林 娜， 柳 洋， 祁 暉， 周鳳玲， 朱凡河

(1濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院， 山東 濟(jì)寧 272067； 2青島市第九人民醫(yī)院， 山東 青島 266000； 3濟(jì)寧市第一人民醫(yī)院心電圖室， 山東 濟(jì)寧 272002)

抑郁癥是一種非常嚴(yán)重的精神疾病，其高發(fā)性已經(jīng)使其成為危害公共健康的主要精神疾病[1]。目前常用的抗抑郁藥由于神經(jīng)適應(yīng)并未達(dá)到預(yù)期治療效果，如三環(huán)類抗抑郁藥只能對60%～70%的抑郁癥患者產(chǎn)生療效，因此研發(fā)有效抗抑郁癥藥物及探究其機(jī)制已經(jīng)成為目前精神疾病研究的重點[2]。

大量研究表明谷氨酸參與抑郁癥的病理生理過程[3]。對自殺的抑郁癥患者解剖發(fā)現(xiàn)，死者額葉皮層谷氨酸水平較高[4]，并且海馬內(nèi)N-甲基-D-天冬氨酸(N-methyl-D-aspartate，NMDA)受體亞型1活性改變[5]。有研究表明，NMDA受體拮抗劑氯胺酮具有治療抑郁癥的潛在作用[6]。臨床研究發(fā)現(xiàn)，抑制NMDA受體活性的藥物能夠抗抑郁[7]，長期應(yīng)用藥物治療抑郁癥能夠引起NMDA受體活性改變[6]。

與氯胺酮相類似的是鎮(zhèn)咳劑右美沙芬(dextromethorphan，DXM)，也能夠抑制NMDA受體活性[8]。目前抗抑郁效果最好的藥物是氯胺酮，但是由于氯胺酮有致幻性等嚴(yán)重副作用，并且極易分解，只能靜脈輸注，所以使用較為受限[6]。由于DXM能夠與NMDA受體信號相互作用[9]，并且通過5-羥色胺轉(zhuǎn)運體和sigma-1受體等產(chǎn)生作用[8]，所以DXM具有比氯胺酮更強(qiáng)的抗抑郁作用[9]。且與氯胺酮相比，已經(jīng)上市幾十年的止咳藥DXM更為安全且方便。有研究表明，DXM具有抗抑郁作用，能夠促進(jìn)強(qiáng)迫游泳實驗(forced swimming test，F(xiàn)ST)中小鼠的活動[10]，而FST是評價抗抑郁藥物的經(jīng)典方法[11]。

NMDA受體能夠激活一氧化氮合酶(nitric oxide synthase，NOS)從而促進(jìn)L-精氨酸(L-arginine, L-ARG)轉(zhuǎn)化為一氧化氮(nitric oxide，NO)[12]。NO廣泛參與如癲癇、神經(jīng)可塑性、瘙癢、疼痛和抑郁等多種生理和病理過程[13]。研究表明NOS抑制劑能夠抗抑郁[13]。NO能夠調(diào)節(jié)可溶性鳥苷酸環(huán)化酶(soluble guanylate cyclase，sGC)活性，鳥苷酸環(huán)化酶是一種能夠催化三磷酸鳥苷(guanosine triphosphate，GTP)轉(zhuǎn)化為環(huán)磷酸鳥苷(cyclic guanosine monophosphate，cGMP)的酶。cGMP是中樞和外周循環(huán)中重要的第二信使，具有多種功能[14]。動物實驗發(fā)現(xiàn)抑制NOS和sGC等蛋白的轉(zhuǎn)化能夠產(chǎn)生抗抑郁的作用[15]。盡管已經(jīng)有研究表明DXM能夠促進(jìn)FST中小鼠的活動，但是尚不明確其作用機(jī)制[16]。

本研究擬采用不同行為實驗探究DXM抗抑郁的機(jī)制，為抑郁癥治療提供新的研究方向。

材 料 和 方 法

1 實驗動物與藥物

成年雄性昆明小鼠,動物許可證編號為SCXK(魯)2008-0002,飼養(yǎng)于室溫(25±2) ℃，12 h循環(huán)光照，自由飲食的環(huán)境。右美沙芬、抗抑郁藥氟西汀(fluoxetine, FLU)、NMDA受體拮抗劑MK-801(MK)、NMDA受體激動劑NMDA、NO前體L-ARG、內(nèi)皮型NOS(endothelial NOS,eNOS)抑制劑Nω-硝基-L-精氨酸甲酯(Nω-nitro-L-arginine methyl ester, L-NAME)、誘導(dǎo)型NOS(inducible NOS,iNOS)抑制劑氨基胍(aminoguanidine, AG)和磷酸二酯酶5(phosphodiesterase 5, PDE5)抑制劑西地那非(sildenafil)均溶于生理鹽水(normal saline, NS)，神經(jīng)元型NOS(neuronal NOS,nNOS)抑制劑7-硝基吲唑(7-nitroindole, 7-NI)溶于Tween-80。

2 實驗分組及方法

2.1抑郁小鼠模型構(gòu)建 每天8:00～12:00和18:00～20:00對小鼠進(jìn)行束縛加噪聲刺激(25 Hz)，小鼠束縛裝置為50 mL離心管，頭尾分別留有直徑約5 mm的圓孔，一端供小鼠呼吸，另一端便于小鼠尾巴活動，連續(xù)刺激5 d，構(gòu)建抑郁小鼠模型[17]。

2.2DXM對抑郁小鼠行為的影響 隨機(jī)選取50只抑郁小鼠，分為5組,每組10只，在實驗開始前分別向小鼠腹腔注射DXM (3、10和30 mg/kg)[10]、NS以及氟西汀(20 mg/kg)。給藥30 min后進(jìn)行動物強(qiáng)迫游泳實驗[18]、懸尾實驗(tail suspension test,TST)[16]、以及曠場實驗(open field test,OFT)[18]。實驗結(jié)束后小鼠斷頭取腦，以ELISA法分別測定總NOS、iNOS、eNOS以及nNOS的含量。

2.3DXM對抑郁小鼠腦NMDA受體活性的影響 隨機(jī)選取40抑郁只小鼠，分為4組，每組10只，分別向小鼠腹腔注射DXM (3、10和30 mg/kg)[10]和NS，注射后30 min處死小鼠取腦，放射標(biāo)記受體測定法測定NMDA受體活性，以[3H]標(biāo)記的MK801為標(biāo)記配體。小鼠取腦加入50 mmol/L的TAB后高速分散器離心3次，制成含NMDA受體的突觸粗膜懸液，用緩沖液稀釋后調(diào)整蛋白濃度為(1～2)×106μg/L。取100 μL突觸膜稀釋液加入200 μL 50 mmol/L的TAB緩沖液。在非特異性結(jié)合管中加入100 μL 30 μmol/L的MK801和100 μL 50 mmol/L的TAB，每管加入10 μL[3H]-MK801。每個樣品作平行雙管。然后在30 ℃環(huán)境下孵育30 min。反應(yīng)結(jié)束后，用4 ℃、50 mmol/L的TAB緩沖液5 mL，負(fù)壓抽濾于纖維素濾膜，并用預(yù)冷的50 mmol/L的TAB緩沖液20 mL分3次洗滌。將濾膜轉(zhuǎn)入計數(shù)杯，加入甲苯-Triton X-100閃爍液，于閃爍液計數(shù)儀上測定濾膜上的每分鐘閃爍計數(shù)(min-1)。結(jié)合突觸膜蛋白質(zhì)濃度，計算[3H]-MK801的結(jié)合量(以每毫克蛋白質(zhì)結(jié)合的[3H]-MK801的克分子數(shù)表示)。采用考馬斯亮藍(lán)法測定突觸膜中的蛋白質(zhì)濃度。計算公式為：特異性結(jié)合量[fmol/(mg protein)]=(樣品總結(jié)合閃爍計數(shù)-非特異性結(jié)合閃爍計數(shù))/總閃爍計數(shù)×每管配基的fmol數(shù)/樣品蛋白的mg數(shù)。

2.4NMDA受體拮抗劑促進(jìn)DXM抗抑郁效應(yīng) 隨機(jī)選取40只抑郁小鼠，分為4組，每組10只: (1)NS組：腹腔注射生理鹽水15 min后再注射生理鹽水；(2)DXM組：腹腔注射生理鹽水15 min后再注射DXM (3 mg/kg)；(3)MK組：腹腔注射MK (0.05 mg/kg)[18]15 min后再注射生理鹽水；(4)MK/DXM組：腹腔注射MK (0.05 mg/kg)[18]15 min后再注射DXM (3 mg/kg)。給藥30 min后進(jìn)行動物強(qiáng)迫游泳實驗[18]、懸尾實驗[16]及曠場實驗[18]。

2.5NMDA受體激動劑抑制DXM抗抑郁效應(yīng) 隨機(jī)選取40只小鼠，分為4組，每組10只：(1)NS組：腹腔注射生理鹽水15 min后再注射生理鹽水；(2)DXM組：腹腔注射生理鹽水15 min后再注射DXM (30 mg/kg)；(3)NMDA組：腹腔注射NMDA (75 mg/kg)[16]15 min后再注射生理鹽水；(4)NMDA/DXM組：腹腔注射NMDA (75 mg/kg)[16]15 min后再注射DXM (30 mg/kg)。給藥30 min后進(jìn)行動物強(qiáng)迫游泳實驗[18]、懸尾實驗[16]及曠場實驗[18]。

2.6NO前體L-精氨酸抑制DXM抗抑郁效應(yīng) 隨機(jī)選取40只抑郁小鼠，分為4組，每組10只：(1)NS組：腹腔注射生理鹽水15 min后再注射生理鹽水；(2)DXM組：腹腔注射生理鹽水15 min后再注射DXM (30 mg/kg)；(3)L-ARG組：腹腔注射L-ARG (750 mg/kg)[19]15 min后再注射生理鹽水；(4)L-ARG/DXM組：腹腔注射L-ARG (750 mg/kg)[19]15 min后再注射DXM (30 mg/kg)。給藥30 min后進(jìn)行動物強(qiáng)迫游泳實驗[18]、懸尾實驗[16]及曠場實驗[18]。

2.7NOS抑制劑促進(jìn)DXM抗抑郁效應(yīng) 隨機(jī)選取100只抑郁小鼠，分為10組，每組10只:(1)NS組：腹腔注射生理鹽水15 min后再注射生理鹽水；(2)NS/DXM組腹腔注射生理鹽水15 min后再注射DXM (3 mg/kg)；(3)L-NAME組：腹腔注射L-NAME (10 mg/kg)[19]15 min后再注射生理鹽水；(4)L-NAME/DXM組：腹腔注射L-NAME (10 mg/kg)[19]15 min后再注射DXM (3 mg/kg)；(5)Tween-80組：腹腔注射Tween-80 15 min后再注射生理鹽水；(6)Tween-80/DXM組：腹腔注射Tween-80 15 min后再注射DXM (3 mg/kg)；(7)7-NI組：腹腔注射7-NI (30 mg/kg) 15 min后再注射生理鹽水；(8)7-NI/DXM組：腹腔注射7-NI (30 mg/kg)[19]15 min后再注射DXM (3 mg/kg)；(9)AG組：腹腔注射AG (50 mg/kg)[15]15 min后再注射生理鹽水；(10)AG/DXM組：腹腔注射AG (50 mg/kg)[15]15 min后再注射DXM (3 mg/kg)。給藥30 min后進(jìn)行動物強(qiáng)迫游泳實驗[18]、懸尾實驗[16]及曠場實驗[18]。

2.8cGMP抑制DXM抗抑郁效應(yīng) 隨機(jī)選取40只抑郁小鼠，分為4組，每組10只:(1)NS組：腹腔注射生理鹽水15 min后再注射生理鹽水；(2)DXM組：腹腔注射生理鹽水15 min后再注射DXM (30 mg/kg)；(3)sildenafil組：腹腔注射西地那非(5 mg/kg)[20]15 min后再注射生理鹽水；(4)sildenafil/DXM組：腹腔注射西地那非(5 mg/kg)[20]15 min后再注射DXM (30 mg/kg)。給藥30 min后進(jìn)行動物強(qiáng)迫游泳實驗[18]、懸尾實驗[16]及曠場實驗[18]。

3 統(tǒng)計學(xué)處理

數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析使用Prism 5.0軟件。實驗中數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤(mean±SEM)表示，組間比較使用單因素方差分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 DXM對抑郁小鼠行為的影響

與生理鹽水組相比，DXM(10、30 mg/kg)組小鼠在FST和TST中靜止時間均減少且呈量效依賴關(guān)系(P<0.05或P<0.01)，表現(xiàn)出與氟西汀(20 mg/kg)組小鼠相似的靜止時間減少,見圖1A、B。但在OFT中，各組小鼠運動的差異無統(tǒng)計學(xué)顯著性，見圖1C。

2 DXM對抑郁小鼠腦內(nèi)NMDA受體活性的影響

與生理鹽水組相比，中、高劑量DXM組小鼠腦內(nèi)NMDA受體活性下降(P<0.05或P<0.01)，且呈量效依賴關(guān)系，低劑量DXM組小鼠NMDA受體活性雖有下降但差異無統(tǒng)計學(xué)顯著性,見圖2。

3 NMDA受體對DXM抗抑郁作用的影響

與DXM組相比，MK/DXM組小鼠在FST和TST中靜止時間明顯減少(P<0.01)，見圖3A、B。但在OFT中，小鼠運動的差異無統(tǒng)計學(xué)顯著性，見圖3C。

與生理鹽水組相比，DXM組小鼠在FST和TST中靜止時間減少(P<0.01)；與DXM組小鼠相比，NMDA/DXM組小鼠在FST和TST中靜止時間增多(P<0.05)，見圖3D、E。在OFT中，各組小鼠運動的差異無統(tǒng)計學(xué)顯著性，見圖3F。

4 DXM對抑郁小鼠腦內(nèi)NOS含量的影響

與生理鹽水組相比，中、高劑量DXM組小鼠腦內(nèi)NOS總量下降(P<0.05或P<0.01)，且呈量效依賴關(guān)系，低劑量DXM組小鼠腦內(nèi)NOS總量雖有下降但是無統(tǒng)計學(xué)意義，見圖4A；與生理鹽水組相比，

Figure 1. The effects of dextrometrophan (DXM) and fluoxetine (FLU, 20 mg/kg) on the behaviors of depressed mice. A: forced swimming test (FST); B: tail suspension test (TST); C: open field test (OFT). Mean±SEM.n=10.*P<0.05,**P<0.01vsNS group；#P<0.05vs10 mg/kg DXM group.

圖1DXM對抑郁小鼠行為的影響

Figure 2. The effect of DXM on NMDA receptor activity in the brain of depressed mice. Mean±SEM.n=10.*P<0.05,**P<0.01vsNS group.

圖2DXM對抑郁小鼠腦內(nèi)NMDA受體活性的影響

中、高劑量DXM組小鼠腦內(nèi)eNOS總量下降(P<0.05或P<0.01)，且呈量效依賴關(guān)系，低劑量DXM組小鼠腦內(nèi)eNOS總量雖有下降但差異無統(tǒng)計學(xué)顯著性，見圖4B；與生理鹽水組相比，中、高劑量DXM組小鼠腦內(nèi)nNOS總量下降(P<0.05或P<0.01)，且呈量效依賴關(guān)系，低劑量DXM組小鼠腦nNOS總量雖有下降但差異無統(tǒng)計學(xué)顯著性,見圖4C；與生理鹽水組相比，各劑量DXM組小鼠腦內(nèi)iNOS總量下降雖有下降但是差異無統(tǒng)計學(xué)顯著性，見圖4D。

5 NO對DXM抗抑郁作用的影響

與生理鹽水組相比，DXM組小鼠在FST和TST中靜止時間減少(P<0.01);DXM組小鼠相比，L-ARG/DXM組小鼠在FST和TST中靜止時間增多(P<0.01),見圖5A、B。在OFT中，各組小鼠運動的差異無統(tǒng)計學(xué)顯著性，見圖5C。

6 NOS抑制劑對DXM抗抑郁作用的影響

與DXM組相比，L-NAME/DXM組小鼠在FST和TST中靜止時間明顯減少(P<0.01),見圖6A、B。但在OFT中，小鼠運動無明顯差異，見圖6C。

與Tween-80/DXM組相比，7-NI/DXM組小鼠在FST和TST中靜止時間明顯減少(P<0.05),見圖7A、B。但在OFT中，小鼠運動無明顯差異，見圖7C。

在FST、TST及OFT中，給予AG后各組小鼠運動無明顯差異，見圖8。

7 cGMP對DXM抗抑郁作用的影響

與生理鹽水組相比，DXM組小鼠在FST和TST中靜止時間減少(P<0.01);與DXM組相比，西地那非/DXM組小鼠在FST和TST中靜止時間增多(P<0.01),見圖9A、B。在OFT中，各組小鼠運動的差異無統(tǒng)計學(xué)顯著性，見圖9。

Figure 3. The role of NMDA receptor in the antidepressant effect of DXM. A～C: the effect of NMDA receptor antagonist MK-801 (MK); D～F: the effect of NMDA. A, D: FST; B, E: TST; C, F: OFT. Mean±SEM.n=10.**P<0.01vsDXM group；##P<0.01vsNS group.

圖3NMDA受體對DXM抗抑郁作用的影響

Figure 4. The effect of DXM on the content of NOS (A), eNOS (B), nNOS (C) and iNOS (D) in the brain of depressed mice. Mean±SEM.n=10.*P<0.05，**P<0.01vsNS group;#P<0.05vs10 mg/kg DXM group.

圖4DXM對抑郁小鼠腦內(nèi)NOS含量的影響

Figure 5. The role of NO in the antidepressant effect of DXM. A: FST; B: TST; C: OFT. Mean±SEM.n=10.##P<0.01vsNS group；**P<0.01vsDXM group.

圖5NO對DXM抗抑郁作用的影響

Figure 6. The role of L-NAME in the antidepressant effect of DXM. A: FST; B: TST; C: OFT. Mean±SEM.n=10.**P<0.01vsDXM group.

圖6L-NAME對DXM抗抑郁作用的影響

Figure 7. The role of 7-NI in the antidepressant effect of DXM. A: FST; B: TST; C: OFT. Mean±SEM.n=10.##P<0.01vsTween-80/DXM group.

圖77-NI對DXM抗抑郁作用的影響

Figure 8. The role of AG in the antidepressant effect of DXM. A: FST; B: TST; C: OFT. Mean±SEM.n=10.

圖8AG對DXM抗抑郁作用的影響

Figure 9. The role of sildenafil in the antidepressant effect of DXM. A: FST; B: TST; C: OFT. Mean±SEM.n=10.**P<0.01vsNS group；##P<0.01vsDXM group.

圖9西地那非對DXM抗抑郁作用的影響

討 論

本研究發(fā)現(xiàn)，DXM能夠減少小鼠在FST和TST中的靜止時間，表現(xiàn)出抗抑郁的作用，并且在研究中還發(fā)現(xiàn)，DXM處理過的小鼠，腦內(nèi)NMDA受體活性和NOS的表達(dá)下降。有研究表明NMDA受體及L-精氨酸-NO-cGMP通路參與抑郁癥的病理生理過程[3, 13]。DXM的抗抑郁作用可能是通過抑制NMDA受體的活性及其下游信號傳導(dǎo)產(chǎn)生的[20]。DXM主要是通過阻斷鈣離子的內(nèi)流發(fā)揮其NMDA受體拮抗劑的作用[21]，DXM的這種作用不僅僅能夠緩解抑郁還能夠保護(hù)神經(jīng)抵抗氧化應(yīng)激損傷[22]。據(jù)此我們推測DXM抗抑郁的作用是通過NMDA受體及L-精氨酸-NO-cGMP信號通路產(chǎn)生的。

本研究發(fā)現(xiàn)，NMDA受體拮抗劑MK-801能夠增強(qiáng)DXM抗抑郁的作用，而NMDA則能夠部分阻斷DXM的抗抑郁作用。有研究表明NMDA受體參與抑郁癥的病理生理過程[3]，NMDA受體拮抗劑在抗抑郁藥物作用中起關(guān)鍵作用[23]，本研究的結(jié)果與之一致。

本研究中預(yù)先注射L-精氨酸后再注射DXM，觀察DXM抗抑郁作用的改變,發(fā)現(xiàn)預(yù)先給予NO前體L-精氨酸能夠抑制DXM的抗抑郁作用。NMDA受體突觸后活化能夠增加細(xì)胞質(zhì)內(nèi)鈣離子水平，從而激活nNOS，導(dǎo)致NO水平升高[24]，有趣的是，NO可以模擬參與抑郁癥病理生理學(xué)過程的cGMP水平[16]。已上市的一些抗抑郁藥物如文拉法辛，普拉克索，加巴噴丁和巴氯芬均是通過抑制NO生成產(chǎn)生抗抑郁作用[19]。

為了驗證NOS是否參與DXM的抗抑郁作用，我們分別對抑郁小鼠腦內(nèi)NOS總量及3種類型的NOS含量進(jìn)行了測定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)給予DXM后小鼠腦內(nèi)NOS總量、eNOS含量及nNOS含量均減少，并且呈量效依賴性，但iNOS的含量無明顯改變。這一實驗結(jié)果與小鼠行為學(xué)研究結(jié)果相吻合，進(jìn)一步證明DXM的抗抑郁作用是通過抑制eNOS和nNOS發(fā)揮作用，與iNOS無關(guān)。接著我們觀察3種NOS抑制劑對DXM抗抑郁作用的影響，結(jié)果表明，eNOS抑制劑L-NAME[23]和nNOS抑制劑7-NI[23]均能夠促進(jìn)DXM的抗抑郁作用，而iNOS抑制劑AG[15]對DXM的抗抑郁作用無影響。與7-NI能夠促進(jìn)抗抑郁藥物的藥效相吻合，給予7-NI能夠強(qiáng)化丙咪嗪[25]以及氟西汀[25]的抗抑郁效果。

西地那非能夠增加cGMP水平[26]，為了觀察cGMP對DXM抗抑郁作用的影響，我們還使用了西地那非，結(jié)果顯示，西地那非能夠阻斷DXM的抗抑郁作用，表明DXM的抗抑郁作用依賴于低水平的cGMP。cGMP受sGC及PDE5的調(diào)控[26]，PDE5能夠促進(jìn)cGMP轉(zhuǎn)換為GMP。

盡管DXM具有抗抑郁的作用，但是一次性給予大劑量(120 mg或2 mg/kg)的DXM會產(chǎn)生致幻效果[27]，如何合理的應(yīng)用于臨床治療抑郁將成為我們進(jìn)一步的研究重點?，F(xiàn)階段的研究成果僅能說明DXM具有抗抑郁的作用，并且NMDA受體及L-精氨酸-NO-cGMP信號通路參與這一過程。

[參 考 文 獻(xiàn)]

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