王新榮， 張印坡， 張延新

(1鄭州市婦幼保健院婦產(chǎn)科， 河南 鄭州 450012； 2漯河醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校病理學(xué)教研室， 河南 漯河 462002)

卵巢癌是常見的婦科惡性腫瘤之一，其發(fā)病率僅位于宮頸癌之后居第2位，然而其病死率卻位居首位，預(yù)計2017年美國卵巢癌的發(fā)病人數(shù)和死亡人數(shù)將分別達到22 440例和14 080例[1]。由于卵巢癌早期癥狀隱匿，缺乏有效敏感的診斷方法，大多數(shù)卵巢癌患者初次診斷時已發(fā)展到了III～IV期，5年生存率僅為30%[2]。盡管大部分卵巢癌患者對以鉑類為基礎(chǔ)的初始化療有效，但通常會在18個月內(nèi)復(fù)發(fā)，且二線化療的有效率僅為10%～20%[3]。于是從天然植物化學(xué)成分中尋找安全有效的新型抗腫瘤藥物成為研究的熱點。青藤堿(sinomenine)是從中藥青風(fēng)藤中提取出的一種生物堿單體，具有抗炎、降壓、鎮(zhèn)痛和鎮(zhèn)咳等藥理作用。近年來研究發(fā)現(xiàn)，青藤堿可抑制多種惡性腫瘤增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移，如乳腺癌[4]、肺癌[5]和骨肉瘤[6]等。然而目前尚無青藤堿影響人卵巢癌細胞增殖和侵襲的相關(guān)報道。為此我們觀察了青藤堿對人卵巢癌SKOV3細胞增殖和侵襲的影響并探究及其分子機制。

材 料 和 方 法

1 材料

人卵巢癌SKOV3細胞購自中國科學(xué)院細胞庫；人正常卵巢上皮IOSE80細胞購自上海拜力生物科技有限公司。青藤堿(批號110774-200507，純度≥99.5%)購自中國藥品生物制品檢定所；胎牛血清和RPMI-1640培養(yǎng)基購自Hyclone；CCK-8試劑盒、碘化丙啶(propidium iodide,PI)染色液、結(jié)晶紫染色液、RIPA裂解液和ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒購自碧云天生物技術(shù)有限公司；Matrigel和Transwell小室購自Corning；小鼠抗人細胞周期蛋白(cyclin)A、cyclin D1、E-cadherin、基質(zhì)金屬蛋白酶9(matrix metalloproteinase-9,MMP-9)和β-actin單克隆抗體及辣根過氧化物酶標記山羊抗小鼠IgG購自Santa Cruz。

2 方法

2.1細胞培養(yǎng) 人卵巢癌SKOV3細胞和人正常卵巢上皮細胞IOSE80采用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液中，在37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)。當細胞融合度達到90%時，以0.25 %的胰蛋白酶消化，按1∶3的比例傳代。

2.2青藤堿工作液的配制 將青藤堿溶于無血清RPMI-1640培養(yǎng)基中，配制成濃度為50 mmol/L的貯存液，避光，4 ℃保存?zhèn)溆?。使用時用細胞培養(yǎng)液將其分別稀釋至0.25、0.5、1、2和4 mmol/L。對照(control)組使用無藥的細胞培養(yǎng)液。

2.3CCK-8法檢測細胞活力 取對數(shù)生長期SKOV3細胞和IOSE80細胞，以每孔5 000個接種于96孔板，在37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)24 h。2組細胞分別經(jīng)不同濃度青藤堿(0.25、0.5、1、2和4 mmol/L)處理48 h或經(jīng)2 mmol/L青藤堿處理12、24和48 h后，每孔加入10 μL CCK-8溶液，37 ℃培養(yǎng)1 h，用酶標儀檢測各孔450 nm波長處的吸光度(A)值。每組設(shè)5個復(fù)孔，同時設(shè)調(diào)零孔和對照孔。細胞活力(%)=加藥孔A值/對照孔A值×100%。同時使用SPSS 16.0軟件Probit回歸模型計算半數(shù)抑制濃度(half maximal inhibitory concentration，IC50)。

2.4流式細胞術(shù)檢測細胞周期 SKOV3細胞經(jīng)不同濃度青藤堿(0、0.25、0.5和1 mmol/L)處理48 h后，PBS洗滌2次，加入1 mL 70%冰乙醇于4 ℃固定24 h，PBS洗滌2次，加入PI染色液，4 ℃避光染色30 min，送流式細胞儀檢測。

2.5Transwell細胞遷移實驗 將Transwell小室置于24孔板中，向小室下方的24孔板中加入600 μL細胞培養(yǎng)液，向小室內(nèi)加入200 μL事先配制好的細胞懸液。細胞懸液用含有不同濃度(0、0.25、0.5和1 mmol/L)青藤堿的無血清RPMI-1640培養(yǎng)液制備，濃度為2×108/L。每個濃度設(shè)3復(fù)孔，在常規(guī)條件下培養(yǎng)12 h。取出小室，用棉簽擦去小室內(nèi)的細胞，PBS洗滌2次，甲醛固定30 min，結(jié)晶紫染色20 min，PBS 洗滌2次。顯微鏡下觀察小室下表面附著的遷移細胞，隨機挑選5個視野拍照計數(shù)，取其平均值。遷移率 (migration rate，MR; %)=藥物組遷移細胞數(shù)/無藥組遷移細胞數(shù)×100%。

2.6Transwell細胞侵襲實驗 方法與Transwell遷移實驗基本相同，只是需要提前將Matrigel與RPMI-1640培養(yǎng)基按1∶6稀釋，取50 μL均勻鋪到Transwell小室的底部，然后將Transwell小室放入24孔板中，于37 ℃孵育過夜使其成凝膠狀。此時在小室下表面觀察到的為侵襲細胞。侵襲率(invasion rate，IR; %)=藥物組侵襲細胞數(shù)/無藥組侵襲細胞數(shù)×100%。

2.7Western blot法檢測蛋白水平 用RIPA裂解細胞提取總蛋白，用紫外分光光度法測定蛋白質(zhì)濃度，取25 μg蛋白樣品進行SDS-PAGE并轉(zhuǎn)移至PVDF膜，用封閉液(5% BSA/TBST)封閉1 h，加入抗cyclin A、cyclin D1、CDK2、E-cadherin、MMP-9和β-actin等I抗(1∶200稀釋)，4 ℃孵育過夜，TBST洗膜3次，加入II抗(1∶100稀釋)室溫下孵育1 h，TBST洗膜3次，加入ECL進行發(fā)光反應(yīng)，暗室X膠片顯影，拍照，使用ImageJ 1.45s軟件進行灰度分析。

3 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 16.0分析數(shù)據(jù)。實驗數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差(mean±SD)表示，多組間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，并用Bonferroni校正的t檢驗進行組間兩兩比較。以P<0.05為差別有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 青藤堿對SKOV3和IOSE80細胞活力的影響

CCK-8檢測結(jié)果顯示，隨著青藤堿作用濃度和作用時間的增加，SKOV3細胞活力逐漸降低(P<0.05)，青藤堿作用SKOV3細胞48 h的IC50為2.12 mmol/L；與此同時，雖然人正常卵巢上皮IOSE80細胞活力也有所下降(P<0.05)，但青藤堿作用SKOV3細胞48 h的IC50高達17.35 mmol/L。這表明與IOSE80細胞相比，青藤堿對卵巢癌SKOV3細胞活力具有較強的抑制作用，且呈劑量和時間依賴性，見圖1、2。

Figure 1. The effect of sinomenine at different concentrations for 48 h on the viability of SKOV3 and IOSE80 cells. Mean±SD.n=5.*P<0.05vs0 mmol/L group;#P<0.05vs0.5 mmol/L group;△P<0.05vs1 mmol/L group;▲P<0.05vs2 mmol/L group.

圖1不同濃度青藤堿對SKOV3和IOSE80細胞活力的影響

Figure 2. The effect of 2 mmol/L sinomenine for different time on the viability of SKOV3 and IOSE80 cells. Mean±SD.n=5.*P<0.05vs0 h group;#P<0.05vs12 h group;△P<0.05vs24 h group.

圖2青藤堿作用不同時間對SKOV3和IOSE80細胞活力的影響

2 青藤堿對SKOV3細胞周期分布的影響

流式細胞術(shù)檢測結(jié)果顯示，分別經(jīng)0.25、0.5和1 mmol/L青藤堿處理48 h后，G0/G1期和S期的細胞比例逐漸升高(P<0.05)，G2/M期的細胞比例逐漸下降(P<0.05)。這表明青藤堿可劑量依賴地誘導(dǎo)SKOV3細胞發(fā)生G0/G1期和S期阻滯，見圖3。

3 青藤堿對SKOV3細胞遷移和侵襲的影響

Transwell實驗結(jié)果顯示，經(jīng)0.25、0.5和1 mmol/L青藤堿處理12 h后，SKOV3細胞的遷移率和侵襲率均逐漸降低(P<0.05),這表明青藤堿可抑制SKOV3細胞遷移和侵襲，且呈劑量依賴性,見圖4、5。

Figure 3. The effect of sinomenine on the cell cycle distribution of SKOV3 cells. Mean±SD.n=5.*P<0.05vs0 mmol/L group;#P<0.05vs0.25 mmol/L group;△P<0.05vs0.50 mmol/L group.

圖3青藤堿對SKOV3細胞周期的影響

4 青藤堿對cyclin A、cyclin D1、E-cadherin和MMP-9蛋白水平的影響

Western blot實驗的結(jié)果顯示，經(jīng)0.25、0.5和1 mmol/L青藤堿處理24 h后，SKOV3細胞中的cyclin A、cyclin D1和MMP-9蛋白水平顯著降低(P<0.05)，E-cadherin蛋白水平顯著升高(P<0.05)，且呈劑量依賴性,見圖6、7。

Figure 4. Sinomenine inhibited the migration ability of SKOV3 cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vs0 mmol/L group;#P<0.05vs0.25 mmol/L group;△P<0.05vs0.5 mmol/L group.

圖4青藤堿抑制SKOV3細胞遷移

Figure 5. Sinomenine inhibited invasion ability of SKOV3 cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vs0 mmol/L group;#P<0.05vs0.25 mmol/L group;△P<0.05vs0.5 mmol/L group.

圖5青藤堿抑制SKOV3細胞侵襲

Figure 6. The effect of sinomenine on the protein levels of cyclin A and cyclin D1 in the SKOV3 cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vs0 mmol/L group;#P<0.05vs0.25 mmol/L group;△P<0.05vs0.5 mmol/L group.

圖6青藤堿對cyclinA和cyclinD1蛋白水平的影響

Figure 7. The effect of sinomenine on the protein levels of E-cadherin and MMP-9 in the SKOV3 cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vs0 mmol/L group;#P<0.05vs0.25 mmol/L group;△P<0.05vs0.5 mmol/L group.

圖7青藤堿對E-cadherin和MMP-9蛋白水平的影響

討 論

一直以來，青藤堿因具有抗炎、抗風(fēng)濕和免疫抑制等作用在臨床上用于治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等自身免疫性疾病[7-8]。近年來，青藤堿的抗腫瘤作用日益受到人們的關(guān)注。Li等[9]研究發(fā)現(xiàn)，青藤堿可誘導(dǎo)乳腺癌細胞凋亡并抑制其增殖。青藤堿與化療藥物聯(lián)用還可逆轉(zhuǎn)多種腫瘤細胞耐藥性[10-12]。此外，青藤堿還可抑制腫瘤細胞遷移和侵襲[4-6]。然而青藤堿對卵巢癌是否也具有抑制作用目前上不明確。在本研中，我們采用CCK-8法檢測了青藤堿對SKOV3和IOSE80細胞活力的影響，結(jié)果顯示青藤堿作用SKOV3和IOSE80細胞48 h 的IC50分別為2.12 mmol/L和17.35 mmol/L，這表明青藤堿對人正常卵巢上皮IOSE80細胞的毒性作用較弱，但對人卵巢癌SKOV3細胞具有較強的毒性作用，具有潛在的臨床應(yīng)用價值。

Xie等[6]研究發(fā)現(xiàn)，青藤堿可通過上調(diào)Chk2蛋白磷酸化水平和p21蛋白表達水平，下調(diào)cyclin A和CDK2蛋白表達水平，導(dǎo)致骨肉瘤細胞發(fā)生S期和G2/M期阻滯，從而抑制肉瘤細胞增殖。Li等[9]研究表明，青藤堿可下調(diào)cyclin D1、cyclin E和CDK4蛋白表達以及上調(diào)p21和p27蛋白表達，使乳腺癌細胞阻滯于G0/G1期。在本研究中我們也發(fā)現(xiàn)，青藤堿可劑量依賴地誘導(dǎo)SKOV3細胞發(fā)生G0/G1期和S期阻滯。

為探究青藤堿引起SKOV3細胞發(fā)生G0/G1期和S期阻滯的分子機制，我們觀察了青藤堿對G0/G1和S期的特征性cyclin蛋白表達水平的影響。本研究結(jié)果顯示，青藤堿可劑量依賴地下調(diào)cyclin D1和cyclin A的蛋白水平。Cyclin D1可激活CDK4和CDK6，促使細胞完成G1/S期轉(zhuǎn)換[13]。Cyclin D1表達減少會導(dǎo)致SKOV3細胞發(fā)生G0/G1期阻滯[14]。進入S期后，cyclin A先與CDK2結(jié)合，參與DNA復(fù)制的進行，在S期晚期，cyclin A與CDK1結(jié)合，使細胞進入G2期[15]。本研究結(jié)果表明，青藤堿可能通過抑制cyclin D1和cyclin A蛋白表達，使CDK4、CDK6和CDK2活化受阻，從而導(dǎo)致SKOV3細胞發(fā)生G0/G1期和S期阻滯。

上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)在卵巢癌細胞的遷移和侵襲過程中發(fā)揮著重要作用[16]。EMT是指細胞通過去分化由多邊形上皮樣形態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)樗笮伍g葉性細胞形態(tài)，從而更具運動能力的過程。E-cadherin蛋白表達減少是癌細胞發(fā)生EMT的一個主要特征，E-cadherin是一種鈣依賴性的細胞黏附分子，在維持癌細胞上皮樣形態(tài)中扮演著重要角色[17]。已有研究證實，下調(diào)E-cadhe-rin蛋白表達可促進卵巢癌SKOV3細胞遷移和侵襲[18]。發(fā)生EMT的卵巢癌SKOV細胞還可分泌基質(zhì)金屬蛋白酶，降解細胞外基質(zhì)，進而向周邊侵襲[19]。在本研究中我們發(fā)現(xiàn)青藤堿可劑量依賴地抑制SKOV3細胞遷移和侵襲，這可能與青藤堿上調(diào)E-cadherin蛋白水平和下調(diào)MMP-9蛋白水平有關(guān)。

綜上所述，青藤堿可在體外抑制人卵巢癌SKOV3細胞的活力、遷移和侵襲，這可能與青藤堿下調(diào)cyclin D1、cyclin A和MMP-9蛋白水平，以及上調(diào)E-cadherin蛋白水平有關(guān)，具體的分子機制還有待進一步闡明。

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