王新榮， 張印坡， 張延新

(1鄭州市婦幼保健院婦產科， 河南 鄭州 450012； 2漯河醫(yī)學高等專科學校病理學教研室， 河南 漯河 462002)

卵巢癌是常見的婦科惡性腫瘤之一，其發(fā)病率僅位于宮頸癌之后居第2位，然而其病死率卻位居首位，預計2017年美國卵巢癌的發(fā)病人數(shù)和死亡人數(shù)將分別達到22 440例和14 080例[1]。由于卵巢癌早期癥狀隱匿，缺乏有效敏感的診斷方法，大多數(shù)卵巢癌患者初次診斷時已發(fā)展到了III～IV期，5年生存率僅為30%[2]。盡管大部分卵巢癌患者對以鉑類為基礎的初始化療有效，但通常會在18個月內復發(fā)，且二線化療的有效率僅為10%～20%[3]。于是從天然植物化學成分中尋找安全有效的新型抗腫瘤藥物成為研究的熱點。青藤堿(sinomenine)是從中藥青風藤中提取出的一種生物堿單體，具有抗炎、降壓、鎮(zhèn)痛和鎮(zhèn)咳等藥理作用。近年來研究發(fā)現(xiàn)，青藤堿可抑制多種惡性腫瘤增殖、侵襲和轉移，如乳腺癌[4]、肺癌[5]和骨肉瘤[6]等。然而目前尚無青藤堿影響人卵巢癌細胞增殖和侵襲的相關報道。為此我們觀察了青藤堿對人卵巢癌SKOV3細胞增殖和侵襲的影響并探究及其分子機制。

材 料 和 方 法

1 材料

人卵巢癌SKOV3細胞購自中國科學院細胞庫；人正常卵巢上皮IOSE80細胞購自上海拜力生物科技有限公司。青藤堿(批號110774-200507，純度≥99.5%)購自中國藥品生物制品檢定所；胎牛血清和RPMI-1640培養(yǎng)基購自Hyclone；CCK-8試劑盒、碘化丙啶(propidium iodide,PI)染色液、結晶紫染色液、RIPA裂解液和ECL化學發(fā)光試劑盒購自碧云天生物技術有限公司；Matrigel和Transwell小室購自Corning；小鼠抗人細胞周期蛋白(cyclin)A、cyclin D1、E-cadherin、基質金屬蛋白酶9(matrix metalloproteinase-9,MMP-9)和β-actin單克隆抗體及辣根過氧化物酶標記山羊抗小鼠IgG購自Santa Cruz。

2 方法

2.1細胞培養(yǎng) 人卵巢癌SKOV3細胞和人正常卵巢上皮細胞IOSE80采用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液中，在37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)。當細胞融合度達到90%時，以0.25 %的胰蛋白酶消化，按1∶3的比例傳代。

2.2青藤堿工作液的配制 將青藤堿溶于無血清RPMI-1640培養(yǎng)基中，配制成濃度為50 mmol/L的貯存液，避光，4 ℃保存?zhèn)溆谩Ｊ褂脮r用細胞培養(yǎng)液將其分別稀釋至0.25、0.5、1、2和4 mmol/L。對照(control)組使用無藥的細胞培養(yǎng)液。

2.3CCK-8法檢測細胞活力 取對數(shù)生長期SKOV3細胞和IOSE80細胞，以每孔5 000個接種于96孔板，在37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)24 h。2組細胞分別經不同濃度青藤堿(0.25、0.5、1、2和4 mmol/L)處理48 h或經2 mmol/L青藤堿處理12、24和48 h后，每孔加入10 μL CCK-8溶液，37 ℃培養(yǎng)1 h，用酶標儀檢測各孔450 nm波長處的吸光度(A)值。每組設5個復孔，同時設調零孔和對照孔。細胞活力(%)=加藥孔A值/對照孔A值×100%。同時使用SPSS 16.0軟件Probit回歸模型計算半數(shù)抑制濃度(half maximal inhibitory concentration，IC50)。

2.4流式細胞術檢測細胞周期 SKOV3細胞經不同濃度青藤堿(0、0.25、0.5和1 mmol/L)處理48 h后，PBS洗滌2次，加入1 mL 70%冰乙醇于4 ℃固定24 h，PBS洗滌2次，加入PI染色液，4 ℃避光染色30 min，送流式細胞儀檢測。

2.5Transwell細胞遷移實驗 將Transwell小室置于24孔板中，向小室下方的24孔板中加入600 μL細胞培養(yǎng)液，向小室內加入200 μL事先配制好的細胞懸液。細胞懸液用含有不同濃度(0、0.25、0.5和1 mmol/L)青藤堿的無血清RPMI-1640培養(yǎng)液制備，濃度為2×108/L。每個濃度設3復孔，在常規(guī)條件下培養(yǎng)12 h。取出小室，用棉簽擦去小室內的細胞，PBS洗滌2次，甲醛固定30 min，結晶紫染色20 min，PBS 洗滌2次。顯微鏡下觀察小室下表面附著的遷移細胞，隨機挑選5個視野拍照計數(shù)，取其平均值。遷移率 (migration rate，MR; %)=藥物組遷移細胞數(shù)/無藥組遷移細胞數(shù)×100%。

2.6Transwell細胞侵襲實驗 方法與Transwell遷移實驗基本相同，只是需要提前將Matrigel與RPMI-1640培養(yǎng)基按1∶6稀釋，取50 μL均勻鋪到Transwell小室的底部，然后將Transwell小室放入24孔板中，于37 ℃孵育過夜使其成凝膠狀。此時在小室下表面觀察到的為侵襲細胞。侵襲率(invasion rate，IR; %)=藥物組侵襲細胞數(shù)/無藥組侵襲細胞數(shù)×100%。

2.7Western blot法檢測蛋白水平 用RIPA裂解細胞提取總蛋白，用紫外分光光度法測定蛋白質濃度，取25 μg蛋白樣品進行SDS-PAGE并轉移至PVDF膜，用封閉液(5% BSA/TBST)封閉1 h，加入抗cyclin A、cyclin D1、CDK2、E-cadherin、MMP-9和β-actin等I抗(1∶200稀釋)，4 ℃孵育過夜，TBST洗膜3次，加入II抗(1∶100稀釋)室溫下孵育1 h，TBST洗膜3次，加入ECL進行發(fā)光反應，暗室X膠片顯影，拍照，使用ImageJ 1.45s軟件進行灰度分析。

3 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 16.0分析數(shù)據(jù)。實驗數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差(mean±SD)表示，多組間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，并用Bonferroni校正的t檢驗進行組間兩兩比較。以P<0.05為差別有統(tǒng)計學意義。

結 果

1 青藤堿對SKOV3和IOSE80細胞活力的影響

CCK-8檢測結果顯示，隨著青藤堿作用濃度和作用時間的增加，SKOV3細胞活力逐漸降低(P<0.05)，青藤堿作用SKOV3細胞48 h的IC50為2.12 mmol/L；與此同時，雖然人正常卵巢上皮IOSE80細胞活力也有所下降(P<0.05)，但青藤堿作用SKOV3細胞48 h的IC50高達17.35 mmol/L。這表明與IOSE80細胞相比，青藤堿對卵巢癌SKOV3細胞活力具有較強的抑制作用，且呈劑量和時間依賴性，見圖1、2。

Figure 1. The effect of sinomenine at different concentrations for 48 h on the viability of SKOV3 and IOSE80 cells. Mean±SD.n=5.*P<0.05vs0 mmol/L group;#P<0.05vs0.5 mmol/L group;△P<0.05vs1 mmol/L group;▲P<0.05vs2 mmol/L group.

圖1不同濃度青藤堿對SKOV3和IOSE80細胞活力的影響

Figure 2. The effect of 2 mmol/L sinomenine for different time on the viability of SKOV3 and IOSE80 cells. Mean±SD.n=5.*P<0.05vs0 h group;#P<0.05vs12 h group;△P<0.05vs24 h group.

圖2青藤堿作用不同時間對SKOV3和IOSE80細胞活力的影響

2 青藤堿對SKOV3細胞周期分布的影響

流式細胞術檢測結果顯示，分別經0.25、0.5和1 mmol/L青藤堿處理48 h后，G0/G1期和S期的細胞比例逐漸升高(P<0.05)，G2/M期的細胞比例逐漸下降(P<0.05)。這表明青藤堿可劑量依賴地誘導SKOV3細胞發(fā)生G0/G1期和S期阻滯，見圖3。

3 青藤堿對SKOV3細胞遷移和侵襲的影響

Transwell實驗結果顯示，經0.25、0.5和1 mmol/L青藤堿處理12 h后，SKOV3細胞的遷移率和侵襲率均逐漸降低(P<0.05),這表明青藤堿可抑制SKOV3細胞遷移和侵襲，且呈劑量依賴性,見圖4、5。

Figure 3. The effect of sinomenine on the cell cycle distribution of SKOV3 cells. Mean±SD.n=5.*P<0.05vs0 mmol/L group;#P<0.05vs0.25 mmol/L group;△P<0.05vs0.50 mmol/L group.

圖3青藤堿對SKOV3細胞周期的影響

4 青藤堿對cyclin A、cyclin D1、E-cadherin和MMP-9蛋白水平的影響

Western blot實驗的結果顯示，經0.25、0.5和1 mmol/L青藤堿處理24 h后，SKOV3細胞中的cyclin A、cyclin D1和MMP-9蛋白水平顯著降低(P<0.05)，E-cadherin蛋白水平顯著升高(P<0.05)，且呈劑量依賴性,見圖6、7。

Figure 4. Sinomenine inhibited the migration ability of SKOV3 cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vs0 mmol/L group;#P<0.05vs0.25 mmol/L group;△P<0.05vs0.5 mmol/L group.

圖4青藤堿抑制SKOV3細胞遷移

Figure 5. Sinomenine inhibited invasion ability of SKOV3 cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vs0 mmol/L group;#P<0.05vs0.25 mmol/L group;△P<0.05vs0.5 mmol/L group.

圖5青藤堿抑制SKOV3細胞侵襲

Figure 6. The effect of sinomenine on the protein levels of cyclin A and cyclin D1 in the SKOV3 cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vs0 mmol/L group;#P<0.05vs0.25 mmol/L group;△P<0.05vs0.5 mmol/L group.

圖6青藤堿對cyclinA和cyclinD1蛋白水平的影響

Figure 7. The effect of sinomenine on the protein levels of E-cadherin and MMP-9 in the SKOV3 cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vs0 mmol/L group;#P<0.05vs0.25 mmol/L group;△P<0.05vs0.5 mmol/L group.

圖7青藤堿對E-cadherin和MMP-9蛋白水平的影響

討 論

一直以來，青藤堿因具有抗炎、抗風濕和免疫抑制等作用在臨床上用于治療類風濕性關節(jié)炎等自身免疫性疾病[7-8]。近年來，青藤堿的抗腫瘤作用日益受到人們的關注。Li等[9]研究發(fā)現(xiàn)，青藤堿可誘導乳腺癌細胞凋亡并抑制其增殖。青藤堿與化療藥物聯(lián)用還可逆轉多種腫瘤細胞耐藥性[10-12]。此外，青藤堿還可抑制腫瘤細胞遷移和侵襲[4-6]。然而青藤堿對卵巢癌是否也具有抑制作用目前上不明確。在本研中，我們采用CCK-8法檢測了青藤堿對SKOV3和IOSE80細胞活力的影響，結果顯示青藤堿作用SKOV3和IOSE80細胞48 h 的IC50分別為2.12 mmol/L和17.35 mmol/L，這表明青藤堿對人正常卵巢上皮IOSE80細胞的毒性作用較弱，但對人卵巢癌SKOV3細胞具有較強的毒性作用，具有潛在的臨床應用價值。

Xie等[6]研究發(fā)現(xiàn)，青藤堿可通過上調Chk2蛋白磷酸化水平和p21蛋白表達水平，下調cyclin A和CDK2蛋白表達水平，導致骨肉瘤細胞發(fā)生S期和G2/M期阻滯，從而抑制肉瘤細胞增殖。Li等[9]研究表明，青藤堿可下調cyclin D1、cyclin E和CDK4蛋白表達以及上調p21和p27蛋白表達，使乳腺癌細胞阻滯于G0/G1期。在本研究中我們也發(fā)現(xiàn)，青藤堿可劑量依賴地誘導SKOV3細胞發(fā)生G0/G1期和S期阻滯。

為探究青藤堿引起SKOV3細胞發(fā)生G0/G1期和S期阻滯的分子機制，我們觀察了青藤堿對G0/G1和S期的特征性cyclin蛋白表達水平的影響。本研究結果顯示，青藤堿可劑量依賴地下調cyclin D1和cyclin A的蛋白水平。Cyclin D1可激活CDK4和CDK6，促使細胞完成G1/S期轉換[13]。Cyclin D1表達減少會導致SKOV3細胞發(fā)生G0/G1期阻滯[14]。進入S期后，cyclin A先與CDK2結合，參與DNA復制的進行，在S期晚期，cyclin A與CDK1結合，使細胞進入G2期[15]。本研究結果表明，青藤堿可能通過抑制cyclin D1和cyclin A蛋白表達，使CDK4、CDK6和CDK2活化受阻，從而導致SKOV3細胞發(fā)生G0/G1期和S期阻滯。

上皮-間充質轉化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)在卵巢癌細胞的遷移和侵襲過程中發(fā)揮著重要作用[16]。EMT是指細胞通過去分化由多邊形上皮樣形態(tài)轉變?yōu)樗笮伍g葉性細胞形態(tài)，從而更具運動能力的過程。E-cadherin蛋白表達減少是癌細胞發(fā)生EMT的一個主要特征，E-cadherin是一種鈣依賴性的細胞黏附分子，在維持癌細胞上皮樣形態(tài)中扮演著重要角色[17]。已有研究證實，下調E-cadhe-rin蛋白表達可促進卵巢癌SKOV3細胞遷移和侵襲[18]。發(fā)生EMT的卵巢癌SKOV細胞還可分泌基質金屬蛋白酶，降解細胞外基質，進而向周邊侵襲[19]。在本研究中我們發(fā)現(xiàn)青藤堿可劑量依賴地抑制SKOV3細胞遷移和侵襲，這可能與青藤堿上調E-cadherin蛋白水平和下調MMP-9蛋白水平有關。

綜上所述，青藤堿可在體外抑制人卵巢癌SKOV3細胞的活力、遷移和侵襲，這可能與青藤堿下調cyclin D1、cyclin A和MMP-9蛋白水平，以及上調E-cadherin蛋白水平有關，具體的分子機制還有待進一步闡明。

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