，也可激活多種炎癥因子損傷GECs。Izawaishizawa 等[8]發(fā)現(xiàn)Ang II可上調(diào)TNF-α的活化劑ICAM-1在HGECs中的表達(dá)，引起炎癥反應(yīng)、造成ROS大量堆積，損傷HGECs，使用AT1R阻斷劑可明顯減少TNF-α 造成的細(xì)胞毒性。梁斌等[4]研究發(fā)現(xiàn)Ang II在GECs內(nèi)激活RAS系統(tǒng)、活化還原性煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶系統(tǒng)，產(chǎn)生大量的ROS和ET-1。Pan等[9]在小鼠腎小球內(nèi)皮細(xì)胞的研究中發(fā)現(xiàn)，Ang II在一定范圍內(nèi)呈劑量依賴促進(jìn)GECs的MCP-1表達(dá)，通過NADPH氧化酶依賴的ROS生成激活NF-κB通路。潘茜等[10]的實(shí)驗(yàn)證實(shí)1 μmol/L的Ang II能激活p38絲裂原活化的蛋白激酶信號(hào)通路，上調(diào)某些促凋亡因子的表達(dá)促進(jìn)GECs凋亡。Ang II增加TGF-β/Smad2/3、NF-κB信號(hào)通路的活化，促進(jìn)促炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生、細(xì)胞增殖和細(xì)胞外基質(zhì)過度沉積，促進(jìn)腎小球損傷[11]。因此，Ang II可通過激活炎癥反應(yīng)、誘發(fā)氧化應(yīng)激、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、損傷腎小球血管內(nèi)皮結(jié)構(gòu)和內(nèi)分泌功能等途徑損傷GECs。

Ang1-7可作為保護(hù)性短肽抑制Ang II誘導(dǎo)的MAPK信號(hào)通路活化[12]，還可減少膠原蛋白Ⅳ、TGF-β1和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子等的表達(dá)[13]；Ang1-7通過刺激內(nèi)皮型一氧化氮合酶磷酸化，抑制磷酸肌醇激酶即PI3K/Akt/eNOS途徑，增加前列環(huán)素及NO釋放[14]，減少炎癥因子TNF-α等,矯正NF-κB早期轉(zhuǎn)錄翻譯水平。

綜上所述，Ang1-7通過Mas受體可抑制Ang II所誘導(dǎo)的HGECs的損傷、凋亡和氧化應(yīng)激。

[參 考 文 獻(xiàn)]

[1] Urushihara M, Kagami S. Role of the intrarenal renin-angiotensin system in the progression of renal disease[J]. Pediatr Nephrol, 2017,32(9):1471-1479.

[2] Fu J, Lee K, Chuang PY, et al. Glomerular endothelial cell injury and cross talk in diabetic kidney disease[J]. Am J Physiol Renal Physiol, 2015, 308(4):F287-F297.

[3] Shoji K. Involvement of glomerular renin angiotensin system (RAS) activation in the development and progression of glomerular injury[J]. Clin Exp Nephrol, 2012, 16(2):214-220.

[4] 梁 斌， 楊志明， 張娜娜， 等. 血管緊張素(1-7)對(duì)血管緊張素II誘導(dǎo)的臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞MCP-1和ICAM-1表達(dá)的影響[J]. 中國(guó)病理生理雜志, 2009, 25(7):1319-1324.

[5] Yang HY, Bian YF, Zhang HP, et al. Angiotensin-(1-7) treatment ameliorates angiotensin II-induced apoptosis of human umbilical vein endothelial cells[J]. Clin Exp Pharmacol Physiol, 2012, 39(12):1004-1010.

[6] Murugan D, Lau YS, Chi WL, et al. Correction: angiotensin 1-7 protects against angiotensin II-induced endoplasmic reticulum stress and endothelial dysfunction via mas receptor[J]. PLoS One, 2015, 10(12):e0145413.

[7] Mcginn S, Poronnik P, Gallery ED, et al. A method for the isolation of glomerular and tubulointerstitial endothelial cells and a comparison of characteristics with the human umbilical vein endothelial cell model[J]. Nephrology, 2004, 9(4):229-237.

[8] Izawaishizawa Y, Ishizawa K, Sakurada T, et al. Angiotensin II receptor blocker improves tumor necrosis factor-α-induced cytotoxicity via antioxidative effect in human glomerular endothelial cells[J]. Pharmacology, 2012, 90(5-6):324-331.

[9] Pan Q, Yang XH, Cheng YX. Angiotensin II stimulates MCP-1 production in rat glomerular endothelial cells via NAD(P)H oxidase-dependent nuclear factor-kappa B signaling.[J]. Braz J Med Biol Res, 2009, 42(6):531-536.

[10] 潘 茜. 血管緊張素II對(duì)大鼠腎小球內(nèi)皮細(xì)胞炎性因子MCP-1表達(dá)和增殖、凋亡的影響及其AT_1受體拮抗劑替米沙坦作用的研究[D]. 沈陽(yáng)：中國(guó)醫(yī)科大學(xué), 2009.

[11] Meng XM, Tang PM, Li J, et al. TGF-β/Smad signaling in renal fibrosis[J]. 2015, 6:82.

[12] Gallagher PE, Ferrario CM, Tallant EA. MAP kinase/phosphatase pathway mediates the regulation of ACE2 by angiotensin peptides[J]. Am J Physiol Cell Physiol, 2008, 295(5):C1169-C1174.

[13] Zhang K, Meng X, Li D, et al. Angiotensin (1-7) attenuates the progression of streptozotocin-induced diabetic renal injury better than angiotensin receptor blockade[J]. Kidney Int, 2015,87(2):359-369.

[14] 陳健芳， 陳景福， 陳 巍， 等. 血管緊張素(1-7)通過抑制JAK/STAT信號(hào)通路對(duì)抗高糖誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞損傷[J]. 中國(guó)病理生理雜志, 2017, 33(3):481-488.