李 婷 朱建福 毛瑛玉 林茂華 林妙春 沈麗蕊

（1 福建醫(yī)科大學(xué)附屬閩東醫(yī)院病理科，寧德 福安 350000；2 福建醫(yī)科大學(xué)附屬閩東醫(yī)院骨科，寧德 福安 350000；3 福建醫(yī)科大學(xué)附屬閩東醫(yī)院中心實驗室，寧德 福安 350000）

宮頸癌占女性全身腫瘤的5%～6%，發(fā)病率呈上升趨勢[1]。近年來，因高危型人乳頭瘤病毒檢測、薄層液基細(xì)胞學(xué)（TCT）、疫苗的應(yīng)用，宮頸癌早期檢出率明顯上升[2]。宮頸癌的發(fā)生的分子機(jī)制并不完全清楚，Toll樣受體（Toll-like receptor，TLR）4在宮頸癌的發(fā)生中起著重要作用，與正常組織相比，TLR4在宮頸癌中的表達(dá)明顯增高。髓樣分化蛋白88（MyD88）依賴性途徑是TLRs主要的細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，可能參與了宮頸癌的發(fā)展[3]。本文進(jìn)一步研究Tollip介導(dǎo)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)在宮頸癌發(fā)生發(fā)展中的作用，并探討其調(diào)控機(jī)制，為臨床防治宮頸癌提供新的思路和靶點。

1 材料與方法

1.1 材料：實驗標(biāo)本來自于2012年～2014年在本院接受手術(shù)治療的宮頸上皮內(nèi)瘤變及宮頸癌的患者的切片及蠟塊。共收集正常宮頸組織、CIN1、CIN2、CIN3及宮頸浸潤癌癌組織各80例。納入標(biāo)準(zhǔn)：①術(shù)前未行放療或化療，已行HPV檢測，術(shù)后診斷經(jīng)病理學(xué)檢查證實；②臨床資料完整；③新鮮組織取自子宮全切除術(shù)及宮頸癌根治標(biāo)本。

1.2 儀器與試劑

1.3 方法

1.3.1 實驗一：①收集并統(tǒng)計各組HPV感染情況；②宮頸鱗狀上皮凋亡的檢測：a.用Tunel技術(shù)原位檢測細(xì)胞凋亡；b.用免疫組織化學(xué)的方法，以cleaved Caspase-3抗體檢測細(xì)胞的凋亡。③宮頸癌相關(guān)基因Cyclin D1、c-Myc、p53表達(dá)情況：各組織切片后，采用免疫組織化學(xué)的方法，檢測Cyclin D1、c-Myc、p53在各組中的表達(dá)情況。④MyD88、TLR4、Tollip的表達(dá)情況：①組織切片后，采用免疫組化方法檢測MyD88、TLR4、Tollip蛋白的表達(dá)情況。②采用RT-PCR的方法檢測MyD88、TLR4、Tollip的mRNA的表達(dá)。

1.3.2 實驗二：①實驗分組：正常鱗狀上皮組，Siha組，Siha+Tollip質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組，Siha+空質(zhì)粒對照組。Tollip的細(xì)胞轉(zhuǎn)染行預(yù)實驗選取最佳的濃度及時間，熒光顯微鏡觀察細(xì)胞轉(zhuǎn)染率，以選取最佳的轉(zhuǎn)染條件。②各組細(xì)胞處理后，提取其總RNA，用實時定量RT-PCR檢測轉(zhuǎn)染Tollip質(zhì)粒后的Tollip mRNA表達(dá)情況；用免疫熒光觀察Tollip的蛋白表達(dá)情況，以確定我們對MyD88信號通路干預(yù)手段切實有效。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理：采用Image Pro Plus統(tǒng)計軟件6.0進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)計算，陽性標(biāo)記細(xì)胞百分率表達(dá)水平服從正態(tài)分布采用（Mean±SD）符號（±s）表示，比較采用t檢驗或配對t檢驗，相關(guān)性分析Spareman相關(guān)性分析，以P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 實驗一：正常宮頸組織、CIN1、CIN2、CIN3及宮頸浸潤癌癌組織Cyclin D1、c-myc、p53、TLR4、MyD88、NF-kappaB、Tollip表達(dá)率以及宮頸鱗狀上皮凋亡率、HPV感染率差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。分別將TLR4、MyD88、NF-kappaB、Tollip與Cyclin D1、c-myc、p53、bcl-2、宮頸鱗狀上皮凋亡、HPV感染進(jìn)行相關(guān)分析，結(jié)果顯示TLR4、MyD88與宮頸鱗狀上皮凋亡（r=0.484、0.427）、HPV感染（r=0.671、0.405）、P53（r=0.487、0.581）存在相關(guān)性（P＜0.05）。見表1。

2.2 實驗二：Tollip的細(xì)胞轉(zhuǎn)染行預(yù)實驗選取最佳的濃度為細(xì)胞匯合度60%左右，時間5 h。正常鱗狀上皮組、Siha組、Siha+Tollip質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組、Siha+空質(zhì)粒對照組的細(xì)胞增殖、培養(yǎng)第3代貼壁生長比重差異顯著。見表2。

3 討 論

本次研究顯示，Tollip在宮頸癌發(fā)生過程中可能通過過表達(dá)抑制TLR4、MyD88、NF-KB表達(dá)，上調(diào)P53發(fā)揮抗癌作用。TLR4、MyD88與宮頸鱗狀上皮凋亡（r=0.484、0.427）存在相關(guān)性（P＜0.05），提示通路上相關(guān)蛋白的表達(dá)可能與宮頸鱗狀上皮凋亡有關(guān)。Tollip的細(xì)胞轉(zhuǎn)染后，細(xì)胞增殖、遷移明顯減弱，提示Tollip可能T通過抑制相關(guān)通路的作用，從而影響宮頸癌發(fā)生、進(jìn)展。下調(diào)Tollip表達(dá)可能會影響宮頸上皮細(xì)胞內(nèi)與凋亡相關(guān)基因因子下調(diào)，從而抑制細(xì)胞的凋亡，不利于腫瘤細(xì)胞的清除。有報道顯示，TLR4/MyD88/NF-KB通路在宮頸病變中發(fā)揮重要作用，起到輔助侵襲、促進(jìn)增生、血管形成等作用[4]。女性生殖系統(tǒng)解剖特點是其容易受到感染的侵襲，感染、致炎性因子長期慢性刺激會導(dǎo)致TLR4介導(dǎo)TLR4/MyD88/NF-KB通路作用活化，導(dǎo)致NK-KB活化，從而致細(xì)胞因子的產(chǎn)生，介導(dǎo)細(xì)胞凋亡抑制，導(dǎo)致上皮內(nèi)瘤變及宮頸腫瘤發(fā)生進(jìn)展。

表1 不同宮頸病理組織相關(guān)表達(dá)、HPR感染、上皮凋亡情況對比（±s）

表1 不同宮頸病理組織相關(guān)表達(dá)、HPR感染、上皮凋亡情況對比（±s）

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參考文獻(xiàn)

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[3] 李婷,朱建福,毛瑛玉,等.髓樣分化因子88在子宮頸鱗癌組織中的表達(dá)及臨床意義[J].臨床和實驗醫(yī)學(xué)雜志,2017,16(4):339-343.

[4] 吳燕燕,王易.Toll樣受體信號通路中MyD88的研究進(jìn)展[J].免疫學(xué)雜志,2012,28(3):262-265.